一种结合Dsg3的单克隆抗体及其应用

一种结合dsg3的单克隆抗体及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种结合dsg3的单克隆抗体及其应用。


背景技术：

2.天疱疮是一种自身免疫性疾病，其具有寻常型、增殖型、落叶型和红斑型这四种亚型。寻常型天疱疮(pemphigus vulgaris，pv)是一种主要累及皮肤和黏膜的大疱性皮肤病，pv在临床上较为常见。患者血清循环中存在针对角质形成细胞间蛋白结构的自身抗体，破坏细胞间黏附功能，从而出现以表皮内水疱为主的临床表现。约60％的pv患者会出现口腔黏膜的水疱、大疱，且自发破溃，糜烂面难以愈合，严重影响患者进食及日常生活，给患者身心带来极大痛苦。此外，一部分的患者仅表现为持续性的口腔黏膜糜烂而无任何皮肤损伤。因此，需要快速、准确诊断pv的有效检测手段。
3.pv的早期诊断对治疗和预后具有极其重要的作用，pv的诊断包括临床表现、组织病理和免疫诊断指标。临床表现：
①
皮肤出现松弛性水疱和大疱，易破溃；
②
水疱和大疱破溃后形成顽固性糜烂；
③
黏膜出现水疱或糜烂；
④
尼氏征阳性。组织病理：表皮或上皮细胞间棘层松解，形成水疱和大疱。免疫诊断指标：
①
皮损区域或皮损周围正常皮肤直接免疫荧光(dif)示igg和/或补体沉积于表皮(或上皮)细胞间；
②
间接免疫荧光(iif)检测到血清中出现抗表皮细胞间抗体；
③
elisa检测到血清中出现抗dsg抗体。满足临床表现中的至少1条加上组织病理和免疫诊断指标中的至少1条即可确诊。满足临床表现中至少2条加上免疫诊断指标中2条亦可确诊。
4.在pv的诊断过程中需要高亲和力的抗dsg3单克隆抗体，经典的杂交瘤技术需要耗费大量的时间和精力去获得高亲和力的抗体，而且需要进行后续的人源化改造，这导致难以通过杂交瘤技术获得人源单克隆抗体。
5.噬菌体展示技术已被广泛应用于抗原抗体库的建立、药物设计、疫苗研究、病原检测、基因治疗、抗原表位研究及细胞信号转导研究等。噬菌体抗体库技术是通过制备人源抗体文库(library)，把fab段或单链抗体(scfv)表达在噬菌体的表面，从而筛选并富集特异性抗体。从单pot抗体文库系统中筛选出几乎所有与抗原发生特异性反应的重组人单克隆抗体，因此，当使用噬菌体抗体技术时，能获得可应用于体内诊断或治疗的各种抗体片段(fab或scfv)。噬菌体抗体库技术不需要经过免疫和人源化改造步骤，依靠在完全可控的生物化学环境中进行富集筛选，实现短期内筛选到较高亲和力的全人源人类抗体序列。
6.寻常型天疱疮的病理特点为表皮内水疱及棘层细胞松懈，导致该病理改变的直接原因是抗棘层细胞间质抗体，几乎所有的活动性天疱疮病人血清中都存在这种抗体，pv抗体作用的靶抗原位于表皮细胞间的连接结构-桥粒上，为跨膜桥粒核心蛋白(desmoglein3，dsg3)。dsg3分子量为64.95kd，属于钙粘素(cadherin)的超家族成员之一，在维持表皮的完整性方面发挥重要作用，其结构的破坏可导致棘刺松懈，引起表皮内水疱。dsg3的细胞内成分通过桥斑盘状蛋白与细胞骨架相互作用并构成连接，胞外区则介导细胞间的连接，dsg3的胞外区提供了pv抗体识别的抗原表位。dsg3中起主要作用的区域被称为细胞外功能区
(extracellular domain，ec)，dsg3的ec分为5个结构域(ec1-ec5)，ec-1位于氨基端，ec-5位于羧基端。dsg3分子的天然立体构象对激发自身免疫性大疱很重要。已有的研究通过杆状病毒表达系统和哺乳动物表达系统获得人dsg3重组蛋白，包括dsg3的整个ec，所得人dsg3重组蛋白可以与人pv患者血清的天然抗体特异性结合。人dsg3重组蛋白不仅可为诊断pv提供可靠的手段，还可用于进一步研究天疱疮的发病机理。
7.因此，利用噬菌体抗体库技术筛选一种结合寻常型天疱疮特异性抗原肽的人源抗体在天疱疮的诊断和/或治疗中具有重要的应用价值。


技术实现要素：

8.针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种结合dsg3的单克隆抗体及其应用。本发明中以dsg3抗体阳性患者的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，pbmc)构建噬菌体人源抗体库，通过与dsg3蛋白特异性结合，筛选出能特异性结合dsg3抗原的单克隆抗体。所述单克隆抗体亲和力高、特异性强，能够定量检测pv患者中抗dsg3自身抗体水平，监测病情活动度，用于pv患者的临床诊断。本发明的研究为特异性治疗pv提供了理论与实验依据，同时也为治疗以自身抗体为主要致病机制的自身免疫病提供了一个新的研究方向。
9.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
10.第一方面，本发明提供一种结合dsg3的单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链cdr3包括seq id no:3、seq id no:13、seq id no:23、seq id no:33或seq id no:43所示的氨基酸序列；
11.所述单克隆抗体的轻链cdr3包括seq id no:6、seq id no:16、seq id no:26、seq id no:36或seq id no:46所示的氨基酸序列。
12.本发明从噬菌体库中筛选出了特异性好、亲和力强的结合dsg3的单克隆抗体，所述单克隆抗体为全人源抗体，所述全人源抗体具有更低的免疫原性，在抗体药物及诊断药物开发上有巨大的应用潜力。
13.优选地，所述单克隆抗体的重链cdr1包括seq id no:1、seq id no:11、seq id no:21、seq id no:31或seq id no:41所示的氨基酸序列。
14.优选地，所述单克隆抗体的重链cdr2包括seq id no:2、seq id no:12、seq id no:22、seq id no:32或seq id no:42所示的氨基酸序列。
15.优选地，所述单克隆抗体的轻链cdr1包括seq id no:4、seq id no:14、seq id no:24、seq id no:34或seq id no:44所示的氨基酸序列。
16.优选地，所述单克隆抗体的轻链cdr2包括seq id no:5、seq id no:15、seq id no:25、seq id no:35或seq id no:45所示的氨基酸序列。
17.优选地，所述单克隆抗体的重链可变区包括seq id no:7、seq id no:17、seq id no:27、seq id no:37或seq id no:47所示的氨基酸序列。
18.优选地，所述单克隆抗体的轻链可变区包括seq id no:8、seq id no:18、seq id no:28、seq id no:38或seq id no:48所示的氨基酸序列。
19.优选地，所述单克隆抗体的重链包括seq id no:9、seq id no:19、seq id no:29、seq id no:39或seq id no:49所示的氨基酸序列。
