超声辅助离子液体与酶法提取温郁金中姜黄素类成分的方法

1.本发明属于中医药技术领域，尤其是中药成分提取领域，具体涉及超声辅助离子液体与酶法提取温郁金中姜黄素类成分方法。


背景技术：

2.温郁金为姜科姜黄属植物温郁金(curcuma wenyujin y.h.chen et c.ling)的干燥块根，其干燥根茎为“温莪术”，主要分布于我国浙江瑞安，是温州地区唯一的“浙八味”道地药材。中医学认为温郁金具有活血止痛、行气解郁、清心凉血、利胆退黄之功效，主要用于治疗胸胁刺痛，胸痹心痛，经闭痛经，乳房胀痛，热病神昏，癫痫发狂，血热吐衄，黄疸尿赤等症状。现代研究表明，温郁金中含有的主要化学成分为姜黄素类、挥发油、多糖等，其中姜黄素、去甲氧基姜黄素及去二甲氧基姜黄素是温郁金中所含有的3个重要的姜黄素类化合物，具有降血脂、抗炎、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抑菌等多种药理作用和生物活性。
3.姜黄素类化合物，为橙黄色结晶粉末，味稍苦，不溶于水，易溶于乙醇、丙酮、碱液等溶剂，对热稳定，但在光照和碱性环境中不稳定。该类化合物主要由姜黄素(约为70％)、去甲氧基姜黄素(约为10％～20％)和去二甲氧基姜黄素(约为10％)组成，其分子结构式如图1所示。姜黄素类可用于预防和治疗肿瘤，对结肠癌、乳腺癌、肝癌等多种肿瘤细胞的产生、增值、转移均具有抑制作用；在食品工业中作为食品添加剂，用于肠类制品、罐头、酱卤制品、咖喱粉等产品的着色。由于姜黄素类的安全性，使之成为目前国内外食品和药品行业广泛使用的天然色素之一。
4.姜黄素类成分具有疏水性，多采用有机溶剂提取，但是传统试剂具有较大挥发性、高毒性等缺点。酶法提取利用利用酶促反应，加速细胞壁结构的破坏，促进姜黄素释放，从而提高姜黄素得率。由于酶的特性，酶的选择尤为重要。根据我们的研究，酶法的得率略高于溶剂提取，但是该结果并不显著；由于酶对温度的限制和在乙醇中酶活性降低，酶法反而增加提取步骤、延长了提取时间。目前已经开发出以离子溶液作为绿色溶剂来提取姜黄素类成分的方法，这些离子溶液具有低挥发性、高热稳定性、粘度可调等特点，还具有溶解纤维素、破坏细胞壁的作用。离子液体是指全部由离子组成的液态物质。与传统溶剂相比，离子液体无色无味、溶解度好、热稳定性好、易于回收等优点。在电化学、有机合成、萃取分离方面等具有良好的效果，是一种能替代传统有机溶剂的新型绿色溶剂，但是离子液体合成工艺复杂、纯化步骤繁多导致其生产成本较高。酶法提取往往只作为一种辅助手段，大多数活性成分提取一般采用酶复合多种技术，提取效果也更好。有研究表明，离子液体能够有效稳定酶-底物的过渡态，降低反应活化能，使酶表现出较高的催化活性，因此酶法协同离子液体提取进一步促进细胞壁结构的分解，提高提取效率，减少了离子液体的使用，降低了成本，又以超声波辅助加快有效物质溶出，缩短提取时间，提高得率。


技术实现要素：

5.针对上述背景技术中存在的问题，本发明设计的目的在于提供一种超声辅助离子
液体与酶法提取温郁金中姜黄素类成分的方法。
6.具体通过以下技术方案加以实现：
7.超声辅助离子液体与酶法提取温郁金中姜黄素类成分的方法，包括以下步骤：
8.1)将温郁金鲜品洗净，晾干，粉碎过80～100目筛，得到温郁金粉体；
9.2)依次向温郁金粉体中，加入酶及离子液体水溶液，混匀，超声，得混合液体；其中，加入的酶与温郁金粉体的质量比为1～3∶10；温郁金粉体与加入的离子液体水溶液的比为1∶1～3(w/v)；
10.3)向混合液体中加入无水乙醇，混匀，超声，离心取上清液；其中，无水乙醇加入量与离子液体水溶液的体积比为7～9：1～3
11.4)回收上清液中的乙醇，加入石油醚萃取，萃取后回收石油醚，加入酸性乙醇溶解，得到萃取物样品；
12.5)将萃取物样品加入到已处理好的大孔吸附树脂柱上，酸性乙醇冲柱1～3h使样品吸附，之后使用85％～95％乙醇解吸附1～3h，收集解吸附液，浓缩制得浓缩物；
