一种人肺腺鳞癌PD1抗体获得性耐药原代细胞株及其应用

一种人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株及其应用
技术领域
1.本发明涉及细胞生物学技术领域，尤其涉及一种人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株及其应用及其应用。


背景技术：

2.肺癌是目前全世界发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一。肺癌根据病理类型可以分为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，nsclc）和小细胞肺癌（small cell lung cancer，sclc）两大类。在nsclc中，腺癌是最常见的肺癌亚型，其次是鳞状细胞癌。肺腺鳞癌（adenosquamous carcinoma，asc）是nsclc相对罕见的病理亚型，具有腺癌和鳞癌的特点，占nsclc的3%左右。asc具有腺癌的远处转移性又具有鳞癌的局部侵袭性，恶性程度高，预后差于腺癌或鳞癌。
3.肺癌的治疗方式有手术、靶向治疗、免疫治疗和放化疗等方式。近年来，免疫治疗发展非常快，为nsclc的治疗提供了新的思路，并在2018年获得诺贝尔生理医学奖，使免疫治疗达到了更进一步的发展。免疫治疗成为肿瘤治疗的一个重要组成部分。近年来，针对pd-1/pd-l1（ programmed cell death protein-1/programmed death-ligand 1）免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitor,ici）在nsclc中取得显著的效果，并大大提高了nsclc患者的生存率。虽然，目前有文献报导使用pd1/pdl1抗体可使1.4%的患者达到了完全缓解（cr,complete response），27.1%患者达到了部分缓解（pr,partial response），但是任有不少患者对pd1抗体不响应，且机制不明。很大程度上是局限于研究模型的缺乏。
4.因此本发明建立了一种人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株及其应用。