20.优选地，所述单克隆抗体的轻链包括seq id no:10、seq id no:20、seq id no:30、seq id no:40或seq id no:50所示的氨基酸序列。
21.本发明分离了dsg3抗体阳性患者的pbmc，提取rna并对rna进行质检。采用rt-pcr技术将质检合格的rna反转录成cdna，扩增其中全部的抗体vh、vl基因片段。将体外扩增的vκ、vλ基因片段克隆入pata-scfv-2载体，构建成抗体组合文库。将抗体基因组合文库插入噬菌体编码的膜蛋白的基因iii(g3)或基因viii(g8)的先导系列的紧邻下游，通过辅助噬菌体的超感染，使外源抗体基因表达的多肽可以以融合蛋白的形式展示在噬菌体外壳蛋白piii或pviii的n端。每个噬菌体颗粒编码并呈递不同的抗体，其含有数十亿个单个克隆。在这些抗体文库中，编码可与抗原结合的那些抗体的基因通过在体外对抗原进行亲和力富集-温和洗脱-噬菌体扩增，再继续重复以上富集筛选过程，直至数个循环后获得特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库，从抗体噬菌体库中筛选阳性克隆。通过elisa方法对阳性克隆进行鉴定，最后从中筛选特异性好、亲和力强的全人源抗体。
22.经过抗体噬菌体库的筛选，最终得到了5条高亲和力的单克隆抗体，命名为76f-dsg3-ic-r2p1-g1、76f-dsg3-ic-r2p1-f2、76f-dsg3-ic-r2p1-e6、76f-dsg3-ic-r2p1-c9和76f-dsg3-ic-r2p1-h9。所述单克隆抗体活性高、稳定性好，且具有较强的特异性，能作为定性检测pv阳性的参考标准，也能定量检测pv患者中抗dsg3自身抗体水平。
23.单克隆抗体76f-dsg3-ic-r2p1-g1：
24.seq id no:1(重链cdr1)：gftlanst。
25.seq id no:2(重链cdr2)：svvgndkt。
26.seq id no:3(重链cdr3)：aasshfwsgsldi。
27.seq id no:4(轻链cdr1)：qsvlyssnnkny。
28.seq id no:5(轻链cdr2)：was。
29.seq id no:6(轻链cdr3)：qqyystplt。
30.seq id no:7(重链可变区)：
31.evqlvqsgpevkkpgtsvevscrasgftlanstvqwvrqargqrlewmgwsvvgndktdypqkfqervtftrdlstgtasmtlssltsedtafyycaasshfwsgsldiwgrgtlvtvss。
32.seq id no:8(轻链可变区)：
33.divmtqspdslavslgeratinckssqsvlyssnnknylawyqqkpgqppklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqyystpltfgggtkleik。
34.seq id no:9(76f-dsg3-ic-r2p1-g1抗体的重链氨基酸序列)：
35.mkhlwfflllvaaprwvlsevqlvqsgpevkkpgtsvevscrasgftlanstvqwvrqargqrlewmgwsvvgndktdypqkfqervtftrdlstgtasmtlssltsedtafyycaasshfwsgsldiwgrgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。
36.seq id no:10(76f-dsg3-ic-r2p1-g1抗体的轻链氨基酸序列)：
37.mvlqtqvfislllwisgaygdivmtqspdslavslgeratinckssqsvlyssnnknylawyqqkpgq
ppklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqyystpltfgggtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec。
38.单克隆抗体76f-dsg3-ic-r2p1-f2：
39.seq id no:11(重链cdr1)：gftlanst。
40.seq id no:12(重链cdr2)：svvgndkt。
41.seq id no:13(重链cdr3)：aasshfwsgsldi。
42.seq id no:14(轻链cdr1)：qsvlyssnnkny。
43.seq id no:15(轻链cdr2)：was。
44.seq id no:16(轻链cdr3)：qqyystpit。
45.seq id no:17(重链可变区)：
46.evqlvqsgpevkkpgtsvevscrasgftlanstvqwvrqargqrlewmgwsvvgndktdypqkfqervtftrdlstgtasmtlssltsedtafyycaasshfwsgsldiwgrgtlvtvss。
47.seq id no:18(轻链可变区)：
48.divmtqtpdslavslgeratinckssqsvlyssnnknylawyqqkpgqppklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqyystpitfgqgtrleik。
49.seq id no:19(76f-dsg3-ic-r2p1-f2抗体的重链氨基酸序列)：
50.mkhlwfflllvaaprwvlsevqlvqsgpevkkpgtsvevscrasgftlanstvqwvrqargqrlewmgwsvvgndktdypqkfqervtftrdlstgtasmtlssltsedtafyycaasshfwsgsldiwgrgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。
51.seq id no:20(76f-dsg3-ic-r2p1-f2抗体的轻链氨基酸序列)：
52.mvlqtqvfislllwisgaygdivmtqtpdslavslgeratinckssqsvlyssnnknylawyqqkpgqppklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqyystpitfgqgtrleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec。
53.单克隆抗体76f-dsg3-ic-r2p1-e6：
54.seq id no:21(重链cdr1)：gftlanst。
55.seq id no:22(重链cdr2)：svvgndkt。
56.seq id no:23(重链cdr3)：aasshfwsgsldv。
57.seq id no:24(轻链cdr1)：qsvlynsnnkny。
