一种串联肽及利用重组大肠杆菌同时制备多种生物活性肽的方法与流程

1.本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种串联肽及利用重组大肠杆菌同时制备多种生物活性肽的方法。具体是利用重组大肠杆菌表达含多种生物活性肽结构的串联肽，再通过蛋白酶水解串联肽，经等电点分级沉淀，同时制备多种生物活性肽的方法。


背景技术：

2.生物活性肽具有显著的生物活性和生物安全性，并广泛应用于医药、化妆品和食品等相关领域，对提高人类的生活质量有很大帮助。具体的，生物活性肽具有抗血栓、抗氧化、抗衰老和抗菌等功能。
3.caseicin b是由干酪素钠发酵产生的生物活性肽，对cronobacter sakazakii、escherichia coli、listeria innocua和streptococcus mutans等细菌具有抗菌性(appl.environ.microbiol，2006，72：2260-2264)，目前以微波辅助固相多肽合成法(mw-spps)进行制备(appl.environ.microbiol，2011，77：2496-2501)。
4.chk是发现自人血浆的一种三肽，具有促进神经元细胞、神经胶质细胞、巨噬细胞、肥大细胞、纤维母细胞和淋巴细胞的生长(amino acids，1997，13：155-161)，此外还对staphylococcus aureus、pseudomonas aeruginosa和candida albicans具有抗菌活性(int j pept res ther，2015，21：21-28)。
5.darobactin a和darobactin b是两种7肽，可选择性杀死革兰氏阳性菌，它们作用的靶点均为外膜蛋白bama(microbiol spectr，2021，9：e0153521)。目前，darobactin a和darobactin b分别由photorhabdus khani外源表达制备获得。
6.pug-3是一种具有抑制streptococcus mutans黏附作用的4肽，此外，其还能抑制人类角质细胞hacat细胞的生长(lett appl microbiol，2020，70：151-158)。
7.目前制备生物活性肽的方法主要有以下几种：水解法，以牛奶、动物肉类、玉米、小麦、大豆和鸡蛋等为原料，进行酶水解或微生物发酵降解，获得相关生物活性肽；化学合成，以各种氨基酸为原料，通过液相法、固相法或液相固相混合法合成生物活性肽；基因工程法，通过微生物外源表达目的生物活性肽基因制备相应的生物活性肽。水解法优点在于原料来源简单便宜，成本低，但水解产物杂质多，特定生物活性肽收率低。化学合成法过程中需要对氨基酸进行保护和脱保护，收率低且环境不友好。基因工程法具有目的生物活性肽产量大、易纯化的优点，但在短肽制备方面的应用较少。目前有通过多拷贝串联dna的克隆技术来生产短肽，其中李爽等在专利申请cn112608933a中利用大肠杆菌工程菌表达串联短肽，再经酶切制备ghk。但目前还未有一种利用基因工程技术，同时制备多种生物活性肽的方法。


技术实现要素：

8.为了解决现有技术中存在的问题，本发明通过构建大肠杆菌工程菌来表达串联多
肽序列，可以同时制备获得两种或两种以上不同的生物活性肽。
9.本发明提供如下的技术方案：
10.一种串联肽，为[p
1 p2]n、[p1]
n1-[p2]
n2
、his-tag-a-[p
1 p2]n、his-tag-a-[p1]
n1-[p2]
n2
、[p
1 p
2 p3]m、[p1]
m1-[p2]
m2-[p3]
m3
、his-tag-a-[p
1 p
2 p3]m或his-tag-a-[p1]
m1-[p2]
m2-[p3]
m3
。
[0011]
其中n为20～30之间的整数且包含20和30，n1和n2为9～60之间的整数且包含9和60。
[0012]
m为15～20之间的整数且包含15和20，m1、m2和m3为10～40之间的整数且包含10和40。