13.6)将浓缩物冷冻干燥，制得姜黄素类成分提取物。
14.进一步地，步骤2)中，所述的酶为α-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、纤维素酶、葡萄糖淀粉酶、果胶酶、半纤维素酶中的一种或多种。
15.进一步地，步骤2)中，离子液体中阳离子为1-乙基-3-甲基咪唑阳离子、1-丁基-3-甲基咪唑阳离子、1-己基-3-甲基咪唑阳离子、1-辛基-3-甲基咪唑阳离子中的任一种，阴离子为cl-、pf
6-、bf
4-、oac-中的任一种。
16.进一步地，步骤2)中，离子液体水溶液的浓度为10％～30％(w/v)，ph为3.0～6.0。
17.进一步地，步骤2)中超声条件为：时间0.5～2h、功率120～350w、温度30～60℃。
18.进一步地，步骤3)中超声条件为：时间5～30min、功率120～350w、温度25～80℃。
19.进一步地，步骤4)中酸性乙醇是指乙醇浓度为70％～80％(v/v)，ph为2～6。
20.进一步地，步骤5)中，酸性乙醇的流速为1～3bv/h，乙醇解吸附液流速为2～5bv/h。
21.本发明结合酶法和离子液体提取开发了超声辅助离子液体与酶法提取技术，具有高效、绿色、经济的优点，可用于高效液相色谱法进行检测与鉴定样品。该方法不仅实现了活性成分的高效提取，也减少了甲醇、二氯乙烷、丙酮等有机试剂的使用，整个过程中所用的石油醚可循环使用。与有机溶剂提取和酶辅助提取相比，本发明方法具有更高的得率。本发明方法工艺简单、环境友好，具有良好的发展前景。
附图说明
22.图1为两黄素类成分分子结构式：姜黄素r1＝r2＝-och3；去甲氧基姜黄素r1＝-och3，r2＝-h；去二甲氧基姜黄素r1＝r2＝-h；
23.图2为hplc色谱：a为混合标准品溶液、b为样品；
24.图3为3种提取方式对两黄素类成分得率的影响；
25.图4为响应面分析结果示意图。
具体实施方式
26.以下结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，以便更好地理解本技术方案。
27.实施例1：温郁金中姜黄素类成分的提取
28.步骤一：将温郁金鲜品洗净，晾干，粉碎过100目筛，得到温郁金粉体；
29.步骤二：向温郁金粉体中，加入纤维素酶，加入的酶与温郁金粉体的质量比为2∶10；
30.步骤三：加入20％[bmim]br水溶液(ph5.0)，混匀，55℃超声(200w)1h，温郁金粉体与加入的离子液体水溶液的比为1∶1(w/v)；
[0031]
步骤四：加入无水乙醇，混匀，25℃超声(300w)30min，离心得到上清液，离子液体水溶液与加入的无水乙醇的体积比为1∶9；
[0032]
步骤五：回收上清液中的乙醇，加入石油醚萃取，回收石油醚，加入80％酸性乙醇(ph6.0)溶解，得到萃取物样品；
[0033]
步骤六：将萃取物样品加入到已处理好的大孔吸附树脂柱上，80％酸性乙醇(ph6.0)冲柱1h使样品吸附(流速1bv/h)，之后使用95％乙醇解吸附1h(流速3bv/h)，收集解吸附液，浓缩；
[0034]
步骤七：冷冻干燥，得到姜黄素类成分提取物。
[0035]
实施例2：温郁金中姜黄素类成分的提取
[0036]
步骤一：将温郁金鲜品洗净，晾干，粉碎过80目筛，得到温郁金粉体；
[0037]
步骤二：向温郁金粉体中，加入果胶酶，加入的酶与温郁金粉体的质量比为1∶10；
[0038]
步骤三：加入15％[emim]oac水溶液(ph 3.0)，混匀，50℃超声(350w)1.5h，温郁金粉体与加入的离子液体水溶液的比为1∶3(w/v)；
[0039]
步骤四：加入无水乙醇，混匀，45℃超声(120w)5min，离心得到上清液，离子液体水溶液与加入的无水乙醇的体积比为1∶7；
[0040]
步骤五：回收上清液中的乙醇，加入石油醚萃取，回收石油醚，加入75％酸性乙醇(ph3)溶解，得到萃取物样品；
[0041]