58.seq id no:25(轻链cdr2)：was。
59.seq id no:26(轻链cdr3)：hqyfgtpyt。
60.seq id no:27(重链可变区)：
61.qvqlvqsgpevkkpgtsvevscrasgftlanstvqwvrqarghrlewmgwsvvgndktdypqnlqervtftrdlstgtasmtlssltsedtaiyycaasshfwsgsldvwgrgtlvtvss。
62.seq id no:28(轻链可变区)：
63.eivltqspdslavslgeratinckssqsvlynsnnknylawyqqkpgqppklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyychqyfgtpytfgqgtkveik。
64.seq id no:29(76f-dsg3-ic-r2p1-e6抗体的重链氨基酸序列)：
65.mkhlwfflllvaaprwvlsqvqlvqsgpevkkpgtsvevscrasgftlanstvqwvrqarghrlewmgwsvvgndktdypqnlqervtftrdlstgtasmtlssltsedtaiyycaasshfwsgsldvwgrgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。
66.seq id no:30(76f-dsg3-ic-r2p1-e6抗体的轻链氨基酸序列)：
67.mvlqtqvfislllwisgaygeivltqspdslavslgeratinckssqsvlynsnnknylawyqqkpgqppklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyychqyfgtpytfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec。
68.单克隆抗体76f-dsg3-ic-r2p1-c9：
69.seq id no:31(重链cdr1)：ggsfsgyy。
70.seq id no:32(重链cdr2)：inhsgst。
71.seq id no:33(重链cdr3)：argrylatvrhyyyyymdv。
72.seq id no:34(轻链cdr1)：qslensagnty。
73.seq id no:35(轻链cdr2)：kvs。
74.seq id no:36(轻链cdr3)：mqgshwppyt。
75.seq id no:37(重链可变区)：
76.qvqlqqwgagllkpsetlsltcavyggsfsgyywswirqppgkglewigeinhsgstnynpslksrvtisvdtsknqfslklssvtaadtavyycargrylatvrhyyyyymdvwgkgtlvtvss。
77.seq id no:38(轻链可变区)：
78.eivltqsplflpvtlgqpasiscrssqslensagntylhwfqqrpgqsprrliykvsnrdsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqgshwppytfgqgtkveik。
79.seq id no:39(76f-dsg3-ic-r2p1-c9抗体的重链氨基酸序列)：
80.mkhlwfflllvaaprwvlsqvqlqqwgagllkpsetlsltcavyggsfsgyywswirqppgkglewigeinhsgstnynpslksrvtisvdtsknqfslklssvtaadtavyycargrylatvrhyyyyymdvwgkgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。
81.seq id no:40(76f-dsg3-ic-r2p1-c9抗体的轻链氨基酸序列)：
82.mvlqtqvfislllwisgaygeivltqsplflpvtlgqpasiscrssqslensagntylhwfqqrpgqs
prrliykvsnrdsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqgshwppytfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec。
83.单克隆抗体76f-dsg3-ic-r2p1-h9：
84.seq id no:41(重链cdr1)：gftlanst。
85.seq id no:42(重链cdr2)：svvgndkt。
86.seq id no:43(重链cdr3)：aasshfwsgsldi。
87.seq id no:44(轻链cdr1)：qsvlyssnnkny。
88.seq id no:45(轻链cdr2)：was。
89.seq id no:46(轻链cdr3)：qqyystpft。
90.seq id no:47(重链可变区)：
91.qvqlvqsgpevkkpgtsvevscrasgftlanstvqwvrqargqrlewmgwsvvgndktdypqkfqervtftrdlstgtasmtlssltsedtafyycaasshfwsgsldiwgrgtlvtvss。
92.seq id no:48(轻链可变区)：
93.divmtqtpdslavslgeratinckssqsvlyssnnknylawyqqkpgqppklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqyystpftfgpgtkveik。
94.seq id no:49(76f-dsg3-ic-r2p1-h9抗体的重链氨基酸序列)：
95.mkhlwfflllvaaprwvlsqvqlvqsgpevkkpgtsvevscrasgftlanstvqwvrqargqrlewmgwsvvgndktdypqkfqervtftrdlstgtasmtlssltsedtafyycaasshfwsgsldiwgrgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。
96.seq id no:50(76f-dsg3-ic-r2p1-h9抗体的轻链氨基酸序列)：
97.mvlqtqvfislllwisgaygdivmtqtpdslavslgeratinckssqsvlyssnnknylawyqqkpgqppklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqyystpftfgpgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec。
98.第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的结合dsg3的单克隆抗体。