[0013]
his-tag为组氨酸标签，a为一个氨基酸残基，且选自lys、arg、phe、tyr或trp。
[0014]
p1、p2和p3为氨基酸残基数为3～8之间且包含3和8的生物活性肽，p1、p2和p3的c端氨基酸残基选自lys、arg、phe、tyr或trp，在p1、p2和p3序列中的其它剩余氨基酸残基均不与c端氨基酸残基相同，同时p1、p2和p3的等电点pi值相互之间的差值≥2。
[0015]
本发明提供了一种表达所述串联肽的载体。
[0016]
本发明提供了一种含有表达串联肽的载体的重组菌株，所述重组菌株优选为大肠杆菌。更为优选为pet-28a(+)、pet-30a(+)或pet-32a(+)等。
[0017]
本发明提供了一种利用重组大肠杆菌同时制备多种生物活性肽的方法，构建大肠杆菌工程菌表达串联多肽序列，所表达的串联多肽分别经过硫酸铵沉淀或镍柱纯化、蛋白酶酶切和等电点分级沉淀，同时制备获得多种生物活性肽。
[0018]
在一个优选的技术方案中，本发明采用如下技术方案：
[0019]
一种利用重组大肠杆菌同时制备多种生物活性肽的方法，包括步骤：
[0020]
(1)以2种以上生物活性肽氨基酸序列为基础设计串联肽序列；
[0021]
(2)构建串联肽序列重组表达载体；
[0022]
(3)将重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，构建表达串联肽的重组大肠杆菌；
[0023]
(4)培养重组大肠杆菌，并诱导其表达串联肽；
[0024]
(5)培养产物离心取菌体，破碎菌体，取破碎液上清；
[0025]
(6)破碎上清进行硫酸铵沉淀或镍柱纯化，获得纯化串联肽或串联肽溶液；
[0026]
(7)蛋白酶酶切串联肽，获得单体肽；
[0027]
(8)等电点分级沉淀，分别制备得到各生物活性肽。
[0028]
优选的，所述生物活性肽为2或3种。
[0029]
其中，优选的，步骤(1)中所述串联肽序列需满足以下通式之一：[p
1 p2]n、[p1]
n1-[p2]
n2
、his-tag-a-[p
1 p2]n、his-tag-a-[p1]
n1-[p2]
n2
、[p
1 p
2 p3]m、[p1]
m1-[p2]
m2-[p3]
m3
、his-tag-a-[p
1 p
2 p3]m或his-tag-a-[p1]
m1-[p2]
m2-[p3]
m3
。
[0030]
其中n为20～30之间的整数且包含20和30，n1和n2为9～60之间的整数且包含9和60。
[0031]
m为15～20之间的整数且包含15和20，m1、m2和m3为10～40之间的整数且包含10和40。
[0032]
his-tag为组氨酸标签，a为一个氨基酸残基，且选自lys、arg、phe、tyr或trp。
[0033]
p1、p2和p3为氨基酸残基数为3～8之间且包含3和8的生物活性肽，p1、p2和p3的c端
氨基酸残基选自lys、arg、phe、tyr或trp，在p1、p2和p3序列中的其它剩余氨基酸残基均不与c端氨基酸残基相同，同时p1、p2和p3的等电点pi值相互之间的差值≥2。
[0034]
优选的，在步骤(1)中，所述的生物活性肽选自ghk、caseicin b(seq id no:9vlnenllr)、darobactin a(seq id no:10wnwsksf)、darobactin b(seq id no:11wnwtkrf)和pug-3(lgty)等。
[0035]
优选的，在步骤(2)中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体；更为优选为pet-28a(+)、pet-30a(+)或pet-32a(+)等。
[0036]
优选的，在步骤(2)中，表达载体构建中，串联肽对应核苷酸序列5
′
端添加起始密码子atg。
[0037]
