一种氨基酸脂质形成的纳米递送系统及其应用的制作方法

controlled release,344:50,2022)。
9.因此，如何在保证对核酸分子的包封效果以及核酸分子体内递送功能的前提下，降低可离子化脂质的毒性，提供更安全的核酸药物递送系统是核酸递送技术的关键问题之一。


技术实现要素：

10.本发明的目的是提供一种新的氨基酸脂质或其盐，其制备的药物递送系统对核酸分子的包封效率高，可有效递送核酸分子且核酸分子能够成功在细胞中表达，相比主流递送系统，该氨基酸脂质或其盐能够降低免疫原性和生物毒性。
11.本发明的另一目的是提供一种免疫原性低、生物毒性低、能够有效递送核酸分子并保证核酸分子成功表达的药物递送系统。
12.本发明的再一目的是提供免疫原性低，生物毒性低的核酸药物。
13.为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
14.通式(i)或通式(ii)所示的氨基酸脂质或其盐，
[0015][0016]
其中，
[0017]
r1代表羧基上缺了一个羟基的氨基酸残基，其结构式为nh
2-cr-co-，r为氨基酸的r基；
[0018]
r2，r3，r4分别独立地为碳原子数为5～40的直链烃基。
[0019]
本发明中，所述氨基酸不限于l型或d型。
[0020]
优选地，所述氨基酸为甘氨酸，蛋氨酸，丝氨酸，苯丙氨酸，丙氨酸，苏氨酸，酪氨酸，羟脯氨酸，谷氨酸，赖氨酸，半胱氨酸，脯氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，色氨酸，谷氨酰胺，天冬氨酸，天冬酰胺，精氨酸或组氨酸。
[0021]
进一步优选地，所述氨基酸为甘氨酸，蛋氨酸，丝氨酸，苯丙氨酸，丙氨酸，苏氨酸，酪氨酸，羟脯氨酸，谷氨酸或赖氨酸。
[0022]
更进一步优选地，所述氨基酸为甘氨酸，蛋氨酸，丝氨酸或苯丙氨酸。
[0023]
优选地，r2，r3，r4分别独立地为碳原子数为5～40的直链烷基。
[0024]
进一步优选地，r2，r3，r4分别独立地为碳原子数为7～30的直链烷基。
[0025]
更进一步优选地，r2，r3，r4分别独立地为碳原子数为7～20的直链烷基。
[0026]
优选地，r2，r3，r4分别独立地为碳原子数为5～40的含有1～3个双键的直链烯基。
[0027]
进一步优选地，r2，r3，r4分别独立地为碳原子数为7～30的含有1～3个双键的直链烯基。
[0028]
更进一步优选地，r2，r3，r4分别独立地为碳原子数为7～20的含有1～3个双键的直
链烯基。
[0029]
优选地，所述氨基酸脂质或其盐为通式(i)所示化合物。
[0030]
本发明中，r2，r3，r4相同或互不相同。
[0031]
优选地，r2，r3，r4相同。
[0032]
和/或，r2，r3，r4独立地为：
[0033][0034]
根据一些实施方式，所述氨基酸脂质为：
[0035]
[0036][0037]
本发明还提供一种递送系统，所述的递送系统包括上述氨基酸脂质或其盐中的一种或多种。
[0038]
优选地，所述递送系统还包括辅助脂质、胆固醇及其衍生物、peg化脂质中的一种或多种。
[0039]
进一步优选地，所述辅助脂质选自磷脂及其衍生物。
[0040]
再进一步优选地，所述的辅助脂质选自pc、dppc、dopc、dspc、dope、dppg中的一种或多种。
[0041]
进一步优选地，所述peg化脂质选自peg-dmg、peg-c-dmg、peg-dspe中的一种或多种。
[0042]
进一步优选地，所述氨基酸脂质或其盐、所述辅助脂质、所述胆固醇及其衍生物和所述peg化脂质的投料摩尔比为(40～99.5):(0～15):(0～50):(0.5～3)。
[0043]
本发明还提供所述的递送系统在制备核酸药物中的应用。
[0044]
本发明还提供一种核酸药物，所述核酸药物包括上述递送系统和核酸分子。
[0045]
优选地，所述核酸分子包括信使核酸分子(mrna)、小干扰核酸分子(sirna)、微小核酸分子(mirna)、小激活核酸分子(sarna)、反义寡核苷酸分子(aso)或适配体(aptamer)中的一种或多种。
[0046]
优选地，所述核酸药物为粒径为50～300nm的氨基酸脂质纳米颗粒。
[0047]
进一步优选地，所述核酸药物为粒径为50～300nm的氨基酸脂质纳米颗粒，例如50nm，80nm，100nm，120nm，150nm，180nm，200nm，220nm，250nm，280nm，300nm。
[0048]
优选地，通过微流控将所述的核酸分子与所述的氨基酸脂质或其盐、选择性地与辅助脂质、胆固醇及其衍生物、peg化脂质(peg-lipid)中的一种或多种混合自组装得到所
述核酸药物。
[0049]
优选地，所述氨基酸脂质或其盐和所述核酸分子的氮磷摩尔(n/p)比为(1～50):1。
[0050]
进一步优选地，所述氨基酸脂质或其盐和所述核酸分子的氮磷摩尔比为(3～15):1，例如3:1，5:1，10:1，15:1。
[0051]
优选地，所述核酸药物还包括药学上可接受的添加剂。
[0052]
进一步优选地，所述添加剂包括赋形剂等。
[0053]
优选地，所述核酸药物为冻干粉剂或注射剂。
[0054]
进一步优选地，所述核酸药物的使用对象为哺乳动物，优选为人。
[0055]
进一步优选地，所述核酸药物采用肌肉注射、静脉注射等方式给药。
[0056]
本发明至少具有如下有益效果：
[0057]
本发明采用氨基酸取代作为可离子化脂质的亲水头部，结合疏水羧酸尾部的配合，获得的氨基酸脂质或其盐对细胞毒性低，使用其制备的药物递送系统对核酸分子的包封效率可以达到主流纳米脂质体的效果，且同样能够向体内递送核酸分子并实现核酸分子在细胞中的有效表达，相比主流纳米脂质体，在保证递送功能的同时，自身毒性更低。
[0058]
进一步地，通过三(羟甲基)氨基甲烷的连接氨基酸亲水头部与疏水性烃链形成的氨基酸脂质或其盐不仅能够降低递送系统的免疫原性和生物毒性，在不影响核酸分子包封效率的同时，还具有明显更好的体内递送效果。
[0059]
本发明能够丰富现有核酸药物的递送系统，为使用者提供更多的选择，有利于核酸药物的发展及应用。
附图说明
[0060]
图1为脂质纳米颗粒(lnp)的结构示意图；
[0061]
图2为氨基酸脂质的细胞毒性测试结果图；
[0062]
图3为荧光素酶抗体检测结果图；
[0063]
图4为表观pka对应基因敲低效果图。
具体实施方式
[0064]
为了解决现有核酸分子的递送系统存在组成复杂、制备成本高、生物毒性大、免疫原性强、内涵体逃逸率低等缺点，本发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。以下将对该技术方案、实施过程及原理等作进一步的解释说明。
[0065]
本发明者经过潜心研究和长期探索，发现可离子化脂质体中的亲水头部胺类基团可由氨基酸形成，相比非天然的毒性大的取代胺基，氨基酸取代具有良好的生物相容性和非免疫原性，在不引起包封效率下降的前提下，降低了可离子化脂质体对细胞的毒性。
[0066]
具体地，本发明提供了通式(i)或通式(ii)所示的氨基酸脂质或其盐，