99.第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体含有第二方面所述的核酸分子。
100.第四方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞中含有至少一个拷贝的第三方面所述的表达载体。
101.第五方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的结合dsg3的单克隆抗体，以及药学上可接受的载体和/或稀释剂。
102.第六方面，本发明提供一种用于检测样品中dsg3蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的结合dsg3的单克隆抗体。
103.第七方面，本发明提供第一方面所述的结合dsg3的单克隆抗体、第四方面所述的宿主细胞或第五方面所述的药物组合物中任意一种或至少两种的组合在制备用于诊断和/或治疗天疱疮的药物中的用途。
104.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
105.本发明经过抗体噬菌体库的筛选，得到了5条高亲和力的结合dsg3的单克隆抗体，所述单克隆抗体活性高、稳定性好，且具有较强的特异性，能作为定性检测pv阳性的参考标准，也能定量检测pv患者中抗dsg3自身抗体水平。
附图说明
106.图1是vl噬菌体文库的单克隆菌pcr琼脂糖凝胶电泳图；
107.图2是κh噬菌体文库的单克隆菌pcr琼脂糖凝胶电泳图；
108.图3是λh噬菌体文库的单克隆菌pcr琼脂糖凝胶电泳图；
109.图4a是轻链文库的测序质控结果；
110.图4b是重链文库的测序质控结果；
111.图5是纯化后的dsg3 sds-page电泳图；
112.图6a是76f-dsg3-ic-r2p1-g1抗体与dsg3的elisa检测结果；
113.图6b是76f-dsg3-ic-r2p1-f2抗体与dsg3的elisa检测结果；
114.图6c是76f-dsg3-ic-r2p1-e6抗体与dsg3的elisa检测结果；
115.图6d是76f-dsg3-ic-r2p1-c9抗体与dsg3的elisa检测结果；
116.图6e是76f-dsg3-ic-r2p1-h9抗体与dsg3的elisa检测结果。
具体实施方式
117.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
118.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
119.发明详述：
120.单克隆抗体是治疗性蛋白质中数量最大且发展最快的一组，目前有500多种治疗性抗体及其衍生物正在临床试验中，重点放在癌症治疗和自身免疫性疾病上。本发明分离了dsg3抗体阳性患者的pbmc，提取rna并对rna进行质检。采用rt-pcr技术将质检合格的rna反转录成cdna，扩增其中全部的抗体vh、vl基因片段。将体外扩增的vκ、vλ基因片段克隆入pata-scfv-2载体，构建成抗体组合文库。
121.将抗体基因组合文库插入噬菌体编码的膜蛋白的基因iii(g3)或基因viii(g8)的先导系列的紧邻下游，通过辅助噬菌体的超感染，使外源抗体基因表达的多肽可以以融合蛋白的形式展示在噬菌体外壳蛋白piii或pviii的n端。每个噬菌体颗粒编码并呈递不同的抗体，其含有数十亿个单个克隆。在这些抗体文库中，编码可与抗原结合的那些抗体的基因通过在体外对抗原进行亲和力富集-温和洗脱-噬菌体扩增，再继续重复以上富集筛选过程，直至数个循环后获得特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库，从抗体噬菌体库中筛选阳性
克隆。通过elisa方法对阳性克隆进行鉴定，最后从中筛选特异性好、亲和力强的全人源抗体。
122.本发明使用iii 1st strand cdna synthesis kit(+gdna wiper)反转录试剂盒将dsg3抗体阳性患者的rna反转录成cdna，对dna的vh和vl片段进行扩增。体外扩增得到的vκ、vλ基因片段通过克隆技术克隆入pata-scfv-2载体，组成vκ文库和vλ文库。使用质粒提取试剂盒提取vκ文库和vλ文库的质粒载体，将体外扩增的vh基因片段插入vκ文库和vλ文库的质粒载体，构成κh文库和λh文库。
123.将人工合成的dsg3结构域的基因重组到表达载体质粒pfastbac1中，得到dsg3-pfastbac1表达载体。将dsg3-pfastbac1表达载体转染到dh10bac感受态中培养，纯化得到dsg3抗原蛋白。
124.经过三轮抗体噬菌体库的筛选，将抗原组大于3倍对照组的克隆定为阳性克隆，对这些单克隆进行测序分析。排除掉错误抗体序列和重复抗体序列，并结合elisa实验所反映的抗原抗体特异性结合能力，最终得到了5条高亲和力的抗体，命名为76f-dsg3-ic-r2p1-g1、76f-dsg3-ic-r2p1-f2、76f-dsg3-ic-r2p1-e6、76f-dsg3-ic-r2p1-c9、76f-dsg3-ic-r2p1-h9。所述单克隆抗体活性高、稳定性好，且具有较强的特异性，能作为定性检测pv阳性的参考标准，也能定量检测pv患者中抗dsg3自身抗体水平。
125.实施例1人源scfv噬菌体展示文库的构建方法
126.本实施例分离了dsg3抗体阳性患者的pbmc，提取rna并对rna进行质检。采用rt-pcr技术将质检合格的rna反转录成cdna，扩增其中全部的抗体vh、vl基因片段。将体外扩增的vκ、vλ基因片段克隆入pata-scfv-2载体，构建成抗体组合文库。
127.本实施例中使用的主要试剂如表1所示：
128.表1
[0129][0130][0131]
1、文库构建
[0132]
1.1组装重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，实验步骤如下所示：pcr反应条件和
步骤如表2所示。
[0133]
表2
[0134][0135]
其中，变性，退火，延伸(1)这三个步骤，重复30次；引物序列如下所示：
[0136]
上游引物(f)：
[0137]5′
l-vh 1(seq id no:51)：acaggtgcccactcccaggtgcag。
[0138]5′
l-vh 3(seq id no:52)：aaggtgtccagtgtgargtgcag。
[0139]5′
l-vh 4/6(seq id no:53)：cccagatgggtcctgtcccaggtgcag。
[0140]5′
l-vh 5/7(seq id no:54)：caaggagtctgttccgaggtgcag。
[0141]5′
l vk 1/2(seq id no:55)：atgaggstcccygctcagctgctgg。
[0142]5′
l vk 3(seq id no:56)：ctcttcctcctgctactctggctcccag。
[0143]5′
l vk 4/5(seq id no:57)：atttctctgttgctctggatctctg。