优选的，在步骤(3)中，所述大肠杆菌为e.coli bl21、e.coli bl21(de3)、e.coli bl21(de3)plys、e.coli jm109或e.coli jm109(de3)等。
[0038]
优选的，在步骤(4)中，所述诱导表达串联肽过程所用诱导剂为iptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)或乳糖；进一步iptg诱导浓度为0.1～1.0mm，乳糖诱导浓度为10～25g/l。
[0039]
优选的，在步骤(4)中，所述诱导条件为25～30℃，180～220rpm诱导10～20h。
[0040]
优选的，在步骤(5)中，所述破碎菌体所采用的方法为高压匀浆法。
[0041]
优选的，在步骤(5)中，所述破碎菌体条件为菌浓为10～30％，4～25℃，550～800bar。
[0042]
优选的，在步骤(6)中，所述硫酸铵沉淀过程为用40～60％饱和度硫酸铵沉淀菌体破碎液上清，0～25℃静置1～3h。离心取上清，在上清中添加硫酸铵至80～90％饱和度于0～25℃静置1～3h，再次沉淀，沉淀获得纯化串联肽。
[0043]
优选的，在步骤(6)中，所述串联肽带有his-tag时，选用镍柱纯化。
[0044]
优选的，在步骤(6)中，所述镍柱纯化过程中，优选的洗脱缓冲液含200～600mm咪唑，8-25mm tris-base(三羟甲基氨基甲烷)，0.2-0.6m nacl，洗脱液的ph为6-8，洗脱液用3～10kda超滤膜超滤除盐浓缩，浓缩液即为纯化串联肽溶液。
[0045]
优选的，在步骤(7)中，由步骤(6)中所得到的纯化串联肽和串联肽溶液用ph6.0～8.0的0.05～0.1m磷酸钾盐缓冲液重悬或调节ph值，或者用ph4.0～8.0的0.05～0.1m磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液重悬或调节ph值。
[0046]
优选的，在步骤(7)中，所述蛋白酶为α-胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶或菠萝蛋白酶。
[0047]
优选的，在步骤(7)中，所述蛋白酶添加量为1～5％。
[0048]
优选的，在步骤(7)中，水解反应温度为20～40℃，ph值为5.0～8.0，时间为1～5h。
[0049]
优选的，在步骤(8)中，等电点分级沉淀过程中调节ph所用试剂为氨水和醋酸。
[0050]
优选的，在步骤(8)中，等电点分级沉淀ph值为5～6、8～9或10～11。
[0051]
本发明相较于现有技术具有如下优点和效果：
[0052]
(1)本发明通过设计含多种生物活性肽结构的串联肽，并利用重组大肠杆菌对其进行表达，再通过蛋白酶水解及等电点分级沉淀等方法，实现了高效、快捷的同时制备得到多种生物活性肽。同时，本发明利用因工程法可以同时制备得到多种生物活性短肽，并且制备得到的生物活性短肽具有目的生物活性肽产量大、易纯化的优点，为短肽活性多肽的工业化生产提供了一种有效的策略。
附图说明
[0053]
图1是实例1中所构建的表达载体pet-28a-[ghkvlnenllr]
28
结构示意图。
[0054]
图2是实例2中所构建的表达载体pet-28a-[ghk]
51-[vlnenllr]
20
结构示意图。
[0055]
图3是实例3中所构建的表达载体pet-28a-his-tag-lys-[ghkvlnenllr]
28
结构示意图。
[0056]
图4是实例4中所构建的表达载体pet-28a-his-tag-lys-[ghk]
51-[vlnenllr]
20
结构示意图。
[0057]
图5是实例5中所构建的表达载体pet-28a-[wnwsksfwnwtkrflgty]
17
结构示意图。
[0058]
图6是实例6中所构建的表达载体pet-28a-[wnwsksf]
15-[wnwtkrf]
15-[lgty]
30
结构示意图。
[0059]