步骤六：将萃取物样品加入到已处理好的大孔吸附树脂柱上，75％酸性乙醇(ph3)冲柱2h使样品吸附(流速2bv/h)，之后使用85％乙醇解吸附3h(流速2bv/h)，收集解吸附液，浓缩；
[0042]
步骤七：冷冻干燥，得到姜黄素类成分提取物。
[0043]
实施例3：温郁金中姜黄素类成分的提取
[0044]
步骤一：将温郁金鲜品洗净，晾干，粉碎过100目筛，得到温郁金粉体；
[0045]
步骤二：向温郁金粉体中，加入半纤维素酶，加入的酶与温郁金粉体的质量比为2∶10；
[0046]
步骤三：加入15％[hmim]pf6水溶液(ph5.5)，混匀，30℃超声(350w)2h，温郁金粉体与加入的离子液体水溶液的比为1∶2.5(w/v)；
[0047]
步骤四：加入无水乙醇，混匀，35℃超声(120w)20min，离心得到上清液，离子液体水溶液与加入的无水乙醇的体积比为1∶7.5；
[0048]
步骤五：回收上清液中的乙醇，加入石油醚萃取，回收石油醚，加入70％酸性乙醇(ph4)溶解，得到萃取物样品；
[0049]
步骤六：将萃取物样品加入到已处理好的大孔吸附树脂柱上，70％酸性乙醇(ph 4)冲柱1h使样品吸附(流速3bv/h)，之后使用80％乙醇解吸附1h(流速3bv/h)，收集解吸附液，浓缩；
[0050]
步骤七：冷冻干燥，得到姜黄素类成分提取物。
[0051]
实施例4：温郁金中姜黄素类成分的提取
[0052]
步骤一：将温郁金鲜品洗净，晾干，粉碎过80目筛，得到温郁金粉体；
[0053]
步骤二：向温郁金粉体中，加入葡萄糖淀粉酶，加入的酶与温郁金粉体的质量比为1.2∶10；
[0054]
步骤三：加入30％[omim]cl水溶液(ph4.5)，混匀，60℃超声(350w)1h，温郁金粉体与加入的离子液体水溶液的比为1∶2(w/v)；
[0055]
步骤四：加入无水乙醇，混匀，80℃超声(350w)30min，离心得到上清液，离子液体水溶液与加入的无水乙醇的体积比为1∶8；
[0056]
步骤五：回收上清液中的乙醇，加入石油醚萃取，回收石油醚，加入75％酸性乙醇(ph6)溶解，得到萃取物样品；
[0057]
步骤六：将萃取物样品加入到已处理好的大孔吸附树脂柱上，75％酸性乙醇(ph6)冲柱1h使样品吸附(流速1bv/h)，之后使用95％乙醇解吸附1h(流速1bv/h)，收集解吸附液，浓缩；
[0058]
步骤七：冷冻干燥，得到姜黄素类成分提取物。
[0059]
实施例5：温郁金中姜黄素类成分的提取
[0060]
步骤一：将温郁金鲜品洗净，晾干，粉碎过100目筛，得到温郁金粉体；
[0061]
步骤二：向温郁金粉体中，加入α-淀粉酶，加入的酶与温郁金粉体的质量比为2.5∶10；
[0062]
步骤三：加入25％[emim]bf4水溶液(ph 5.8)，混匀，60℃超声(180w)1.5h，温郁金粉体与加入的离子液体水溶液的比为1∶2.5(w/v)；
[0063]
步骤四：加入无水乙醇，混匀，37℃超声(280w)60min，离心得到上清液，离子液体水溶液与加入的无水乙醇的体积比为1∶7.5；
[0064]
步骤五：回收上清液中的乙醇，加入石油醚萃取，回收石油醚，加入85％酸性乙醇(ph6.5)溶解，得到萃取物样品；
[0065]
步骤六：将萃取物样品加入到已处理好的大孔吸附树脂柱上，85％酸性乙醇(ph6.5)冲柱1h使样品吸附(流速1.5bv/h)，之后使用95％乙醇解吸附1h(流速3bv/h)，收集解吸附液，浓缩；
[0066]
步骤七：冷冻干燥，得到姜黄素类成分提取物。
[0067]
实验例
[0068]
用甲醇溶解姜黄素、去甲氧基姜黄素和去二甲氧基姜黄素标准品，配置成姜黄素类成分标准品母液，4℃储存，用甲醇稀释成具有浓度梯度的标准品溶液系列，hplc检测，绘制标准曲线，姜黄素类成分的回归方程、相关系数和线性范围见表1。
[0069]