[0144]5′
l vλ1(seq id no:58)：ggtcctgggcccagtctgtgctg。
[0145]5′
l vλ2(seq id no:59)：ggtcctgggcccagtctgccctg。
[0146]5′
l vλ3(seq id no:60)：gctctgtgacctcctatgagctg。
[0147]5′
l vλ4/5(seq id no:61)：ggtctctctcscagcytgtgctg。
[0148]5′
l vλ6(seq id no:62)：gttcttgggccaattttatgctg。
[0149]5′
l vλ7(seq id no:63)：ggtccaattcycaggctgtggtg。
[0150]5′
l vλ8/9/10(seq id no:64)：gagtggattctcagactgtggtg。
[0151]
下游引物(r)：
[0152]3′
ck(seq id no:65)：tgctgtccttgctgtcctgct。
[0153]3′
cλ(seq id no:66)：caccagtgtggccttgttggcttg。
[0154]
1.2构建轻链可变区噬菌体展示文库
[0155]
1.2.1为文库克隆准备pata-scfv-2载体。
[0156]
1.2.2消化载体和pcr产物，消化载体和pcr产物的反应体系如表3所示。
[0157]
表3
[0158]
[0159][0160]
1.2.3将消化后的载体和pcr产物进行连接，连接反应体系如表4所示；将配制的连接反应体系置于16℃孵育过夜，65℃加热灭活10min终止反应。
[0161]
表4
[0162]
/pata-vκpata-vλt4 dna连接酶(thermo)3μl3μl10
×
t4 dna连接酶缓冲液8μl8μl克隆载体(nhei/noti)1μg1μgvκ或vλ片段(nhei/noti)0.3μg0.3μgh2o添加至反应体系共80μl添加至反应体系共80μl
[0163]
1.2.4将连接产物电转到感受态细胞中，电转的步骤如下所示：
[0164]
1.2.4.1 tg1感受态细胞的制备。
[0165]
1.2.4.2 37℃预温1ml soc培养基(sigma，s1797)；将电穿孔比色皿(0.1厘米的间隙)和微离心管放在冰上(每个转换反应一个比色皿和一个微离心管)。
[0166]
1.2.4.3从-80℃的冰箱中取出电转感受态细胞，放在冰上直到它们完全融化(10-15min)；细胞解冻后，轻轻混匀；将50μl细胞放入在冰上的冷冻微离心管中。
[0167]
1.2.4.4小心地将3μl的dna混合物加入到冷冻的电穿孔比色皿中，不要产生气泡；用手腕快速向下轻弹试管，使细胞沉积在底部。
[0168]
1.2.4.5在600ω、10μf和1.8kv下电穿孔；在脉冲的10s内，立即在每个试管中加入1ml预热的soc培养基；37℃，250rpm摇晃1h。
[0169]
1.2.4.6收集所有的电转化培养基；连续稀释10μl培养物到90μl soc培养基中，涂布于lb/amp/glucose(lb/氨苄青霉素/葡萄糖培养基)上。37℃孵育过夜；通过计数菌落数量，乘以培养体积，除以平板接种体积，计算转化子总数。
[0170]
1.3构建vl-vh噬菌体展示文库
[0171]
1.3.1消化载体和pcr产物，消化反应体系如表5所示。
[0172]
表5
[0173][0174]
1.3.2连接反应体系如表6所示，将配制的连接反应体系置于16℃孵育过夜，65℃加热灭活10min终止反应。
[0175]
表6
[0176]
/pata-scfv-κhpata-scfv-λht4 dna连接酶(thermo)10μl10μl10
×
t4 dna连接酶缓冲液14μl14μl克隆载体(sfii/xhoi/ncoi)2μg2μgvh片段(sfii/xhoi)0.6μg0.6μgh2o添加至反应体系共140μl添加至反应体系共140μl
[0177]
1.3.3将连接产物电转到感受态细胞中，电转的步骤如下所示：
[0178]
1.3.3.1 tg1感受态细胞的制备。
[0179]
1.3.3.2 37℃预温4ml soc培养基(sigma，s1797)。将电穿孔比色皿(0.2厘米的间隙)和微离心管放在冰上(每个转换反应一个比色皿和一个微离心管)。
[0180]
1.3.3.3从-80℃的冰箱中取出电转感受态细胞，放在冰上直到它们完全融化(10-15min)。细胞解冻后，轻轻混匀。
[0181]
1.3.3.4小心地将6μl的dna混合物加入到冷冻的电穿孔比色皿中，不要产生气泡。用你的手腕快速向下轻弹试管，使细胞沉积在底部。
[0182]
1.3.3.5在600ω，10μf和2.5kv下电穿孔。在脉冲的10s内，立即在每个试管中加入2ml预热的soc培养基。37℃，250rpm摇晃1h。
[0183]
1.3.3.6收集所有的电转化培养基。连续稀释10μl培养物到90μl soc培养基中，涂布于lb/amp/glucose(lb/氨苄青霉素/葡萄糖培养基)上。37℃孵育过夜。通过计数菌落数量，乘以培养体积，除以平板接种体积，计算转化子总数。
[0184]
1.4文库评估
[0185]
1.4.1菌落pcr：以构建好的文库为模板进行pcr；pcr反应条件如表7所示。
[0186]
表7
[0187][0188]
其中，变性，退火，延伸(1)这三个步骤，重复30次。pcr反应的引物序列如下所示：
[0189]
上游引物(f)(seq id no:67)：agcggataacaatttcacacagga。
[0190]
下游引物(r)(seq id no:68)：gcccccttattagcgtttgccatc。
[0191]
pcr后琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1-图3所示。vl噬菌体文库的单克隆菌pcr琼脂糖凝胶电泳图如图1所示，图1中，泳道m：dl2000；泳道1-16：21000076f pata-vκ，泳道17-32：21000076f pata-vλ。κh噬菌体文库的单克隆菌pcr琼脂糖凝胶电泳图如图2所示，图2中，泳道m：dl2000，泳道1-48：21000076f pata-scfv-κh。λh噬菌体文库的单克隆菌pcr琼脂糖凝胶电泳图如图3所示，图3中，泳道m：dl2000，泳道1-48：21000076f pata-scfv-λh。
[0192]
1.4.2测序
[0193]
对噬菌体展示文库进行测序，挑选阳性克隆送到武汉擎科生物科技有限公司测序，噬菌体展示文库的测序质控结果如图4a和图4b所示。图4a为轻链文库的测序质控结果，图4b为重链文库的测序质控结果。从图4a和图4b中可知，文库序列覆盖了人源抗体大部分重链及轻链可变区的种系，文库多样性达到预计要求。
[0194]
1.5表达dsg3蛋白
[0195]