acid pentaerythritol lipid，apl)，并制备出相应的脂质体纳米颗粒(amino acid pentaerythritol nanoparticle，aplnp)。理化和生物学试验发现，aplnp能够有效的包载mrna和sirna。
[0077]
本发明还进一步尝试采用tris代替季戊四醇作为氨基酸脂质体中的连接基团，tris的化学结构式为：
[0078][0079]
与季戊四醇类似，tris也是多羟基多功能团化合物，其中的三个羟基可与羧酸脂质通过酯键共价连接，而氨基可与氨基酸通过酰胺键共价结合，tris与季戊四醇相比，除了具备与季戊四醇相似的化学结构特性可用于氨基酸和疏水链的连接基团外，tris本身也是低免疫原性和低生物毒性的。
[0080]
tris在医学上也称为缓血酸铵，是一种碱性缓冲剂，对代谢酸中毒和酶活动反应具有良好的缓冲作用。适用于代谢性酸血症，呼吸性酸血症等疾病，特别是针对高尿酸血症有显著的疗效，能有效促进尿酸溶解。以上tris在生物或医药领域的应用足以证明tris是生物安全的。
[0081]
实验发现，某些氨基酸、tris和脂质的合理组合可以实现好的递送效果，其递送荧光mrna的效果可以达到或超过主流lnp的效果。其递送sirna后对靶基因的敲低效果也可达到或超过主流lnp的效果。在与季戊四醇类似物(aplnp)相关生物学试验的对照中发现，无论是递送mrna还是sirna，atlnp均显示出比aplnp更优越的递送效率。
[0082]
发明人认为tris中的氨基及其与氨基酸形成的酰胺键在atlnp的核酸递送中起了重要的作用。通过三(羟甲基)氨基甲烷(tris)的连接氨基酸亲水头部与疏水性烃链形成的氨基酸脂质或其盐(amino acid-tris-lipid，atl)在生理ph值下的电荷比阳离子类脂质小得多，主要通过氢键与核酸分子结合，形成包含核酸分子的脂质纳米颗粒。而在作为atlnp中关键组分的atl中，tris与氨基酸形成的酰胺键具有很强的氢键形成能力，从而强化了atlnp与核酸的结合能力，大大有利于核酸药物的递送。而在aplnp中，由于没有酰胺键，因而与核酸的氢键结合能力被削落。作为atlnp主要成分的氨基酸脂质atl中，氨基酸和tris通过酰胺键相连，酰胺键能进一步增强氨基酸脂质和核酸分子的氢键相互作用，从而更进一步提高核酸分子的递送效率。
[0083]
因此，本发明中提供了包封效率高、毒性低且能够成功将核酸分子递送至细胞中并表达的多种氨基酸脂质，其中优选通式(i)所示的氨基酸脂质，对mrna以及sirna的体内递送效果更好。
[0084]
使用本发明的可离子化脂质体-氨基酸脂质或其盐(amino acid-tris-lipid，atl)制备的氨基酸脂质纳米颗粒递送系统(amino acid-tris-lipid nano particles，atlnp)可用于核酸分子的递送，其免疫原性低，生物毒性低，有效递送核酸分子并在体内实现表达。
[0085]
下面结合具体实施例和对比例进一步阐述本发明的技术方案和技术效果。
[0086]
在没有特别说明的情况下，以下实施例中使用的原料等通过市售获得。
[0087]
在没有特别说明的情况下，以下实施例中涉及到的室温(rt)指20～35℃，以下实施例中涉及到的洗脱液的比例为体积比。
[0088]
以下实施例和对比例中涉及名称缩写中―c10”和―c
10”等同，均表示含有10个碳原子的链脂质。
[0089]
在没有特别说明的情况下，以下实施例中涉及的实验方法或测试方法采用本领域中常规的方法。
[0090]
合成实施例
[0091]
实施例1.met-tris-3moa
[0092][0093]
在n2保护下，于10ml反应瓶中加入肉豆蔻油酸(moa，298mg，1.31mmol)，n-叔丁氧羰基-三(羟甲基)氨基甲烷(boc-tris，88.5mg，0.40mmol)，dmap(50mg，0.40mmol)及dmf(3.5ml)，搅拌得到澄清溶液，加入edci.hcl(307mg，1.60mmol)。加毕，在n2保护下室温搅拌18h。用乙酸乙酯(ea)稀释(150ml)，有机相分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤各一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后所得粗品用硅胶柱纯化，洗脱剂(石油醚/乙酸乙酯，pe/ea)＝30:1，得无色油状液体boc-tris-3moa(259mg，0.31mmol，收率77％。
[0094]
在n2保护下，将boc-tris-3moa(250mg，0.30mmol)溶于4ml二氯甲烷(dcm)，接着加入三氟乙酸(tfa，1.0ml)。室温反应，lc-ms跟踪反应，2h后停止反应。将反应液减压下浓缩后转移至分液漏斗，加入100ml二氯甲烷，并用饱和碳酸氢钠溶液将有机层调至ph＝7-8，分离有机层，水层用二氯甲烷萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得无色油状液体tris-3moa(216mg，0.29mmol))，收率为97％。
[0095]
在n2保护下，于10ml反应瓶中加入tris-3moa(107.5mg，0.14mmol)，n-叔丁氧羰基-l-蛋氨酸(boc-met，70mg，0.28mmol)，hbtu(115mg，0.30mmol)，hobt(41mg，0.30mmol)及dmf(3.5ml)，搅拌得到澄清溶液，加入dipea(108mg，0.83mmol)。加毕，在n2保护下室温搅拌18h。用乙酸乙酯稀释(150ml)，有机相分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤各一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后所得粗品用硅胶柱纯化，洗脱剂pe/ea＝10:1，得无色油状液体boc-met-tris-3moa(123mg，0.12mmol，收率86％。
[0096]
在n2保护下，将boc-met-tris-3moa(123mg，0.12mmol)溶于3ml二氯甲烷，接着加入三氟乙酸(0.75ml)。室温反应，lc-ms跟踪反应，2h后停止反应。将反应液减压下浓缩后转移至分液漏斗，加入100ml二氯甲烷，并用饱和碳酸氢钠溶液将有机层调至ph＝7-8，分离有机层，水层用二氯甲烷萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用
硅胶柱纯化，洗脱剂dcm/ch3oh＝40:1，得无色油状液体met-tris-3moa(97mg，0.11mmol)，收率为92％，核磁共振氢谱结果如下：
[0097]1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ7.65(s,1h),5.32(s,6h),4.40(s,6h),3.46(d,j＝12.6hz,1h),2.59(d,j＝3.9hz,2h),2.32(d,j＝15.2hz,6h),2.10(s,3h),2.01(s,12h),1.77(d,j＝28.4hz,2h),1.59(s,6h),1.30(s,36h),0.90(d,j＝14.0hz,9h).