技术实现要素：

5.鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株及其应用，旨在解决现有对pd1抗体耐药的人非小细胞肺癌原代细胞株模型仍很少见，无法进行下一步研究的问题。
6.本发明的技术方案如下：一种人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株，所述人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株命名为nsclc 002t，保藏编号为gdmcc.no:63193。
7.所述的人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株，其中，所述人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株株携带4号外显子的tp53点突变（4号外显子215号碱基c突变成g，72号脯氨酸突变成精氨酸，是重要抑癌基因，突变可引起细胞增殖）、cdkn2aip 3号外显子缺失突变（3号外显子722_724号和碱基缺失，241_242号氨基酸缺失-是多种肿瘤的抑癌基因，基因突变或缺失可促进肿瘤发生）、kmt2d 39号外显子缺失突变（39号外显子11729-11734号碱基缺失突变，3910-3912号氨基酸缺失突变，可促进鳞状癌变）。
8.所述的人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株在制备pd1抗体耐药制剂中的应用。
9.所述的人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株在构建人非小细胞肺癌体内外pd1抗体耐药的肿瘤模型中的应用。
10.所述的人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株在筛选抗肿瘤药物中的应用。
11.所述的人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株在筛选pd1耐药逆转剂中的应用。
12.所述的人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株在制备抗肿瘤药物的应用。
13.有益效果：本发明提供人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株及其应用。肺腺鳞癌是nsclc相对罕见的病理亚型，具有腺癌和鳞癌的特点，占nsclc的3%左右。asc具有腺癌的远处转移性又具有鳞癌的局部侵袭性，恶性程度高，预后差于腺癌或鳞癌。本发明选取pd1（35%）的患者中罕见类型（腺鳞癌）经过四次新辅助免疫治疗，达到获得性耐药后，建立耐药部分细胞模型。本发明的人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株nsclc 002t携带4号外显子的tp53点突变、cdkn2aip 3号外显子缺失突变、kmt2d 39号外显子缺失突变。该细胞株可以用于研究腺鳞癌pd1抗体耐药人非小细胞肺癌细胞形态学及生物学特点、该细胞株可以用于人肺腺鳞癌pd1抗肿瘤耐药机制探讨及其相关信号通路的研究、筛选及评估抗肿瘤免疫治疗药物，开发肿瘤免疫治疗耐药逆转药物等。具有较高的科研和生产应用价值，预期能产生良好的科研、经济和社会效益。
附图说明
14.图1为实施例1的患者治疗疗程示意图；图2为实施例1的治疗前穿刺he结果图；图3为实施例1对穿刺样本进行pd1免疫组化检测结果图；图4为实施例1的术后he结果图；图5为人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株的str检测结果图图6为人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株的外显子测序总体变异百分比示意图；图7为人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株的细胞生长曲线图；图8为人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株的细胞侵袭实验图；图9为人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株的细胞形态图。
具体实施方式
15.本发明提供一种人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株及其应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
16.本发明提供一种人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株，所述人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株命名为nsclc 002t，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2023年2月24日，保藏编号为gdmcc.no:63193。
17.本发明公开的人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株nsclc 002t，所述细胞株是从一名63岁女性临床分期为iiib期腺鳞癌，使用pd1抗体进行4次治疗后患者手术切除
的癌组织中样本中制备所得。临床上此患者经pd1抗体治疗后癌巢中鳞癌细胞消失，腺癌有残余肿瘤细胞。pd1抗体对此患者中鳞状细胞癌治疗效果不错，剩余的肿瘤细胞是对pd1耐药的腺癌细胞株。通过外显子测序发现本细胞具有4号外显子的tp53点突变（4号外显子215号碱基c突变成g，72号脯氨酸突变成精氨酸，是重要抑癌基因，突变可引起细胞增殖）、cdkn2aip 3号外显子缺失突变（3号外显子722_724号和碱基缺失，241_242号氨基酸缺失-是多种肿瘤的抑癌基因，基因突变或缺失可促进肿瘤发生）、kmt2d 39号外显子缺失突变（39号外显子11729-11734号碱基缺失突变，3910-3912号氨基酸缺失突变，可促进鳞状癌变）。
18.本实施例中，所述人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株鳞癌部分对pd1免疫治疗敏感，残余获得性耐药腺癌部分，可作为针对腺鳞癌抗pd1免疫治疗的研究模型。
19.本发明人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株nsclc 002t的建立方法为：（一）患者治疗过程1.1患者穿刺确定肺癌类型是腺鳞癌；1.2免疫组化结果显示此患者pd1表达阳性（35%）；1.3 24天后使用白蛋白紫杉醇+卡铂+卡瑞利珠抗体方案每隔3周进行4次治疗；1.4 进行免疫治疗181天后进行手术；1.5从术后肿瘤组织中分离提取人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株。
20.（二）提取原代细胞核培养流程1、准备支持细胞1.1准备好完全培养基dmem+10%pbs+双抗（青霉素和链霉素）；1.2将3t3-j2细胞从液氮中取出来，马上放入37℃中水浴锅中尽快解冻；1.3将3t3-j2细胞加入5ml 完全培养基中1000rpm/min 5min rt离心；1.4去上清，加入1ml 完全培养基轻柔吹打均匀；1.5加入t25培养瓶中进行培养；1.6细胞培传代培养到拟合度达80-90%丰度后加入含有丝裂霉素c（2-4ug/ml）3ml 2h，使其成为非增殖细胞，可作为支持细胞；1.7去除含有药物的培养基，加入dmem完全培养基进行培养，为下一步的的原代细胞培养作为支持细胞用。
21.2、组织消化成为单个肿瘤细胞进行培养1.1收集非小细胞肺癌患者术后肿瘤组织0.5
×
0.5
×
0.5cm3肿瘤组织；1.2将肿瘤组织过无水乙醇不超过3秒；1.3将肿瘤组织夹入加有双抗的生理盐水中冲洗；1.4在2.0 ml离心管中加入1.0ml配好的胶原消化酶；1.5将冲洗好的组织加入胶原酶中用剪刀剪碎并置于37℃水浴锅中进行消化20分钟；1.6往消化好的组织中加入含10%的pbs终止消化；1.7将终止消化的组织过70目筛，用pbs冲洗细胞筛；1.8 1000rpm/min 5min rt离心去除上清，加入5ml红细胞裂解液裂解8min；1.9加入10ml pbs终止红细胞裂解，1000rpm/min 5min rt离心，去除上清；