将人工合成的dsg3结构域的基因重组到表达载体质粒pfastbac1中，得到dsg3-pfastbac1表达载体。将dsg3-pfastbac1表达载体转染到dh10bac感受态中培养，纯化得到dsg3抗原蛋白。人工合成dsg3基因序列，将dsg3基因重组到表达载体质粒pfastbac1中，得到dsg3-pfastbac1表达载体；克隆位点bamhⅰ/xhoⅰ，dsg3的氨基酸序列如seq id no:69所示：
[0196]
ewvkfakpcregednskrnpiakitsdyqatqkityrisgvgidqppfgifvvdkntgdinitaivdreetpsflitcralnaqgldvekpliltvkildindnppvfsqqifmgeieensasnslvmilnatdadepnhlnskiafkivsqepagtpmfllsrntgevrtltnsldreqassyrlvvsgadkdgeglstqcecnikvkdvndnfpmfrdsqysarieenilssellrfqvtdldeeytdnwlavyfftsgnegnwfeiqtdprtnegilkvvkaldyeqlqsvklsiavknkaefhqsvisryrvqstpvtiqvinvregiafrpasktftvqkgisskklvdyilgtyqaidedtnkaasnvkyvmgrndggylmidsktaeikfvknmnrdstfivnktitaevlaideytgktstgtvyvrvpdfndncptavlekdavcssspsvvvsartlnnrytgpytfaledqpvklpavwsittlnatsallraqeqippgvyhislvltdsqnnrcemprsltlevcqcdnrgicgtsypttspgtrygrphsgr。
[0197]
将dsg3-pfastbac1表达载体转染到dh10bac感受态中培养，收集沉淀进行gst标签亲和层析得到dsg3蛋白；纯化后的dsg3还需要进行sds-page电泳(聚丙烯酰胺凝胶电泳)以验证其纯度，纯化后的dsg3 sds-page电泳图如图5所示，蛋白大小64.95kda，纯度大于
90％。
[0198]
实施例2筛选与dsg3特异性结合的单克隆抗体
[0199]
采用合适的淘选策略从噬菌体抗体库中富集所需的特异性抗体克隆。本实施例中使用的主要试剂如表8所示。
[0200]
表8
[0201]
试剂编号制造商96-well plate(96孔板)42592costartween 20(吐温20)p2287sigmatris(三羟甲基氨基甲烷)res3098t-b7sigmaglycine(甘氨酸)g8200solarbiopeg(聚乙二醇)181986sigmapbs(磷酸缓冲盐溶液)c10010500btlifecasein na salt(干酪素钠)s12003-100gshyuanyeskim milk(脱脂牛奶)6342932bdhrp标记的m13抗体mvv05401hantibodysystem
[0202]
1、第一轮淘选
[0203]
1.1生物淘选
[0204]
1.1.1包被：包被离心管，4℃孵育过夜。抗原组：1ml dsg3转染液(50μg/ml)，对照组：500μl转染液(0μg/ml)。
[0205]
1.1.2洗涤：弃掉离心管中液体，用5ml 0.05％ pbst洗涤三遍。
[0206]
1.1.3封闭：在管中加入5ml 5％脱脂牛奶或1％酪蛋白(pbst溶解)，37℃孵育2h。
[0207]
1.1.4洗涤：弃掉离心管中液体，用5ml 0.05％ pbst洗涤一遍。
[0208]
1.1.5孵育：用1％脱脂牛奶或0.2％酪蛋白(pbst溶解)稀释噬菌体文库，取1ml加入离心管中，32℃孵育2h。
[0209]
1.1.6洗涤：弃掉离心管中液体，用5ml 0.05％ pbst洗涤三遍，用pbs洗涤两遍。
[0210]
1.1.7洗脱：用1ml的甘氨酸-盐酸(ph 2.2)洗脱与dsg3结合的噬菌体，再用tris-hcl中和至ph 7.0。
[0211]
1.2测定稀释噬菌体的滴度
[0212]
1.2.1用1ml dsg3转染液(50μg/ml)包被离心管，4℃孵育过夜。
[0213]
1.2.2弃掉离心管中液体，用5ml 0.05％ pbst洗涤三遍。
[0214]
1.2.3在管中加入5ml 5％脱脂牛奶(pbst溶解)，37℃孵育2h。
[0215]
1.2.4弃掉离心管中液体，用5ml 0.05％ pbst洗涤一遍。
[0216]
1.2.5将1.1.7的噬菌体转移至离心管中，32℃孵育2h。
[0217]
1.2.6培养大肠杆菌tg1直到od
600
＝0.4-0.6。
[0218]
1.2.7混合10μl稀释的洗脱后噬菌体和180μl大肠杆菌tg1。
[0219]
1.2.8 37℃培养混合物30min，然后倒到2
×
yt-a(amp 100μg/ml)培养基中，将培养基倒扣培养在37℃处过夜。
[0220]
1.3噬菌体文库扩增
[0221]
1.3.1将10μl e.coli tg1加到800μl 2yt培养液中，在37℃混合培养至od
600
＝
0.4-0.6。
[0222]
1.3.2将培养至对数期的tg1转入10ml 2yt-g培养液(终浓度2％葡萄糖)，在摇床上37℃培养至od
600
＝0.4-0.6。
[0223]
1.3.3加入洗脱后的产物，37℃孵育30min，37℃摇床培养30min。
[0224]
1.3.4加入30ml 2yt-ag培养液(终浓度0.1％ amp，2％葡萄糖)，37℃摇床培养1h。
[0225]
1.3.5加入m13ko7(m13ko7:tg1＝20:1)，37℃孵育30min，37℃摇床培养30min。
[0226]
1.3.6菌液在5000rpm离心5min，用40ml 2yt-ak(终浓度amp 100μg/ml，kan 100μg/ml)重悬，30℃摇床孵育过夜。
[0227]
1.3.7 8000rpm离心10min，取出上清。上清液中加入1/5(v/v)peg/nacl，混合后置于冰上孵育2h。
[0228]
1.3.8用1ml pbs重悬，12000rpm离心5min，将上清转移至新的1.5ml离心管。
[0229]
1.4扩增后的噬菌体文库滴度测定，步骤同1.2。
[0230]
2、第二轮到第三轮淘选
[0231]
2.1生物淘选
[0232]
循环重复步骤1两次，每次投入的噬菌体文库均用前一轮扩增后的洗脱噬菌体。生物淘选结果如表9所示。
[0233]
表9
[0234][0235]
从表9可知，经过三轮淘选，抗原组获得的噬菌体/投入噬菌体比例逐轮增加，说明噬菌体已有一定程度的富集。
[0236]
3、多克隆噬菌体elisa
[0237]
3.1包被：包被酶标板，4℃孵育过夜。抗原组：100μl/每孔dsg3蛋白(4μg/ml)，对照组：100μl/每孔蛋白稀释液(0μg/ml)。
[0238]
3.2洗涤：弃掉酶标板中液体，每孔用300μl的0.05％ pbst洗涤三遍。
[0239]
3.3封闭：每孔加入300μl的5％脱脂牛奶(pbs溶解)，37℃封闭2h。