采用hplc及紫外检测器测定，色谱柱为c18，流动相由乙腈(a)和0.1％磷酸(b)组成，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，进样量为2.0μl，检测波长为415nm，洗脱程序为：0～10min，30～40％a；
②
10～15min，30～40％
→
25～35％a；
③
15～20min，25～35％
→
30～
40％a。检测色谱见图2，a为混合标准品溶液、b为样品，1为去二甲氧基姜黄素，2去甲氧基姜黄素，3为姜黄素。
[0070]
表1姜黄素类成分标准品的回归方程、相关系数和线性范围
[0071][0072]
对比例1：醇提取温郁金中的姜黄素类成分
[0073]
将温郁金鲜品洗净，晾干，粉碎过100目筛，得到温郁金粉体；向温郁金粉体中，加入90％乙醇，混匀，60℃超声(300w)60min，离心得到上清液，温郁金粉体与加入的90％乙醇的比为1∶10(w/v)；回收上清液中的乙醇，加入石油醚萃取，回收石油醚，加入80％酸性乙醇(ph 6.0)溶解，得到萃取物样品；将萃取物样品加入到已处理好的大孔吸附树脂柱上，80％酸性乙醇(ph 6.0)冲柱1h使样品吸附(流速1bv/h)，之后使用95％乙醇解吸附1h(流速3bv/h)，收集解吸附液，浓缩；冷冻干燥，得到姜黄素类成分提取物ⅰ。
[0074]
对比例2：酶辅助提取温郁金中的姜黄素类成分
[0075]
将温郁金鲜品洗净，晾干，粉碎过100目筛，得到温郁金粉体；向温郁金粉体中，加入纤维素酶，加入的酶与温郁金粉体的质量比为2∶10；加水(ph 5.0)混匀，55℃超声(200w)1h，温郁金粉体与水的比为1∶2(w/v)；加入无水乙醇，混匀，25℃超声(300w)30min，离心得到上清液，温郁金粉体与加入的无水乙醇的比为1∶9.0(w/v)；回收上清液中的乙醇，加入石油醚萃取，回收石油醚，加入80％酸性乙醇(ph 6.0)溶解，得到萃取物样品；将萃取物样品加入到已处理好的大孔吸附树脂柱上，80％酸性乙醇(ph 6.0)冲柱1h使样品吸附(流速1bv/h)，之后使用95％乙醇解吸附1h(流速3bv/h)，收集解吸附液，浓缩；冷冻干燥，得到姜黄素类成分提取物ⅱ。
[0076]
按照实施例1的方法制备姜黄素类成分提取物ⅲ。
[0077]
以姜黄素类化合物得率为指标，对比了乙醇提取、酶辅助提取和离子液体与酶提取，结果如图3所示。结果可知，相比于乙醇提取，酶辅助提取可提高姜黄素类化合物得率，但并不显著高于乙醇法提取，加入离子液体后，得率显著高于乙醇法提取和酶法提取(p《0.05)。
[0078]
验证例1
[0079]
在单因素实验结果的基础上，确定了关键影响因素。采用定制设计和响应面法，考察超声温度(a)、乙醇浓度(b)、超声功率(c)对姜黄素类目标成分得率(y)的影响及交互作用。本设计共进行14次实验，采用二次多项式模型，使用jmp 11进行回归分析，采用响应面法反映姜黄素类目标成分得率与试验变量之间的关系。
[0080]
目标化合物在温郁金中拟合响应的二阶多项式如下：y(姜黄素类成分得率)＝0.0162a+0.0399b+0.0254c-0.0869ab-0.0013ac+0.0199bc-0.0062a
2-0.0189b
2-0.0441c2+0.3058(pmodel＞f)，说明模型具有统计学意义；拟合系数r2＝0.9907，调整r2＝0.9741，说明模型拟合良好。三种因素对姜黄素类成分得率的主要影响和相互作用如图4所示。根据软件预测得到最佳提取条件，经调整后为：第2次超声温度45℃，乙醇浓度80％，第2次超声功率250w。结果表明，预测值(0.3048％)与实际结果(0.3031％)较吻合，验证了优化参数的可
靠性。
[0081]
验证例2
[0082]
利用离子液体与酶提取温郁金中姜黄素类成分。回收上清液中的乙醇，加入石油醚萃取，上层为石油醚层，下层为水层；水层经过旋转蒸发后得到粗离子液体，将粗离子液体移入真空干燥箱，80℃干燥12h得到再生离子液体。将再生的离子液体再次应用于新的温郁金中姜黄素类成分的提取，重复上述步骤。
[0083]