图7是实例7中所构建的表达载体pet-28a-his-tag-phe-[wnwsksfwnwtkrflgty]
17
结构示意图。
[0060]
图8是实例8中所构建的表达载体pet-28a-his-tag-phe-[wnwsksf]
15-[wnwtkrf]
15-[lgty]
30
结构示意图。
具体实施方式
[0061]
下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步的详细描述，但本发明不限于这些实施例：
[0062]
下述实施例中所使用的试验方法若无特殊说明均为常规方法。
[0063]
下述实施例中所使用材料、试剂等，若无特殊说明，则均可通过商业途径获取。
[0064]
实施例1
[0065]
选取生物活性肽ghk和caseicin b，设计符合公式[p
1 p2]n的串联多肽序列，即[ghkvlnenllr]
28
，对应核苷酸序列见seq id no：1，在核苷酸序列5
′
端和3
′
端添加atg和tag后插入到表达载体pet-28a(+)中，构建成表达载体pet-28a-[ghkvlnenllr]
28
。将表达载体转化e.coli bl21(de3)感受态细胞，获得工程菌e.coli bl21(de3)-[ghkvlnenllr]
28
。
[0066]
将e.coli bl21(de3)-[ghkvlnenllr]
28
单菌落接种于50ml含50mg/l卡那霉素的无菌lb培养基中，37℃，200rpm培养10h，即为种子液。
[0067]
将种子液以1％接种量接种于500ml含50mg/l卡那霉素的无菌tb培养基中，37℃，200rpm培养2h。培养基中加入终浓度为0.5mm的iptg，并于25℃，200rpm诱导16h。
[0068]
培养液离心弃上清，沉淀用纯水重悬制备成20％的菌悬液，菌悬液在4℃，800bar下高压匀浆破碎两次，获得菌体破碎液。
[0069]
将菌体破碎液离心取上清，在4℃下向上清中缓慢添加硫酸铵粉末，直至硫酸铵浓度达到50％饱和度，于4℃下静置2h，离心取上清。在4℃下向上清中缓慢添加硫酸铵粉末，直至硫酸铵浓度达到80％饱和度，于4℃下静置2h，离心取沉淀获得纯化串联肽。
[0070]
ph 8.0的0.1m磷酸钾盐缓冲液重悬纯化串联肽，纯化肽浓度为50％，再加入2.5％的胰蛋白酶，在37℃下孵育4h，于4℃下离心取上清。上清于4℃下用氨水调节ph至9.0，静置4h，离心沉淀冻干后获得单体ghk。上清于4℃下用醋酸调节ph至6.0，静置4h，离心沉淀冻干后获得单体caseicin b。最终获得3.95mg ghk和11.05mg caseicin b。
[0071]
实施例2
[0072]
选取生物活性肽ghk和caseicin b，设计符合公式[p1]
n1-[p2]
n2
的串联多肽序列，即[ghk]
51-[vlnenllr]
20
，对应核苷酸序列见seq id no：2，在核苷酸序列5
′
端和3
′
端添加atg和tag后插入到表达载体pet-28a(+)中，构建成表达载体pet-28a-[ghk]
51-[vlnenllr]
20
。将表达载体转化e.coli bl21(de3)感受态细胞，获得工程菌e.coli bl21(de3)-[ghk]
51-[vlnenllr]
20
。
[0073]
将e.coli bl21(de3)-[ghk]
51-[vlnenllr]
20
单菌落接种于50ml含50mg/l卡那霉素的无菌lb培养基中，37℃，200rpm培养10h，即为种子液。
[0074]
将种子液以1％接种量接种于500ml含50mg/l卡那霉素的无菌tb培养基中，37℃，200rpm培养2h。培养基中加入终浓度为0.1mm的iptg，并于28℃，200rpm诱导14h。
[0075]
培养液离心弃上清，沉淀用纯水重悬制备成20％的菌悬液，菌悬液在4℃，800bar下高压匀浆破碎两次，获得菌体破碎液。
[0076]