[0240]
3.4噬菌体孵育：每孔中加入100μl稀释后扩增噬菌体，如表10所示，32℃孵育2h。
[0241]
3.5洗涤：同步骤3.2。
[0242]
3.6二抗孵育：每孔加入100μl用封闭液稀释的anti-m13-hrp antibody(hrp标记的m13抗体)(1:6000)，32℃孵育1h。
[0243]
3.7洗涤：同步骤3.2。
[0244]
3.8显色：每孔加100μl tmb，室温孵育，然后每孔加100μl 2m hcl终止反应。
[0245]
3.9读板：使用酶标仪在450-630nm读取数值。多克隆噬菌体elisa的结果如表10所示。
[0246]
表10
[0247][0248]
从表10可知，随着轮数增加，抗原组elisa结果逐轮增大，说明阳性噬菌体逐轮富集，其中第二轮抗原组和对照组差距较大，故选用第二组的洗脱产物进行单克隆噬菌体elisa筛选。
[0249]
4、单克隆噬菌体elisa(根据多克隆结果选用第二轮洗脱产物进行单克隆)
[0250]
4.1从培养皿中选择96个克隆用于检测洗脱滴度；将这些克隆在37℃250rpm培养，直到od
600nm
＝0.4-0.6。
[0251]
4.2m13ko7感染培养物(moi＝20:1)，37℃孵育30min，37℃摇床培养30min；将菌液离心，并用等体积2
×
yt-ak(终浓度amp 100μg/ml，kan 100μg/ml)重悬沉淀，30℃培养过夜。
[0252]
4.3将培养物离心，上清液可用于elisa。
[0253]
4.4包被：包被酶标板，4℃孵育过夜；抗原组：100μl/每孔dsg3蛋白(4μg/ml)，对照组：100μl/每孔蛋白稀释液(0μg/ml)。
[0254]
4.5洗涤：弃掉酶标板中液体，每孔用300μl的0.05％ pbst洗涤三遍。
[0255]
4.6封闭：每孔加入300μl的5％脱脂牛奶(pbs溶解)，37℃封闭2h。
[0256]
4.7噬菌体孵育：每孔中加入100μl噬菌体上清，32℃孵育2h。
[0257]
4.8洗涤：同步骤4.5。
[0258]
4.9二抗孵育：每孔加入100μl用封闭液稀释的anti-m13-hrp antibody(hrp标记的m13抗体)(1:6000)，32℃孵育1h。
[0259]
4.10洗涤：同步骤4.5。
[0260]
4.11显色：每孔加100μl tmb，室温孵育，然后每孔加100μl 2m hcl终止反应。
[0261]
4.12读板：使用酶标仪在450-630nm读取数值，并对高特异性克隆进行测序。抗原组单克隆噬菌体elisa的结果如表11所示。
[0262]
表11
[0263]
[0264][0265]
对照组单克隆噬菌体elisa的结果如表12所示。
[0266]
表12
[0267] 123456789101112a0.020.030.030.020.020.020.020.020.020.020.020.02b0.020.020.020.030.020.020.020.020.020.020.020.03c0.020.020.020.020.020.030.020.020.020.020.020.03d0.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.02e0.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.030.02f0.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.030.03g0.020.020.020.020.020.020.030.020.020.020.040.03h0.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.030.02
[0268]
从表11和表12的结果可知，g1，f2，e6，c9，f9克隆的抗原组与对照组的结果差距大于0.1，故将其5个克隆暂时认定为阳性克隆，进行二次验证。
[0269]
5、阳性克隆验证elisa
[0270]
5.1将50μl阳性克隆加入2ml 2yt-ag培养基(终浓度0.1％ amp，2％葡萄糖)中培养至od
600
＝0.4-0.6。
[0271]
5.2m13ko7感染培养物(moi＝20:1)，37℃孵育30min，37℃摇床培养30min。将菌液离心，并用等体积2
×
yt-ak(终浓度amp 100μg/ml，kan 100μg/ml)重悬沉淀，30℃培养过夜。
[0272]
5.3将培养物离心，上清液可用于elisa。
[0273]
5.4包被：包被酶标板，4℃孵育过夜。抗原组：100μl/每孔dsg3蛋白(4μg/ml)，对照组：100μl/每孔蛋白稀释液(0μg/ml)。
[0274]
5.5洗涤：弃掉酶标板中液体，每孔用300μl的0.05％ pbst洗涤三遍。
[0275]
5.6封闭：每孔加入300μl的5％脱脂牛奶(pbs溶解)，37℃封闭2h。
[0276]
5.7噬菌体孵育：每孔中加入100μl噬菌体上清，32℃孵育2h。
[0277]
5.8洗涤：同步骤4.5。
[0278]
5.9二抗孵育：每孔加入100μl用封闭液稀释的anti-m13-hrp antibody(hrp标记的m13抗体)(1:6000)，32℃孵育1h。
[0279]
5.10洗涤：同步骤4.5。
[0280]
5.11显色：每孔加100μl tmb，室温孵育，然后每孔加100μl 2m hcl终止反应。
[0281]
5.12读板：使用酶标仪在450-630nm读取数值，并对高特异性克隆进行测序。阳性单克隆噬菌体elisa的结果表13所示。
[0282]
表13
[0283][0284]
从表13的结果可知，这5个阳性克隆的二次验证结果均为阳性。将阳性克隆送去测序，得到的高特异性抗体的序列。
[0285]
实施例3高特异性抗体的亲和力测定
[0286]
本实施例对实施例2筛选得到的抗体进行亲和力测定，采用酶联免疫吸附反应检测不同稀释浓度条件下的od值。酶联免疫吸附反应elisa实验步骤如下所示：
[0287]
1包被：100μl/每孔dsg3蛋白(4μg/ml)包被酶标板，4℃孵育过夜。
[0288]
2洗涤：弃掉酶标板中液体，每孔用300μl的0.05％ pbst洗涤三遍。
[0289]
3封闭：每孔加入300μl的5％脱脂牛奶(pbs溶解)，37℃封闭2h。
[0290]
4阳性抗体孵育：将76f-dsg3-ic-r2p1-g1、76f-dsg3-ic-r2p1-f2、76f-dsg3-ic-r2p1-e6、76f-dsg3-ic-r2p1-c9、76f-dsg3-ic-r2p1-h9抗体分别进行梯度稀释，稀释梯度为(4000ng/ml、2000ng/ml、1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.6ng/ml、7.8ng/ml、3.9ng/ml、1.95ng/ml、0.98ng/ml、0.49ng/ml和0.25ng/ml，每孔中加入100μl稀释后的抗体溶液，37℃孵育1h。