首次提取后，姜黄素类化合物的得率为(0.3031
±
0.0013)％，离子液体回收率为(99.56
±
0.10)％。再生离子液体提取后，姜黄素类化合物的得率为(0.2866
±
0.021)％，离子液体回收率为(99.01
±
0.54)％。实验结果表明，再生离子液体稳定性较好，回收再利用的离子液体依然有较高的姜黄素类成分的提取水平，且前三次回收率均高于99％。

技术特征：
1.超声辅助离子液体与酶法提取温郁金中姜黄素类成分的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：1）将温郁金鲜品洗净，晾干，粉碎过80～100目筛，得到温郁金粉体；2）依次向温郁金粉体中，加入酶及离子液体水溶液，混匀，超声，得混合液体；其中，加入的酶与温郁金粉体的质量比为1～3∶10；温郁金粉体与加入的离子液体水溶液的比为1∶1～3（w/v）；3）向混合液体中加入无水乙醇，混匀，超声，离心取上清液；其中，无水乙醇加入量与离子液体水溶液的体积比为7～9：1～34）回收上清液中的乙醇，加入石油醚萃取，萃取后回收石油醚，加入酸性乙醇溶解，得到萃取物样品；5）将萃取物样品加入到已处理好的大孔吸附树脂柱上，酸性乙醇冲柱1～3h使样品吸附，之后使用85%～95%乙醇解吸附1～3h，收集解吸附液，浓缩制得浓缩物；6）将浓缩物冷冻干燥，制得姜黄素类成分提取物。2.如权利要求1所述的超声辅助离子液体与酶法提取温郁金中姜黄素类成分的方法，其特征在于步骤2）中，所述的酶为α-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、纤维素酶、葡萄糖淀粉酶、果胶酶、半纤维素酶中的一种或多种。3.如权利要求1所述的超声辅助离子液体与酶法提取温郁金中姜黄素类成分的方法，其特征在于步骤2）中，离子液体中阳离子为1-乙基-3-甲基咪唑阳离子、1-丁基-3-甲基咪唑阳离子、1-己基-3-甲基咪唑阳离子、1-辛基-3-甲基咪唑阳离子中的任一种，阴离子为cl-、pf
6-、bf
4-、oac-中的任一种。4.如权利要求1所述的超声辅助离子液体与酶法提取温郁金中姜黄素类成分的方法，其特征在于步骤2）中，离子液体水溶液的浓度为10%～30%（w/v），ph为3.0～6.0。5.如权利要求1所述的超声辅助离子液体与酶法提取温郁金中姜黄素类成分的方法，其特征在于步骤2）中超声条件为：时间0.5～2h、功率120～350w、温度30～60℃。6.如权利要求1所述的超声辅助离子液体与酶法提取温郁金中姜黄素类成分的方法，其特征在于步骤3）中超声条件为：时间5～30min、功率120～350w、温度25～80℃。7.如权利要求1所述的超声辅助离子液体与酶法提取温郁金中姜黄素类成分的方法，其特征在于步骤4）中酸性乙醇是指乙醇浓度为70%～80%（v/v），ph为2～6。8.如权利要求1所述的超声辅助离子液体与酶法提取温郁金中姜黄素类成分的方法，其特征在于步骤5）中，酸性乙醇的流速为1～3bv/h，乙醇解吸附液流速为2～5bv/h。

技术总结
本发明公开了超声辅助离子液体与酶法提取温郁金中姜黄素类成分方法，首先将温郁金鲜品晾干、粉碎，向温郁金粉体依次加入酶和离子液体，超声，加入乙醇、超声、离心，取上清液回收乙醇，加入石油醚萃取，取石油醚层，回收萃取剂，加入酸性乙醇溶解，经过大孔吸附树脂吸附与解吸附，得到纯度较高的姜黄素类成分。按照本发明最优提取条件，温郁金中姜黄素类成分的得率为0.3031%，纯度为95.73%。本发明方法使用的离子液体为一种绿色溶剂，使用过程便捷，与酶协同促进细胞壁的分解，显著缩短提取时间和减少有机溶剂的使用。结果表明，可与酶协同提取温郁金活性成分，可循环使用且具有较高的目标产物得率。标产物得率。标产物得率。


技术研发人员：李欣岳 王淑玲 章柯滢 柳静蕾 徐诗静 余晓历 田朝
受保护的技术使用者：杭州师范大学
技术研发日：2023.03.22
技术公布日：2023/7/31