1.10加入肿瘤完全培养基轻柔吹打细胞；1.11将细胞吸入已加有支持细胞的t25瓶子置于37℃5% co2培养箱中进行培养；1.12 24 h内不移动细胞培养瓶，48 h观察细胞状态，3-5天换一次支持细胞；1.13 7-14天左右观察是否形成原代肿瘤细胞克隆。
22.（三）原代细胞传代1.1 在装有原代肿瘤细胞的培养瓶中吸出培养基，加入3ml pbs洗涤细胞；1.2吸去pbs，加入3 ml edta细胞消化液置于37℃5% co2培养箱中消化5min；1.3 5 min后吸取含10%fbs的pbs终止消化，去除支持细胞，用pbs洗涤完全去除支持细胞；1.4 吸取1ml含有 0.25%edta胰酶加入培养瓶中置于37℃5% co2培养箱中消化3-5min，消化期间注意观察细胞消化情况；1.5 加入3 ml 含有10%fbs的pbs终止胰酶消化反应；1.6 吸取细胞置于15 ml离心管中以1000rpm/min 5min rt进行离心，去除上清；1.7细胞按照要求以1：2或1：3传代于t75培养瓶中，或冻存或用于其他实验。
23.本实施例还提供所述的人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株在制备pd1抗体耐药制剂中的应用。
24.本实施例还提供所述的人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株在构建人非小细胞肺癌体内外pd1耐药的肿瘤模型中的应用。
25.本实施例还提供所述的人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株在筛选抗肿瘤药物中的应用。
26.本实施例还提供所述的人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株在筛选pd1耐药逆转剂中的应用。
27.本实施例还提供所述的人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株在制备抗肿瘤药物的应用。
28.下面进一步举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
29.实施例
30.对患者穿刺确定肺癌类型是腺鳞癌，24天后使用白蛋白紫杉醇+卡铂+卡瑞利珠抗体方案每隔3周进行4次治疗，进行免疫治疗181天后进行手术，其治疗疗程图如图1所示。
31.穿刺结果如图2所示，结果表明患者得腺鳞癌（he诊断：肺鳞癌与肺腺癌）。
32.对穿刺样本进行pd1免疫组化检测，其结果如图3所示，结果表明pd1表达阳性的细胞是35%，可用免疫治疗。
33.术后结果如图4所示，发现患者肿瘤组织中鳞癌细胞已消失，只剩下腺癌，样本中是pd1单抗获得性耐药腺癌。
34.实施例
35.str检测str 基因位点由长度为3～7个碱基对的短串连重复序列组成，这些重复序列广泛存在于人类基因组中，可作为高度多态性标记，并可通过pcr（聚合酶链式反应）来检测。str
基因座位上的等位基因可通过扩增区域内重复序列的拷贝数的不同来区分，在毛细管电泳分离之后可通过荧光检测来识别。随后通过一定的计算方法，即可根据所得的 str 分型结果与专业的细胞 str 数据库比对从而推算出样品所属的细胞系或可能的交叉污染的细胞系名称。其str检测结果如图5所示。
36.样品处理及检验方法：依次为基因组dna提取-str多重荧光复合扩增-str荧光信号检测-str图谱分型及数据分-数据库比对并出具报告。
37.细胞悬液，细胞沉淀等用基因组提取试剂盒（艾基生物）抽提全基因组 dna，微量紫外可见分光光度计（赛默飞 nanodrop 2000c）qc 检测 dna 浓度。使用ige-str20a 进行多荧光体系复合扩增（abi9700 pcr system），使用 abi3730xl遗传分析仪（美国 abi 公司）进行毛细管电泳、片段分离并采用 genemapper
®
id软件（版本号：id-x 1.5）进行基因型分析。按照（asn-0002-2011）要求必检的8个核心str位点和1个性别位点的基因分型结果。检测21个基因座，要求必检的8个核心str位点和 1 个性别位点的基因分型结果以“基因座/等位基因长度”来表示：amelogenin /x/x，vwa/17/18，d7s820/8/12，csf1po/10/12，d16s539/9/15，th01/9/9，d13s317/9/11，tpox/8/11，d5s818/10/10。将纯化后的肺癌原代细胞进行str检测，结果证实其为单一人类来源，且无交叉污染的一个新细胞。
38.实施例
39.采用qiagen dneasy blood&tissue kit或qiaamp dna ffpe tissue等试剂盒对样本进行dna提取。使用covaris m220 focused-ultrasonicator (covaris)对dna进行打断后构建测序文库。采用安捷伦sureselect human all exon v6 kit对每个样本进行捕获。
40.结果：源于人非小细胞肺癌的细胞株进行外显子测序，外显子测序总体变异百分比如图6所示，其中indel为插入缺失，外显子（exonic）突变占插入缺失的7.88%（数目为572），内含子（intronic）突变占插入缺失的65.46%，其他突变占插入缺失的26.66%；snp是单核苷酸多态性（指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性），其中外显子（exonic）突变占34.71%（数目为24369），内含子（intronic）突变占33.46%，同义单核苷酸突变（synonymous_snv）占19.26%，其他突变占12.58%。
41.实施例
42.用含有0.25%edta胰酶将来源于人非小细胞肺癌的细胞株（原代肿瘤细胞）消化成单细胞悬液并计数；按照每孔1000个细胞，铺入96孔板中，每组6孔；每隔24小时加入10μl cck8 试剂，37℃孵育1小时后，使用酶标仪在λ=490nm的条件下测出每孔的od值，连续检测4天，结果如图7所示。
43.实施例
44.细胞侵袭实验bd基质胶（matrigel）提前一晚从-80℃取出放置于冰上并置于4℃冰箱中溶解；提前在细胞培养小室（transwell 小室，corning，8um）中铺入100μl浓度为50 μg/ul基质胶，放入37℃培养箱中，使其凝固（2小时以上）；用含0.25%edta胰酶消化人非小细胞肺癌原代细胞制成细胞悬液并计数，用无血清的细胞培养基(ytb-tcsfm-e102)重悬细胞，将1
×
105的细胞悬液（即含有1
×
105个细胞）
加入小室上层，小室下层加入 800μl 肿瘤完全培养基（购于深圳涌泰生物科技有效公司，型号为 ytb-tcm-e102），放入细胞培养箱中培养 24小时；将小室取出，弃掉培养基，用棉签将小室上部的基质胶及细胞擦净，小室上下各加入 500μl 4%多聚甲醛固定液，室温固定30分钟；小室上下加入500μl结晶紫，染色15分钟，弃掉结晶紫，清水漂洗小室后垫支晾干；使用刀片将小室的上室膜切下，使用盖玻片压片于载玻片上，显微镜下统计穿过基质胶的细胞数，得到细胞迁移率。同时，以正常的肺上皮细胞做对比，结果如图8所示，与正常的肺上皮细胞（n）对比，nsclc-002t（原代肿瘤细胞）的侵袭能力显著上调。
45.实施例
46.细胞形态观察如图9所示，细胞呈立体状，细胞状态良好。
47.综上所述，本发明提供的一种人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株及其应用。本发明选取pd1（35%）的患者中腺鳞癌经过四次新辅助免疫治疗，达到获得性耐药后，建立耐药细胞模型。人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株nsclc 002t携带4号外显子的tp53点突变、cdkn2aip 3号外显子缺失突变、kmt2d 39号外显子缺失突变。该细胞株可以用于研究pd1抗体腺鳞癌耐药人非小细胞肺癌细胞形态学及生物学特点、筛选和评估抗肿瘤免疫治疗药物、开发肿瘤免疫治疗耐药逆转药物、研究更有效的肿瘤治疗方法等，并可用于非小细胞肺癌耐药机制的探讨及其相关信号通路的研究，具有较高的科研和生产应用价值，预期能产生良好的科研、经济和社会效益。
48.应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