[0098]
实施例2.gly-tris-3moa
[0099][0100]
在n2保护下，于10ml反应瓶中加入tris-3moa(168mg，0.22mmol)，n-叔丁氧羰基-甘氨酸(boc-gly，77mg，0.44mmol)，hbtu(167mg，0.44mmol)，hobt(59mg，0.44mmol)及dmf(3.5ml)，搅拌得到澄清溶液，加入dipea(170mg，1.32mmol)。加毕，在n2保护下室温搅拌18h。用乙酸乙酯稀释(150ml)，有机相分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤各一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后所得粗品用硅胶柱纯化，洗脱剂pe/ea＝10:1，得无色油状液体boc-gly-tris-3moa(159mg，0.18mmol)，收率81％。
[0101]
在n2保护下，将boc-gly-tris-3moa(159mg，0.18mmol)溶于3ml二氯甲烷，接着加入三氟乙酸(0.75ml)。室温反应，lc-ms跟踪反应，2h后停止反应。将反应液减压下浓缩后转移至分液漏斗，加入100ml二氯甲烷，并用饱和碳酸氢钠溶液将有机层调至ph＝7-8，分离有机层，水层用二氯甲烷萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂dcm/ch3oh＝40:1，得无色油状液体gly-tris-3moa(117mg，0.15mmol)，收率为83％，核磁共振氢谱结果如下：
[0102]1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ7.62(s,1h),5.33(s,6h),4.44(s,6h),3.31(s,2h),2.34(s,6h),2.08
–
2.00(m,12h),1.60(d,j＝6.8hz,6h),1.31(d,j＝9.4hz,36h),0.88(s,9h).
[0103]
实施例3.gly-tris-3ma
[0104][0105]
在n2保护下，于10ml反应瓶中加入肉豆蔻酸(ma，0.75g，3.3mmol)，boc-tris(0.22g，1.0mmol)，dmap(0.12g，1.0mmol)及dmf(10ml)，搅拌得到澄清溶液，加入edci.hcl(0.85g，4.4mmol)。加毕，在n2保护下室温搅拌18h。用乙酸乙酯稀释(300ml)，有机相分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤各一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后所得粗品用硅胶柱纯化，洗脱剂pe/ea＝30:1，得无色油状液体，放置后成白色固体boc-tris-3ma(0.78g，0.9mmol，收率90％。
[0106]
在n2保护下，将boc-tris-3ma(0.78g，0.90mmol)溶于8ml二氯甲烷，接着加入三氟乙酸(2.0ml)。室温反应，lc-ms跟踪反应，2h后停止反应。将反应液减压下浓缩后转移至分液漏斗，加入200ml二氯甲烷，并用饱和碳酸氢钠溶液将有机层调至ph＝7-8，分离有机层，水层用二氯甲烷萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得白色固体tris-3ma(0.64g，0.85mmol)，收率为94％。
[0107]
在n2保护下，于10ml反应瓶中加入tris-3ma(0.64g，0.85mmol)，boc-gly(0.30g，1.71mmol)，hbtu(0.65g，1.71mmol)，hobt(0.23g，1.70mmol)及dmf(10ml)，搅拌得到澄清溶液，加入dipea 0.81g，6.3mmol)。加毕，在n2保护下室温搅拌18h。用乙酸乙酯稀释(300ml)，有机相分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤各一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后所得粗品用硅胶柱纯化，洗脱剂pe/ea＝10:1，得无色油状液体boc-gly-tris-3ma(0.66g，0.72mmol，收率85％。
[0108]
在n2保护下，将boc-gly-tris-3ma(0.66g，0.72mmol)溶于8.0ml二氯甲烷，接着加入三氟乙酸(2.0ml)。室温反应，lc-ms跟踪反应，2h后停止反应。将反应液减压下浓缩后转移至分液漏斗，加入200ml二氯甲烷，并用饱和碳酸氢钠溶液将有机层调至ph＝7-8，分离有机层，水层用二氯甲烷萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂dcm/ch3oh＝40:1，得白色固体gly-tris-3ma(0.48g，0.59mmol)，收率为82％，核磁共振氢谱结果如下：
[0109]1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ7.62(s,1h),4.44(s,6h),3.32(s,2h),2.32(d,j＝15.1hz,6h),1.61(d,j＝6.8hz,6h),1.26(s,60h),0.88(d,j＝13.5hz,9h).
[0110]
实施例4.gly-tris-3poa
[0111][0112]
在n2保护下，于10ml反应瓶中加入棕榈油酸(poa，251.7mg，0.99mmol)，boc-tris(66.3mg，0.3mmol)，dmap(36.7mg，0.3mmol)及dmf(3ml)，搅拌得到澄清溶液，加入edci.hcl(230.3mg，1.2mmol)。加毕，在n2保护下室温搅拌18h。用乙酸乙酯稀释(150ml)，有机相分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤各一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后所得粗品用硅胶柱纯化，洗脱剂pe/ea＝30:1，得无色油状液体boc-tris-3poa(231mg，0.25mmol)，收率83％。
[0113]
在n2保护下，将boc-tris-3poa(231mg，0.25mmol)溶于2ml二氯甲烷，接着加入三氟乙酸(0.5ml)。室温反应，lc-ms跟踪反应，2h后停止反应。将反应液减压下浓缩后转移至分液漏斗，加入120ml二氯甲烷，并用饱和碳酸氢钠溶液将有机层调至ph＝7-8，分离有机层，水层用二氯甲烷萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得无色油状液体tris-3poa(205mg，0.24mmol))，收率为96％。
[0114]
在n2保护下，于10ml反应瓶中加入tris-3poa(205mg，0.24mmol)，boc-gly(87.6mg，0.5mmol)，hbtu(190mg，0.50mmol)，hobt(68.2mg，0.50mmol)及dmf(3ml)，搅拌得到澄清溶液，加入dipea(195mg，1.5mmol)。加毕，在n2保护下室温搅拌18h。用乙酸乙酯稀释(150ml)，有机相分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤各一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后所得粗品用硅胶柱纯化，洗脱剂pe/ea＝10:1，得无色油状液体boc-gly-tris-3poa(166mg，0.17mmol)，收率71％。
[0115]
在n2保护下，将boc-gly-tris-3poa(166mg，0.17mmol)溶于2.0ml二氯甲烷，接着加入三氟乙酸(0.5ml)。室温反应，lc-ms跟踪反应，2h后停止反应。将反应液减压下浓缩后转移至分液漏斗，加入100ml二氯甲烷，并用饱和碳酸氢溶液将有机层调至ph＝7-8，分离有机层，水层用二氯甲烷萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂dcm/ch3oh＝40:1，得无色油状液体gly-tris-3poa(132mg，0.15mmol)，收率为88％，核磁共振氢谱结果如下：
[0116]1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ7.64(s,1h),5.33(s,6h),4.44(s,6h),3.28(s,2h),2.32(d,j＝15.2hz,6h),2.01(d,j＝18.6hz,12h),1.60(d,j＝6.5hz,6h),1.29(d,j＝22.7hz,48h),0.90(s,9h).