将菌体破碎液离心取上清，在4℃下向上清中缓慢添加硫酸铵粉末，直至硫酸铵浓度达到48％饱和度，于4℃下静置2h，离心取上清。在4℃下向上清中缓慢添加硫酸铵粉末，直至硫酸铵浓度达到85％饱和度，于4℃下静置2h，离心取沉淀获得纯化串联肽。
[0077]
ph 8.0的0.1m磷酸钾盐缓冲液重悬纯化串联肽，纯化肽浓度为50％，再加入2.5％的胰蛋白酶，在37℃下孵育4h，于4℃下离心取上清。上清于4℃下用氨水调节ph至9.0，静置4h，离心沉淀冻干后获得单体ghk。上清于4℃下用醋酸调节ph至6.0，静置4h，离心沉淀冻干后获得单体caseicin b。最终获得10.06mg ghk和8.23mg caseicin b。
[0078]
实施例3
[0079]
选取生物活性肽ghk和caseicin b，设计符合公式his-tag-a-[p
1 p2]n的串联多肽序列，即his-tag-lys-[ghkvlnenllr]
28
，对应核苷酸序列见seq id no：3，在核苷酸序列5
′
端和3
′
端添加atg和tag后插入到表达载体pet-28a(+)中，构建成表达载体pet-28a-his-tag-lys-[ghkvlnenllr]
28
。将表达载体转化e.coli bl21(de3)感受态细胞，获得工程菌e.coli bl21(de3)-his-tag-lys-[ghkvlnenllr]
28
。
[0080]
将e.coli bl21(de3)-his-tag-lys-[ghkvlnenllr]
28
单菌落接种于50ml含50mg/l卡那霉素的无菌lb培养基中，37℃，200rpm培养10h，即为种子液。
[0081]
将种子液以1％接种量接种于500ml含50mg/l卡那霉素的无菌tb培养基中，37℃，200rpm培养2h。培养基中加入终浓度为0.5mm的iptg，并于25℃，200rpm诱导16h。
[0082]
培养液离心弃上清，沉淀用ph 7.9含0.5m nacl、20mm tris-base和5mm咪唑的缓冲液重悬制备成20％的菌悬液，菌悬液在4℃，800bar下高压匀浆破碎两次，获得菌体破碎液。
[0083]
将菌体破碎液离心取上清，利用cytiva histrap ff对上清进行纯化，洗脱液为ph 7.9含0.5m nacl、20mm tris-base和500mm咪唑的缓冲液。洗脱液用5kda超滤膜超滤除盐浓缩，获得纯化串联肽溶液。
[0084]
用0.1m磷酸钾盐缓冲液调节纯化串联肽溶液ph到8.0，以串联肽∶胰蛋白酶＝20∶1的量向串联肽溶液中添加胰蛋白酶，在37℃下孵育4h，于4℃下离心取上清。上清于4℃下用氨水调节ph至9.0，静置4h，离心沉淀冻干后获得单体ghk。上清于4℃下用醋酸调节ph至6.0，静置4h，离心沉淀冻干后获得单体caseicin b。最终获得4.56mg ghk和12.27mg caseicin b。
[0085]
实施例4
[0086]
选取生物活性肽ghk和caseicin b，设计符合公式his-tag-a-[p1]
n1-[p2]
n2
的串联多肽序列，即his-tag-lys-[ghk]
51-[vlnenllr]
20
，对应核苷酸序列见seq id no：4，在核苷酸序列5
′
端和3
′
端添加atg和tag后插入到表达载体pet-28a(+)中，构建成表达载体pet-28a-his-tag-lys-[ghk]
51-[vlnenllr]
20
。将表达载体转化e.coli bl21(de3)感受态细胞，获得工程菌e.coli bl21(de3)-his-tag-lys-[ghk]
51-[vlnenllr]
20
。
[0087]
将e.coli bl21(de3)-his-tag-lys-[ghk]
51-[vlnenllr]
20
单菌落接种于50ml含50mg/l卡那霉素的无菌lb培养基中，37℃，200rpm培养10h，即为种子液。
[0088]