技术特征：
1.一种人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株，其特征在于，所述人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株命名为nsclc 002t，保藏编号为gdmcc.no:63193。2.根据权利要求1所述的人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株，其特征在于，所述人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株携带4号外显子的tp53点突变、cdkn2aip 3号外显子缺失突变、kmt2d 39号外显子缺失突变。3.权利要求1所述的人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株在制备pd1抗体耐药制剂中的应用。4.权利要求1所述的人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株在构建人非小细胞肺癌体内外pd1抗体耐药的肿瘤模型中的应用。5.权利要求1所述的人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株在筛选抗肿瘤药物中的应用。6.权利要求1所述的人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株在筛选pd1耐药逆转剂中的应用。7.权利要求1所述的人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株在制备抗肿瘤药物的应用。

技术总结
本发明涉及细胞生物学技术领域，尤其涉及一种人肺腺鳞癌PD1抗体获得性耐药原代细胞株及其应用。本发明选取PD1表达阳性（35%）的腺鳞癌患者经过四次新辅助免疫治疗，达到获得性耐药后，建立耐药部分细胞模型。人肺腺鳞癌PD1抗体获得性耐药原代细胞株NSCLC 002T携带4号外显子的TP53点突变、CDKN2AIP 3号外显子缺失突变、KMT2D 39号外显子缺失突变。该细胞株可以用于人肺腺鳞癌PD1抗肿瘤耐药机制探讨及其相关信号通路的研究、筛选及评估抗肿瘤免疫治疗药物，开发肿瘤免疫治疗耐药逆转药物等。开发肿瘤免疫治疗耐药逆转药物等。开发肿瘤免疫治疗耐药逆转药物等。


技术研发人员：李谨 冯凤兰
受保护的技术使用者：广州医科大学附属第一医院（广州呼吸中心）
技术研发日：2023.03.10
技术公布日：2023/7/31