[0117]
实施例5.gly-tris-3doa
[0118][0119]
在n2保护下，于10ml反应瓶中加入顺-5-十二烯酸(doa，196.8mg，0.99mmol)，boc-tris(66.2mg，0.3mmol)，dmap(36.8mg，0.3mmol)及dmf(3ml)，搅拌得到澄清溶液，加入edci.hcl(230.2mg，1.2mmol)。加毕，在n2保护下室温搅拌18h。用乙酸乙酯稀释(150ml)，有机相分别用饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠溶液洗涤各一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后所得粗品用硅胶柱纯化，洗脱剂pe/ea＝30:1，得无色油状液体boc-tris-3doa(208mg，0.27mmol)，收率90％。
[0120]
在n2保护下，将boc-tris-3doa(208mg，0.27mmol)溶于2ml二氯甲烷，接着加入三氟乙酸(0.5ml)。室温反应，lc-ms跟踪反应，2h后停止反应。将反应液减压下浓缩后转移至分液漏斗，加入120ml二氯甲烷，并用饱和碳酸氢钠溶液将有机层调至ph＝7-8，分离有机层，水层用二氯甲烷萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得无色油状液体tris-3doa(179mg，0.27mmol)，收率为99％。
[0121]
在n2保护下，于10ml反应瓶中加入tris-3doa(179mg，0.27mmol)，boc-gly(94.8mg，0.54mmol)，hbtu(205mg，0.54mmol)，hobt(73.2mg，0.54mmol)及dmf(3ml)，搅拌得到澄清溶液，加入dipea(210mg，1.63mmol)。加毕，在n2保护下室温搅拌18h。用乙酸乙酯稀释(150ml)，有机相分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤各一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后所得粗品用硅胶柱纯化，洗脱剂pe/ea＝10:1，得无色油状液体boc-gly-tris-3doa(161mg，0.20mmol)，收率74％。
[0122]
在n2保护下，将boc-gly-tris-3doa(154mg，0.19mmol)溶于2.0ml二氯甲烷，接着加入三氟乙酸(0.5ml)。室温反应，lc-ms跟踪反应，2h后停止反应。将反应液减压下浓缩后转移至分液漏斗，加入100ml二氯甲烷，并用饱和碳酸氢钠溶液将有机层调至ph＝7-8，分离有机层，水层用二氯甲烷萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂dcm/ch3oh＝40:1，得无色油状液体gly-tris-3doa(97mg，0.13mmol)，收率为68％，核磁共振氢谱结果如下：
[0123]1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ7.65(s,1h),5.31(s,6h),4.45(s,6h),3.29(s,2h),2.31(s,6h),2.09
–
1.99(m,12h),1.66(d,j＝14.9hz,6h),1.29(s,24h),0.89(d,j＝6.6hz,9h).
[0124]
实施例6.gly-tris-3oa
[0125][0126]
在n2保护下，于10ml反应瓶中加入油酸(oa，282.6mg，1.0mmol)，boc-tris(66.3mg，0.3mmol)，dmap(36.9mg，0.3mmol)及dmf(3ml)，搅拌得到澄清溶液，加入edci.hcl(230.5mg，1.2mmol)。加毕，在n2保护下室温搅拌18h。用乙酸乙酯稀释(150ml)，有机相分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤各一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后所得粗品用硅胶柱纯化，洗脱剂pe/ea＝30:1，得无色油状液体boc-tris-3oa(272mg，0.27mmol)，收率90％。
[0127]
在n2保护下，将boc-tris-3oa(272mg，0.27mmol)溶于3ml二氯甲烷，接着加入三氟乙酸(0.75ml)。室温反应，lc-ms跟踪反应，2h后停止反应。将反应液减压下浓缩后转移至分液漏斗，加入120ml二氯甲烷，并用饱和碳酸氢钠溶液将有机层调至ph＝7-8，分离有机层，水层用二氯甲烷萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得无色油状液体tris-3oa(240mg，0.26mmol)，收率为96％。
[0128]
在n2保护下，于10ml反应瓶中加入tris-3oa(240mg，0.26mmol)，boc-gly(93mg，0.53mmol)，hbtu(201mg，0.53mmol)，hobt(72mg，0.53mmol)及dmf(3ml)，搅拌得到澄清溶液，加入dipea(205mg，1.58mmol)。加毕，在n2保护下室温搅拌18h。用乙酸乙酯稀释(150ml)，有机相分别用饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠溶液洗涤各一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后所得粗品用硅胶柱纯化，洗脱剂pe/ea＝10:1，得无色油状液体boc-gly-tris-3oa(189mg，0.18mmol)，收率69％。
[0129]
在n2保护下，将boc-gly-tris-3oa(189mg，0.18mmol)溶于3.0ml二氯甲烷，接着加入三氟乙酸(0.75ml)。室温反应，lc-ms跟踪反应，2h后停止反应。将反应液减压下浓缩后转移至分液漏斗，加入100ml二氯甲烷，并用饱和碳酸氢钠溶液将有机层调至ph＝7-8，分离有机层，水层用二氯甲烷萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂dcm/ch3oh＝40:1，得无色油状液体gly-tris-3oa(139mg，0.14mmol)，收率为78％，核磁共振氢谱结果如下：
[0130]1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ7.64(s,1h),5.34(s,6h),4.44(s,6h),3.34(s,2h),2.32(t,j＝7.5hz,6h),2.02(d,j＝12.1hz,12h),1.56(s,6h),1.28(d,j＝12.7hz,60h),0.86(s,9h).