[0291]
5洗涤：同步骤4.5。
[0292]
6二抗孵育：用封闭液10000倍稀释goat anti-human igg(h+l)antibody(羊抗人igg二抗)(jackson，code：109-035-088)，每孔加入100μl稀释的二抗，37℃孵育30min。
[0293]
7洗涤：同步骤4.5。
[0294]
8显色：每孔加100μl tmb，37℃孵育10min，然后每孔加50μl 2m hcl终止反应。
[0295]
9读板：使用酶标仪在450-630nm读取数值。
[0296]
酶联免疫吸附反应的结果如图6a-6e所示。图6a为76f-dsg3-ic-r2p1-g1抗体与dsg3的elisa检测结果，图6b为76f-dsg3-ic-r2p1-f2抗体与dsg3的elisa检测结果，图6c为76f-dsg3-ic-r2p1-e6抗体与dsg3的elisa检测结果，图6d为76f-dsg3-ic-r2p1-c9抗体与dsg3的elisa检测结果，图6e为76f-dsg3-ic-r2p1-h9抗体与dsg3的elisa检测结果。从6a-6e可知，所筛选的5种人源性抗dsg3单克隆抗体与dsg3蛋白均具有较强的特异性结合的能力，所述抗体能作为定性检测pv阳性的参考标准，也能用于定量检测pv患者中抗dsg3自身抗体水平。
[0297]
综上，本发明以dsg3抗体阳性患者pbmc构建噬菌体人源抗体库，通过与dsg3特异性结合，从而筛选出特异性结合dsg3抗原的单克隆抗体。所述单克隆抗体活性高、稳定性好，且具有较强的特异性，能作为定性检测pv阳性的参考标准，也能定量检测pv患者中抗dsg3自身抗体水平，从而监测病情活动度，可用于pv患者的临床诊断。本发明的研究为特异性治疗pv提供了理论与实验依据，同时也为治疗以自身抗体为主要致病机制的自身免疫病提供了一个新的研究方向。
[0298]
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

技术特征：
1.一种结合dsg3的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链cdr3包括seq id no:3、seq id no:13、seq id no:23、seq id no:33或seq id no:43所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体的轻链cdr3包括seq id no:6、seq id no:16、seq id no:26、seq id no:36或seq id no:46所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的结合dsg3的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链cdr1包括seq id no:1、seq id no:11、seq id no:21、seq id no:31或seq id no:41所示的氨基酸序列；优选地，所述单克隆抗体的重链cdr2包括seq id no:2、seq id no:12、seq idno:22、seq id no:32或seq id no:42所示的氨基酸序列；优选地，所述单克隆抗体的轻链cdr1包括seq id no:4、seq id no:14、seq id no:24、seq id no:34或seq id no:44所示的氨基酸序列；优选地，所述单克隆抗体的轻链cdr2包括seq id no:5、seq id no:15、seq idno:25、seq id no:35或seq id no:45所示的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的结合dsg3的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区包括seq id no:7、seq id no:17、seq id no:27、seq id no:37或seq id no:47所示的氨基酸序列；优选地，所述单克隆抗体的轻链可变区包括seq id no:8、seq id no:18、seq idno:28、seq id no:38或seq id no:48所示的氨基酸序列。4.根据权利要求1所述的结合dsg3的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链包括seq id no:9、seq id no:19、seq id no:29、seq id no:39或seq id no:49所示的氨基酸序列；优选地，所述单克隆抗体的轻链包括seq id no:10、seq id no:20、seq id no:30、seq id no:40或seq id no:50所示的氨基酸序列。5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-4中任一项所述的结合dsg3的单克隆抗体。6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求5所述的核酸分子。7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中含有至少一个拷贝的权利要求6所述的表达载体。8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-4中任一项所述的结合dsg3的单克隆抗体，以及药学上可接受的载体和/或稀释剂。9.一种用于检测样品中dsg3蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-4中任一项所述的结合dsg3的单克隆抗体。10.权利要求1-4中任一项所述的结合dsg3的单克隆抗体、权利要求7所述的宿主细胞或权利要求8所述的药物组合物中任意一种或至少两种的组合在制备用于诊断和/或治疗天疱疮的药物中的用途。

技术总结
本发明提供了一种结合Dsg3的单克隆抗体及其应用。所述单克隆抗体的重链CDR3包括SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体的轻链CDR3包括SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。所述单克隆抗体能与Dsg3特异性结合，亲和力高，能够定量检测PV患者中抗Dsg3自身抗体水平，监测病情活动度，可用于PV患者的临床诊断。可用于PV患者的临床诊断。可用于PV患者的临床诊断。


技术研发人员：杨衡 王雅楠 冯素英 李岷
受保护的技术使用者：苏州方科生物科技有限公司 中国医学科学院皮肤病医院（中国医学科学院皮肤病研究所）
技术研发日：2023.03.14
技术公布日：2023/7/31