将种子液以1％接种量接种于500ml含50mg/l卡那霉素的无菌tb培养基中，37℃，200rpm培养2h。培养基中加入终浓度为0.1mm的iptg，并于28℃，200rpm诱导14h。
[0089]
培养液离心弃上清，沉淀用ph 7.9含0.5m nacl、20mm tris-base和5mm咪唑的缓冲液重悬制备成20％的菌悬液，菌悬液在4℃，800bar下高压匀浆破碎两次，获得菌体破碎液。
[0090]
将菌体破碎液离心取上清，利用cytiva histrap ff对上清进行纯化，洗脱液为ph 7.9含0.5m nacl、20mm tris-base和500mm咪唑的缓冲液。洗脱液用5kda超滤膜超滤除盐浓缩，获得纯化串联肽溶液。
[0091]
用0.1m磷酸钾盐缓冲液调节纯化串联肽溶液ph到8.0，以串联肽∶胰蛋白酶＝20∶1的量向串联肽溶液中添加胰蛋白酶，在37℃下孵育4h，于4℃下离心取上清。上清于4℃下用氨水调节ph至9.0，静置4h，离心沉淀冻干后获得单体ghk。上清于4℃下用醋酸调节ph至6.0，静置4h，离心沉淀冻干后获得单体caseicin b。最终获得11.54mg ghk和9.73mg caseicin b。
[0092]
实施例5
[0093]
选取生物活性肽darobactin a、darobactin b和pug-3，设计符合公式[p
1 p
2 p3]m的串联多肽序列，即[wnwsksfwnwtkrflgty]
17
，对应核苷酸序列见seq id no：5，在核苷酸序列5
′
端和3
′
端添加atg和tag后插入到表达载体pet-28a(+)中，构建成表达载体pet-28a-[wnwsksfwnwtkrflgty]
17
。将表达载体转化e.coli bl21(de3)感受态细胞，获得工程菌e.coli bl21(de3)-[wnwsksfwnwtkrflgty]
17
。
[0094]
将e.coli bl21(de3)-[wnwsksfwnwtkrflgty]
17
单菌落接种于50ml含50mg/l卡那霉素的无菌lb培养基中，37℃，200rpm培养10h，即为种子液。
[0095]
将种子液以1％接种量接种于500ml含50mg/l卡那霉素的无菌tb培养基中，37℃，200rpm培养2h。培养基中加入终浓度为0.3mm的iptg，并于28℃，200rpm诱导14h。
[0096]
培养液离心弃上清，沉淀用纯水重悬制备成20％的菌悬液，菌悬液在4℃，800bar下高压匀浆破碎两次，获得菌体破碎液。
[0097]
将菌体破碎液离心取上清，在4℃下向上清中缓慢添加硫酸铵粉末，直至硫酸铵浓度达到56％饱和度，于4℃下静置2h，离心取上清。在4℃下向上清中缓慢添加硫酸铵粉末，直至硫酸铵浓度达到90％饱和度，于4℃下静置2h，离心取沉淀获得纯化串联肽。
[0098]
ph 7.0的0.1m磷酸钾盐缓冲液重悬纯化串联肽，纯化肽浓度为50％，再加入2％的无花果蛋白酶，在25℃下孵育6h，于4℃下离心取上清。上清于4℃下用氨水调节ph至8.8，静置4h，离心沉淀冻干后获得单体darobactin a。上清于4℃下用氨水调节ph至11.0，静置4h，
7.9含0.5m nacl、20mm tris-base和500mm咪唑的缓冲液。洗脱液用5kda超滤膜超滤除盐浓缩，获得纯化串联肽溶液。
[0112]
用0.1m磷酸钾盐缓冲液调节纯化串联肽溶液ph到7.0，以串联肽∶无花果蛋白酶＝25∶1的量向串联肽溶液中添加无花果蛋白酶，在25℃下孵育6h，于4℃下离心取上清。上清于4℃下用氨水调节ph至8.8，静置4h，离心沉淀冻干后获得单体darobactin a。上清于4℃下用氨水调节ph至11.0，静置4h，离心沉淀冻干后获得单体darobactin b。上清于4℃下用醋酸调节ph至5.5，静置4h，离心沉淀冻干后获得单体pug-3。最终获得4.97mgdarobactin a，4.35mg darobactin b和2.51mg pug-3。
[0113]
实施例8
[0114]