[0131]
实施例7.gly-tris-3lin
[0132][0133]
在n2保护下，于10ml反应瓶中加入亚油酸(lin，280.6mg，1.0mmol)，boc-tris(66.3mg，0.3mmol)，dmap(36.9mg，0.3mmol)及dmf(3ml)，搅拌得到澄清溶液，加入edci.hcl(230.5mg，1.2mmol)。加毕，在n2保护下室温搅拌18h。用乙酸乙酯稀释(150ml)，有机相分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤各一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后所得粗品用硅胶柱纯化，洗脱剂pe/ea＝30:1，得无色油状液体boc-tris-3lin(241mg，0.24mmol)，收率80％。
[0134]
在n2保护下，将boc-tris-3lin(241mg，0.24mmol)溶于3ml二氯甲烷，接着加入三氟乙酸(0.75ml)。室温反应，lc-ms跟踪反应，2h后停止反应。将反应液减压下浓缩后转移至分液漏斗，加入120ml二氯甲烷，并用饱和碳酸氢钠溶液将有机层调至ph＝7-8，分离有机层，水层用二氯甲烷萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得无色油状液体tris-3lin(213mg，0.23mmol)，收率为96％。
[0135]
在n2保护下，于10ml反应瓶中加入tris-3lin(213mg，0.23mmol)，boc-gly(82mg，0.47mmol)，hbtu(178mg，0.47mmol)，hobt(63.5mg，0.47mmol)及dmf(3ml)，搅拌得到澄清溶液，加入dipea(182mg，1.40mmol)。加毕，在n2保护下室温搅拌18h。用乙酸乙酯稀释(150ml)，有机相分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤各一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后所得粗品用硅胶柱纯化，洗脱剂pe/ea＝10:1，得无色油状液体boc-gly-tris-3lin(166mg，0.16mmol)，收率69％。
[0136]
在n2保护下，将boc-gly-tris-3lin(136mg，0.13mmol)溶于3.0ml二氯甲烷，接着加入三氟乙酸(0.75ml)。室温反应，lc-ms跟踪反应，2h后停止反应。将反应液减压下浓缩后转移至分液漏斗，加入100ml二氯甲烷，并用饱和碳酸氢钠溶液将有机层调至ph＝7-8，分离有机层，水层用二氯甲烷萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂dcm/ch3oh＝40:1，得无色油状液体gly-tris-3lin(101mg，0.11mmol)，收率为85％，核磁共振氢谱结果如下：
[0137]1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ7.65(s,1h),5.39
–
5.30(m,12h),4.44(s,6h),3.28(s,2h),2.77(d,j＝13.0hz,6h),2.33(d,j＝7.5hz,6h),2.06(s,12h),1.62(d,j＝7.0hz,6h),1.31(tdd,j＝9.8,4.5,2.2hz,42h),0.89(d,j＝13.7hz,9h).
[0138]
实施例8.gly-tris-3pa
[0139][0140]
在n2保护下，于10ml反应瓶中加入棕榈酸(pa，260mg，1.01mmol)，boc-tris(68.2mg，0.31mmol)，dmap(40.5mg，0.33mmol)及dmf(3.5ml)，搅拌得到澄清溶液，加入edci.hcl(235mg，1.22mmol)。加毕，在n2保护下室温搅拌18h。用乙酸乙酯稀释(150ml)，有机相分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤各一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后所得粗品用硅胶柱纯化，洗脱剂pe/ea＝30:1，得无色油状液体boc-tris-3pa(235mg，0.25mmol)，收率81％。
[0141]
在n2保护下，将boc-tris-3pa(235mg，0.25mmol)溶于3ml二氯甲烷，接着加入三氟乙酸(0.75ml)。室温反应，lc-ms跟踪反应，2h后停止反应。将反应液减压下浓缩后转移至分液漏斗，加入120ml二氯甲烷，并用饱和碳酸氢钠溶液将有机层调至ph＝7-8，分离有机层，水层用二氯甲烷萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得白色固体tris-3pa(212mg，0.25mmol)，收率为98％。
[0142]
在n2保护下，于10ml反应瓶中加入tris-3pa(212mg，0.25mmol)，boc-gly(90mg，0.51mmol)，hbtu(193mg，0.51mmol)，hobt(69mg，0.51mmol)及dmf(3ml)，搅拌得到澄清溶液，加入dipea(195mg，1.51mmol)。加毕，在n2保护下室温搅拌18h。用乙酸乙酯稀释(150ml)，有机相分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤各一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后所得粗品用硅胶柱纯化，洗脱剂pe/ea＝10:1，得无色油状液体boc-gly-tris-3pa(193mg，0.19mmol)，收率76％。
[0143]
在n2保护下，将boc-gly-tris-3pa(193mg，0.19mmol)溶于3.0ml二氯甲烷，接着加入三氟乙酸(，0.75ml)。室温反应，lc-ms跟踪反应，2h后停止反应。将反应液减压下浓缩后转移至分液漏斗，加入100ml二氯甲烷，并用饱和碳酸氢钠溶液将有机层调至ph＝7-8，分离有机层，水层用二氯甲烷萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂dcm/ch3oh＝40:1，得白色固体gly-tris-3pa(151mg，0.17mmol)，收率为89％，核磁共振氢谱结果如下：
[0144]1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ7.65(s,1h),4.44(s,6h),3.28(s,2h),2.32(d,j＝15.2hz,6h),1.61(d,j＝14.2hz,6h),1.25(s,72h),0.88(d,j＝13.7hz,9h).
[0145]
实施例9.met-tris-3ma
[0146][0147]
在n2保护下，于10ml反应瓶中加入tris-3ma(212mg，0.28mmol)，boc-met(140mg，0.56mmol)，hbtu(215mg，0.56mmol)，hobt(76mg，0.56mmol)及dmf(3.5ml)，搅拌得到澄清溶液，加入dipea(230mg，1.78mmol)。加毕，在n2保护下室温搅拌18h。用乙酸乙酯稀释(150ml)，有机相分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤各一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后所得粗品用硅胶柱纯化，洗脱剂pe/ea＝10:1，得无色油状液体boc-met-tris-3ma(215mg，0.22mmol，收率78％。
[0148]
在n2保护下，将boc-met-tris-3ma(215mg，0.22mmol)溶于3.0ml二氯甲烷，接着加入三氟乙酸(0.75ml)。室温反应，lc-ms跟踪反应，2h后停止反应。将反应液减压下浓缩后转移至分液漏斗，加入200ml二氯甲烷，并用饱和碳酸氢钠溶液将有机层调至ph＝7-8，分离有机层，水层用二氯甲烷萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂二氯甲烷/ch3oh＝40:1，得白色固体met-tris-3ma(179mg，0.20mmol)，收率为91％，核磁共振氢谱结果如下：
[0149]1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ7.67(s,1h),4.43(s,6h),3.45(d,j＝12.6hz,1h),2.58(s,2h),2.32(d,j＝15.2hz,6h),2.11(s,3h),1.72(s,1h),1.61(d,j＝14.2hz,7h),1.26(s,60h),0.88(d,j＝13.7hz,9h).
[0150]
实施例10.met-tris-3la
[0151][0152]
在n2保护下，于10ml反应瓶中加入十二酸(la，220mg，1.1mmol)，boc-tris(70mg，0.31mmol)，dmap(60mg，0.49mmol)及dmf(3.5ml)，搅拌得到澄清溶液，加入edci.hcl(260mg，1.35mmol)。加毕，在n2保护下室温搅拌18h。用乙酸乙酯稀释(150ml)，有机相分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤各一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后所得粗品用硅胶柱纯化，洗脱剂pe/ea＝30:1，得无色油状液体boc-tris-3la(239mg，0.31mmol)，收率99％。
[0153]
在n2保护下，将boc-tris-3la(239mg，0.31mmol)溶于3ml二氯甲烷，接着加入三氟乙酸(0.75ml)。室温反应，lc-ms跟踪反应，2h后停止反应。将反应液减压下浓缩后转移至分液漏斗，加入120ml二氯甲烷，并用饱和碳酸氢钠溶液将有机层调至ph＝7-8，分离有机层，水层用二氯甲烷萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得无色油状液体tris-3la(197mg，0.29mmol)，收率为93％。
[0154]
在n2保护下，于10ml反应瓶中加入tris-3la(197mg，0.29mmol)，boc-met(159mg，0.60mmol)，hbtu(230mg，0.60mmol)，hobt(819mg，0.60mmol)及dmf(3.5ml)，搅拌得到澄清溶液，加入dipea(238mg，1.83mmol)。加毕，在n2保护下室温搅拌18h。用乙酸乙酯稀释(150ml)，有机相分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤各一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后所得粗品用硅胶柱纯化，洗脱剂pe/ea＝10:1，得无色油状液体boc-met-tris-3la(210mg，0.23mmol)，收率79％。
[0155]
在n2保护下，将boc-met-tris-3la(210mg，0.23mmol)溶于3.0ml二氯甲烷，接着加入三氟乙酸(0.75ml)。室温反应，lc-ms跟踪反应，2h后停止反应。将反应液减压下浓缩后转移至分液漏斗，加入100ml二氯甲烷，并用饱和碳酸氢钠溶液将有机层调至ph＝7-8，分离有机层，水层用二氯甲烷萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂dcm/ch3oh＝40:1，得白色固体met-tris-3la(157mg，0.20mmol)，收率为87％，核磁共振氢谱结果如下：
[0156]1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ7.66(s,1h),4.46(s,6h),3.45(d,j＝12.6hz,1h),2.60(d,j＝11.2hz,2h),2.34
–
2.29(m,6h),2.11(s,3h),1.76(d,j＝29.5hz,1h),1.63
(s,7h),1.26(s,48h),0.88(d,j＝13.7hz,9h).
[0157]
实施例11.met-tris-3c10
[0158][0159]
在n2保护下，于10ml反应瓶中加入癸酸(c10，228mg，1.32mmol)，boc-tris(89mg，0.40mmol)，dmap(49mg，0.40mmol)及dmf(3.5ml)，搅拌得到澄清溶液，加入edci.hcl(307mg，1.60mmol)。加毕，在n2保护下室温搅拌18h。用乙酸乙酯稀释(150ml)，有机相分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤各一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后所得粗品用硅胶柱纯化，洗脱剂pe/ea＝30:1，得无色油状液体boc-tris-3c10(156mg，0.23mmol)，收率58％。
[0160]
在n2保护下，将boc-tris-3c10(156mg，023mmol)溶于3ml二氯甲烷，接着加入三氟乙酸(0.75ml)。室温反应，lc-ms跟踪反应，2h后停止反应。将反应液减压下浓缩后转移至分液漏斗，加入120ml二氯甲烷，并用饱和碳酸氢钠溶液将有机层调至ph＝7-8，分离有机层，水层用二氯甲烷萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得无色油状液体tris-3c10(138mg，0.23mmol)，收率为99％。
[0161]
在n2保护下，于10ml反应瓶中加入tris-3c10(138mg，0.24mmol)，boc-met(125mg，0.50mmol)，hbtu(190mg，0.50mmol)，hobt(68mg，050mmol)及dmf(3.5ml)，搅拌得到澄清溶液，加入dipea(195mg，1.51mmol)。加毕，在n2保护下室温搅拌18h。用乙酸乙酯稀释(150ml)，有机相分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤各一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后所得粗品用硅胶柱纯化，洗脱剂pe/ea＝10:1，得无色油状液体boc-met-tris-3c10(165mg，0.20mmol)，收率79％。
[0162]
在n2保护下，将boc-met-tris-3c10(165mg，0.20mmol)溶于3.0ml二氯甲烷，接着加入三氟乙酸(0.75ml)。室温反应，lc-ms跟踪反应，2h后停止反应。将反应液减压下浓缩后转移至分液漏斗，加入100ml二氯甲烷，并用饱和碳酸氢钠溶液将有机层调至ph＝7-8，分离有机层，水层用二氯甲烷萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂dcm/ch3oh＝40:1，得白色固体met-tris-3c10(131mg，0.18mmol)，收率为90％，核磁共振氢谱结果如下：
[0163]1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ7.67(s,1h),4.43(d,j＝24.6hz,6h),3.45(d,j＝11.5hz,1h),2.58(d,j＝31.9hz,2h),2.32(d,j＝15.2hz,6h),2.10(s,3h),1.76(d,j＝27.6hz,1h),1.63(s,7h),1.27(d,j＝7.3hz,36h),0.89(d,j＝6.6hz,9h).