选取生物活性肽darobactin a、darobactin b和pug-3，设计符合公式[p1]
m1-[p2]
m2-[p3]
m3
的串联多肽序列，即his-tag-phe-[wnwsksf]
15-[wnwtkrf]
15-[lgty]
30
，对应核苷酸序列见seq id no：8，在核苷酸序列5
′
端和3
′
端添加atg和tag后插入到表达载体pet-28a(+)中，构建成表达载体pet-28a-his-tag-phe-[wnwsksf]
15-[wnwtkrf]
15-[lgty]
30
。将表达载体转化e.coli bl21(de3)感受态细胞，获得工程菌e.coli bl21(de3)-his-tag-phe-[wnwsksf]
15-[wnwtkrf]
15-[lgty]
30
。
[0115]
将e.coli bl21(de3)-his-tag-phe-[wnwsksf]
15-[wnwtkrf]
15-[lgty]
30
单菌落接种于50ml含50mg/l卡那霉素的无菌lb培养基中，37℃，200rpm培养10h，即为种子液。
[0116]
将种子液以1％接种量接种于500ml含50mg/l卡那霉素的无菌tb培养基中，37℃，200rpm培养2h。培养基中加入终浓度为0.5mm的iptg，并于28℃，200rpm诱导14h。
[0117]
培养液离心弃上清，沉淀用ph 7.9含0.5m nacl、20mm tris-base和5mm咪唑的缓冲液重悬制备成20％的菌悬液，菌悬液在4℃，800bar下高压匀浆破碎两次，获得菌体破碎液。
[0118]
将菌体破碎液离心取上清，利用cytiva histrap ff对上清进行纯化，洗脱液为ph 7.9含0.5m nacl、20mm tris-base和500mm咪唑的缓冲液。洗脱液用5kda超滤膜超滤除盐浓缩，获得纯化串联肽溶液。
[0119]
用0.1m磷酸钾盐缓冲液调节纯化串联肽溶液ph到7.0，以串联肽∶胰蛋白酶＝25∶1的量向串联肽溶液中添加胰蛋白酶，在25℃下孵育6h，于4℃下离心取上清。上清于4℃下用氨水调节ph至8.8，静置4h，离心沉淀冻干后获得单体darobactin a。上清于4℃下用氨水调节ph至11.0，静置4h，离心沉淀冻干后获得单体darobactin b。上清于4℃下用醋酸调节ph至5.5，静置4h，离心沉淀冻干后获得单体pug-3。最终获得4.63mg darobactin a，4.27mg darobactin b和4.34mg pug-3。

技术特征：
1.一种串联肽，为[p
1 p2]
n
、[p1]
n1-[p2]
n2
、his-tag-a-[p
1 p2]
n
、his-tag-a-[p1]
n1-[p2]
n2
、[p
1 p
2 p3]
m
、[p1]
m1-[p2]
m2-[p3]
m3
、his-tag-a-[p
1 p
2 p3]
m
或his-tag-a-[p1]
m1-[p2]
m2-[p3]
m3
，其中：p1、p2和p3为氨基酸残基数为3～8之间且包含3和8的生物活性肽，p1、p2和p3的c端氨基酸残基选自lys、arg、phe、tyr或trp，在p1、p2和p3序列中的其它剩余氨基酸残基均不与c端氨基酸残基相同，同时p1、p2和p3的等电点pi值相互之间的差值≥2，n为20～30之间的整数且包含20和30，n1和n2为9～60之间的整数且包含9和60，m为15～20之间的整数且包含15和20，m1、m2和m3为10～40之间的整数且包含10和40，his-tag为组氨酸标签，a为一个氨基酸残基，且选自lys、arg、phe、tyr或trp。2.一种表达权利要求1所述的串联肽的载体。3.一种含有权利要求2所述的表达串联肽的载体的重组菌株，所述重组菌株优选为大肠杆菌。4.根据权利要求3所述的大肠杆菌，为pet-28a(+)、pet-30a(+)或pet-32a(+)。5.