[0164]
实施例12.met-pel-3moa
[0165][0166]
在n2保护下，于500ml反应瓶中加入季戊四醇(pel，5.0g，36.6mmol)，咪唑(2.67g，38.6mmol)及无水dmf(235ml)，搅拌下逐滴加入叔丁基二甲基氯硅烷(tbdms-cl，2.94g，19.6mmol)溶于15ml无水dmf的溶液。加毕，在n2保护下室温搅拌24h。减压浓缩，用乙酸乙酯稀释(300ml)，有机相分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤各一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后所得粗品用硅胶柱纯化，洗脱剂pe/ea＝1:1，得无色油状液体(室温放置后固化)pel(tbs)(2.26g，9.02mmol)，收率46％。
[0167]
在n2保护下，于10ml反应瓶中加入pel(tbs)(65.8mg，0.26mmol)，肉豆蔻油酸(moa，198mg，0.87mmol)，dmap(32.5mg，0.26mmol)及dmf(3ml)，搅拌得到澄清溶液，加入edci.hcl(203.2mg，0.26mmol)。加毕，在n2保护下室温搅拌18h。用乙酸乙酯稀释(150ml)，有机相分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤各一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后所得粗品用硅胶柱纯化，洗脱剂pe/ea＝50:1，得无色油状液体pel(tbs)-3moa(210mg，0.24mmol)，收率92％。
[0168]
在n2保护下，将pel(tbs)-3moa(210mg，0.24mmol)，溶于5ml四氢呋喃，接着加入四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(tbaf，1m，1.5ml)以及乙酸(aa，0.5ml)。室温反应3天后减压下浓缩，用乙酸乙酯稀释(150ml)，有机相分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤各一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后所得粗品用硅胶柱纯化，洗脱剂pe/ea＝10:1，得无色油状液体pel-3moa(144mg，0.19mmol)，收率79％。
[0169]
在n2保护下，于10ml反应瓶中加入pel-3moa(144mg，0.19mmol)，boc-met(101mg，0.40mmol)，dmap(24.5mg，0.20mmol)及dmf(3ml)，搅拌得到澄清溶液，加入edci.hcl(76.7mg，0.40mmol)。加毕，在n2保护下室温搅拌18h。用乙酸乙酯稀释(150ml)，有机相分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤各一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后所得粗品用硅胶柱纯化，洗脱剂pe/ea＝10:1，得无色油状液体boc-met-pel-3moa(149mg，0.15mmol)，收率79％。
[0170]
在n2保护下，将boc-met-pel-3moa(149mg，0.15mmol)溶于3.0ml二氯甲烷，接着加入三氟乙酸(0.75ml)。室温反应，lc-ms跟踪反应，2h后停止反应。将反应液减压下浓缩后转移至分液漏斗，加入120ml二氯甲烷，并用饱和碳酸氢钠溶液将有机层调至ph＝7-8，分离有机层，水层用二氯甲烷萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用
硅胶柱纯化，洗脱剂dcm/ch3oh＝40:1，得无色油状液体met-pel-3moa(105mg，0.12mmol)，收率为80％，核磁共振氢谱结果如下：
[0171]1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ5.34(d,j＝11.8hz,6h),4.14(d,j＝15.3hz,8h),3.62(d,j＝15.5hz,1h),2.62(d,j＝14.4hz,2h),2.31(d,j＝15.1hz,6h),2.10(s,3h),2.02(s,12h),1.78(d,j＝26.5hz,2h),1.59(d,j＝6.8hz,6h),1.32(d,j＝17.4hz,36h),0.90(d,j＝14.0hz,9h).
[0172]
氨基酸脂质的细胞毒性测试
[0173]
采用ctg法考察实施例1～7所得化合物对293t细胞的毒性。取2.5
×
105cell/ml的293t细胞置于24孔板中，然后加入一定浓度的被测化合物孵育24h，转至96孔板继续培养24h后加入100μlctg和完全培养基。室温孵育10min后使用酶标仪检测540nm波长处的吸光值来计算细胞存活率，结果见图2。结果表明：所有试验的氨基酸脂质均具有较低的细胞毒性(其中mc3为onpattro制剂所用的可离子化脂质dlin-mc3-dma)。
[0174]
制备脂质纳米颗粒
[0175]
取上述实施例1～7，10～12所得的氨基酸脂质及moderna covid-19 vaccine(spikevax)中所用的可离子化脂质sm102分别与dspc、胆固醇、peg-dmg按50/10/38.5/1.5的摩尔比混合溶于无水乙醇中得到脂质溶液(a)。按氨基酸脂质和mrna的n/p＝5:1取fluc mrna溶于柠檬酸缓冲液中得到fluc mrna溶液(b)。将脂质溶液(a)与mrna溶液(b)按流速比1:3用微流控混合得产物(c)。将产物(c)用ph＝7.2～7.4的pbs缓冲液透析24h后于4℃超滤浓缩，得到包载fluc mrna的氨基酸脂质纳米颗粒atlnp 1～7，10，11，aplnp 1及sm102-lnp(mrna)。所有lnp样品包封率均大于90％。本实施例中采用的fluc mrna为trilink公司提供。包载fluc mrna的atlnp和aplnp粒径电位检测结果见表1。
[0176]
表1
[0177]
样品氨基酸脂质(atl/apl)size(nm)pdizeta potential(mv)atlnp 1met-tris-3moa(实施例1)88.30.18-5.3atlnp 2gly-tris-3moa(实施例2)66.20.09-0.7atlnp 3gly-tris-3ma(实施例3)85.00.182.4atlnp 4gly-tris-3poa(实施例4)71.10.11-0.3atlnp 5gly-tris-3doa(实施例5)62.30.16-0.7atlnp 6gly-tris-3oa(实施例6)81.60.07-0.2atlnp 7gly-tris-3lin(实施例7)84.60.130.2atlnp 10met-tris-3la(实施例10)66.80.12-4.2atlnp 11met-tris-3c10(实施例11)57.30.10-3.0aplnp 1met-pel-3moa(实施例12)79.50.22-3.6sm102-lnp(mrna)—1170.12-1.3
[0178]
取实施例1～7，9，12所合成的氨基酸脂质及moderna covid-19 vaccine(spikevax)制剂所用的可离子化脂质sm102分别与dspc、胆固醇、peg-c-dmg按50/10/38.5/1.5的摩尔比混合溶于无水乙醇中得到脂质溶液(a)。按氨基酸脂质和sirna的n/p＝5:1取sirna溶于柠檬酸缓冲液中得到sirna溶液(b)。将脂质溶液(a)与sirna溶液(b)按流速比1:3用微流控混合得产物(c)。将产物(c)用ph＝7.2-7.4的pbs缓冲液透析24h后于4℃超滤浓
缩，得到包载sirna的氨基酸脂质纳米颗粒atlnp 12～18，20)，aplnp 2及sm102-lnp(sirna)，样品包封率均大于90％。本实施例中采用的sirna序列为hmtf-25-2(us 20210324384a1)。包载sirna的atlnp和aplnp粒径电位检测结果见表2。
[0179]
表2
[0180][0181][0182]
细胞及动物实验
[0183]
取纳米颗粒atlnp 1～7，atlnp 10，atlnp 11，aplnp 1各20μg，经肌肉注射babl/c小鼠的大腿内测部位，平行三次实验。观察24h及72h两个时间点的小鼠活体成像，测量荧光强度，结果见表3。由表3可知，所有肌肉注射了atlnp 1～7，atlnp 10，atlnp 11样品的小鼠，24h后均出现荧光，说明包载mrna的atlnp能有效递送fluc mrna进入细胞，并在小鼠体内表达出荧光蛋白，肌肉注射了aplnp 1样品的小鼠，24h后出现荧光强度明显低于相应的atlnp(atlnp 1vs aplnp 1)，说明以季戊四醇为连接基团的aplnp样品递送fluc mrna进入细胞的效率低于相应的以tris为连接基团的atlnp样品。
[0184]
表3
[0185][0186]
取atlnp 1～7以及sm102-lnp(mrna)，对babl/c小鼠肌肉注射含20μg fluc mrna的atlnp样品，平行三次实验。首次给药两周后，同剂量肌肉注射加强给药一次，然后在第二次给药一周后，采集小鼠眼眶静脉丛血样100-200μl。将血样置于4℃冰箱过夜后分离血清，在酶标板上包被荧光素酶，室温过夜后，取稀释后的小鼠血清加入到酶标板上(使用荧光素酶的抗体作为阳性对照，使用磷酸盐和吐温20的混合液作为阴性对照)，充分反应后洗板，接着加入igg-hrp抗体，充分反应后洗板，然后加入tmb反应液，充分反应后加入终止液停止
反应。在酶标仪上选取450nm波长读取吸光值，对荧光素酶抗体含量进行检测，结果如图3所示。结果表明，atlnp 1～7免疫原性低于sm102-lnp或与之相当，其中atlnp 1，2，3的抗体水平显著低于sm102-lnp(mrna)，说明atlnp1，2，3免疫原性更低。
[0187]
取包载sirna的样品atlnp12～20以及aplnp 2对293t细胞进行转染，同时对比sm102-lnp(sirna)处方。24h后收集细胞总rna进行反转录并采用qpcr技术检测靶基因的mrna表达水平。tgf-β1sirna对靶基因tgf-β1mrna表达水平的敲低效果见表4。结果表明atlnp 13～18，20样品在不同浓度下对tgf-β1均有良好的基因沉默效率。而对比atlnp 12和aplnp 2对tgf-β1mrna表达的敲低效果发现：相同的氨基酸头部(met)和羧酸脂质尾部(moa)，以季戊四醇为连接基团的aplnp 21(met-pel-3moa)在不同浓度下基因沉默效率均明显低于对应的以tris为连接基团的atlnp 12(met-tris-3moa)。
[0188]
表4
[0189][0190]
包载sirna的atlnp13、atlnp15～18和sm102-lnp(sirna)的表观pka(测定方法参见hope等人，angew.chem.int.ed.,51:1,2012)及对应的基因敲低效果(kd)被测定，结果见图4。atlnp纳米颗粒的pka值在3-5之间，这表明atlnp纳米颗粒在生理ph下(ph 7)具有很低的阳离子电荷。atlnp的递送性能与表观pka值之间无明显的相关性，说明atlnp与snalp对sirna有不同的递送机理。结合atl化学结构的特性，推断氢键是atlnp系统中rna递送的主要和最重要的相互作用。
[0191]
尽管本发明描述了所述氨基酸脂质、含有其的递送系统及制备方法的某些实施例，并且出于说明的目的已经阐述了很多细节，但是本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质和原理下所做的改变，修饰，替代，组合和简化均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.通式(i)或通式(ii)所示的氨基酸脂质或其盐，其中，r1代表羧基上缺了一个羟基的氨基酸残基，其结构式为nh
2-cr-co-，r为氨基酸的r基；r2，r3，r4分别独立地为碳原子数为5～40的直链烃基。2.根据权利要求1所述的氨基酸脂质或其盐，其特征在于，所述氨基酸为甘氨酸，蛋氨酸，丝氨酸，苯丙氨酸，丙氨酸，苏氨酸，酪氨酸，羟脯氨酸，谷氨酸，赖氨酸，半胱氨酸，脯氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，色氨酸，谷氨酰胺，天冬氨酸，天冬酰胺，精氨酸或组氨酸。3.根据权利要求1所述的氨基酸脂质或其盐，其特征在于，r2，r3，r4分别独立地为碳原子数为5～40的直链烷基或含有1～3个双键的直链烯基。4.根据权利要求1所述的氨基酸脂质或其盐，其特征在于，所述氨基酸脂质或其盐为通式(i)所示化合物；和/或，r2，r3，r4相同；和/或，r2，r3，r4独立地独立地为：5.一种递送系统，其特征在于，所述的递送系统包括权利要求1至4中任一项所述的氨基酸脂质或其盐中的一种或多种。6.根据权利要求5所述的递送系统，其特征在于，所述递送系统还包括辅助脂质、胆固醇及其衍生物、peg化脂质中的一种或多种。7.根据权利要求6所述的递送系统，其特征在于，所述辅助脂质选自磷脂及其衍生物；和/或，所述peg化脂质选自peg-dmg、peg-c-dmg、peg-dspe中的一种或多种；和/或，所述氨基酸脂质或其盐、所述辅助脂质、所述胆固醇及其衍生物和所述peg化脂
质的投料摩尔比为(40～99.5):(0～15):(0～50):(0.5～3)。8.如权利要求5至7中任一项所述的递送系统在制备核酸药物中的应用。9.一种核酸药物，其特征在于，所述核酸药物包括权利要求5至7中任一项所述的递送系统和核酸分子。10.根据权利要求9所述的核酸药物，其特征在于，所述核酸分子包括信使核酸分子(mrna)、小干扰核酸分子(sirna)、微小核酸分子(mirna)、小激活核酸分子(sarna)、反义寡核苷酸分子(aso)或适配体(aptamer)中的一种或多种；和/或，所述核酸药物为粒径为50～300nm的氨基酸脂质纳米颗粒；和/或，通过微流控将所述的核酸分子与所述的氨基酸脂质或其盐、选择性地与辅助脂质、胆固醇及其衍生物、peg化脂质中的一种或多种混合自组装得到所述核酸药物；和/或，所述氨基酸脂质或其盐和所述核酸分子的氮磷摩尔比为(1～50):1；和/或，所述核酸药物还包括药学上可接受的添加剂；和/或，所述核酸药物为冻干粉剂或注射剂。

技术总结
本发明涉及一种氨基酸脂质形成的纳米递送系统及其应用。形成该氨基酸脂质纳米递送系统的可离子化脂质为通式(I)或通式(II)所示的氨基酸脂质或其盐，其中，R1代表羧基上缺了一个羟基的氨基酸残基，其结构式为NH


技术研发人员：田伟伟 项明 徐健 周诚 秦兵彬 文中行 吴军 苏琳瑛 张进 王志远 王德玲 杨宪斌 陆阳
受保护的技术使用者：圣诺生物医药技术（苏州）有限公司
技术研发日：2023.03.10
技术公布日：2023/7/31