一种利用重组大肠杆菌同时制备多种生物活性肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以2种以上生物活性肽氨基酸序列为基础设计权利要求1所述的串联肽序列；(2)构建串联肽序列重组表达载体；(3)将重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，构建表达串联肽的重组大肠杆菌；(4)培养重组大肠杆菌，并诱导其表达串联肽；(5)培养产物离心取菌体，破碎菌体，取破碎液上清；(6)破碎上清进行硫酸铵沉淀或镍柱纯化，获得纯化串联肽或串联肽溶液；(7)蛋白酶酶切串联肽，获得单体肽；(8)等电点分级沉淀，分别制备得到各生物活性肽。6.根据权利要求5所述的制备方法，在所述步骤(1)中，所述的生物活性肽选自ghk、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11和lgty。7.根据权利要求5所述的制备方法，在所述步骤(2)中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，表达载体构建中，串联肽对应核苷酸序列5
′
端添加起始密码子atg。8.根据权利要求5所述的制备方法，在所述步骤(3)中，所述大肠杆菌为e.coli bl21、e.coli bl21(de3)、e.coli bl21(de3)plys、e.coli jm109或e.coli jm109(de3)。9.根据权利要求5所述的制备方法，在所述步骤(4)中，所述诱导表达串联肽过程所用诱导剂为iptg或乳糖；进一步iptg诱导浓度为0.1～1.0mm，乳糖诱导浓度为10～25g/l，所述诱导条件为25～30℃，180～220rpm诱导10～20h。10.根据权利要求5所述的制备方法，在所述步骤(5)中，所述破碎菌体所采用的方法为高压匀浆法，所述破碎菌体条件为菌浓为10～30％，4～25℃，550～800bar。11.根据权利要求5所述的制备方法，在所述步骤(6)中，所述硫酸铵沉淀过程为用40～60％饱和度硫酸铵沉淀菌体破碎液上清，0～25℃静置1～3h。离心取上清，在上清中添加硫酸铵至80～90％饱和度于0～25℃静置1～3h，再次沉淀，沉淀获得纯化串联肽，所述串联肽带有his-tag时，选用镍柱纯化，所述镍柱纯化过程中，洗脱缓冲液含200～600mm咪唑，洗脱
液用3～10kda超滤膜超滤除盐浓缩，浓缩液即为纯化串联肽溶液。12.根据权利要求5所述的制备方法，在所述步骤(7)中，由步骤(6)中所得到的纯化串联肽和串联肽溶液用ph6.0～8.0的0.05～0.1m磷酸钾盐缓冲液重悬或调节ph值，或者用ph4.0～8.0的0.05～0.1m磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液重悬或调节ph值，所述蛋白酶为α-胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶或菠萝蛋白酶，所述蛋白酶添加量为1～5％，水解反应温度为20～40℃，ph值为5.0～8.0，时间为1～5h。13.根据权利要求5所述的制备方法，在所述步骤(8)中，等电点分级沉淀过程中调节ph所用试剂为氨水和醋酸，等电点分级沉淀ph值为5～6、8～9或10～11。

技术总结
本发明公开了一种串联肽及利用重组大肠杆菌同时制备多种生物活性肽的方法，涉及基因工程领域。所述制备方法利用重组大肠杆菌表达含多种生物活性肽结构的串联肽，该串联肽结构符合特定公式。串联肽经过硫酸铵沉淀法纯化或镍柱纯化，再通过蛋白酶水解获得单体肽混合液。单体肽混合溶液经过等电点分级沉淀，分别获得相应的生物活性肽。该法可同时制备生物活性肽GHK和Caseicin B，也可同时制备生物活性肽Darobactin A、Darobactin B和Pug-3。3。


技术研发人员：柴保中 胡海峰 岑昊聪
受保护的技术使用者：安徽普利药业有限公司
技术研发日：2023.03.10
技术公布日：2023/7/31