外泌体冻干粉制备方法及其应用与流程

1.本发明涉及生物医药生产技术领域，具体为一种外泌体冻干粉制备方法及其应用。


背景技术：

2.外泌体是指包含了复杂 rna 和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。而冻干粉是采用冷冻干燥机的真空冷冻干燥法预先将药液里面的水分冻结，然后在真空无菌的环境下将药液里面被冻结的水分升华，从而得到冷冻干燥而成。简而言之，在低温环境下抽干药液里面的水分，保留其原有的药物作用。
3.随着人们生活水平的提高，越来越多的人对护肤愈发重视，其对护肤品的关注与需求也与日俱增。近期研究发现，干细胞来源的外泌体可以有效转运mrna、micro rna及蛋白质等生物活性物质，具有减少细胞凋亡、减轻炎症反应及提高组织修复潜力等重要生物学功能，在调控组织再生方面存在良好的临床应用前景，目前国内鲜有将外泌体应用在生物美容领域。
4.由于，外泌体冻干粉具有上述所述的诸多优点，故申请人认为如果将其应用于护肤品领域，则会显著地提高或改善护肤品的品质。因此，提供一种外泌体冻干粉制备方法及其应用，成为所属领域的技术人员亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供外泌体冻干粉制备方法及其应用，本发明中以第一外泌体、第二外泌体、烟酰胺及棕榈酰三肽作为制备外泌体冻干粉的原料，其相互协同，相互配合不仅能起到很好的补水效果，同时还具有很好的除皱及淡化细纹的美容效果，其能广泛地应用在护肤品及化妆品领域。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种外泌体冻干粉制备方法，包括以下步骤：步骤一、采用无血清培养基对生长良好的人羊膜间充质干细胞进行培养，并向培养基中加入质量为其0.2～0.3%的胰酶进行消化传代，传至p2代；待其生长至融合度80%时去除无血清培养基，并用pbs清洗3～4次，再用1640基础培养基进行培养，每天收集培养上清，并更换新鲜的1640培养基，连续收集培养3～5天后收集培养上清液，保存、备用；步骤二、将步骤一收集的培养上清液于4℃，1000g离心力条件下离心处理10～20min；待离心处理完毕后，弃去沉淀，再于载流量为100k条件下对其进行超滤浓缩；收集浓缩液，并将其于3～5℃，80000～120000g离心力条件下离心处理2～5h，离心完毕后，收集沉淀，所得第一外泌体保存、备用；
步骤三、分别按0.02～0.05g/ml、0.05～0.08g/ml的用量比将啤酒花、芦荟浸渍于30～40℃的浸渍液中15～20h；浸渍完毕后弃去上清液，然后将浸渍处理后的啤酒花及芦荟进行冷冻离心处理；待离心完毕后将所得混合组分于4℃的条件下离心处理去除碎片，并于离心力为3000g的条件下对其离心处理2次，每次离心处理的时间为15～25min；而后于离心力为10000g的条件下对其离心处理25～35min；收集上清液并将之于100000g离心力的条件下离心处理2～4h，最后再于4℃的条件下弃去上清液，收集沉淀物，所得即为第二外泌体保存、备用；步骤四、依次向无菌水中加入质量分别为其0.03～0.08%的第一外泌体、0.02～0.05%的第二外泌体、0.3～0.6%的烟酰胺及0.5～0.8%的棕榈酰三肽，混合搅拌均匀后，采用真空冷冻干燥工艺对所得混合物料进行冻干处理；然后按国家相关标准进行检验，合格后封装，最终所得即为外泌体冻干粉成品。
7.更进一步地，所述无血清培养基中还加入了加速分泌助剂，且所述加速分泌助剂包括15～85ng/ml的γ-ifn、3～8mg/ml的聚-l-赖氨酸溴化氢、2～5ng/ml的gm-csf、3～6ng/ml的白细胞介素-6、2～4ng/ml的肝细胞生长因子、4～7mm的atp及10～15mg/dl的ca
2+
溶液。
8.更进一步地，所述无血清培养基中的含氧量为2～4.5%，且ph为6.6～6.9。
9.更进一步地，所述步骤二中浸渍液的制备方法为：向浓度为0.08～0.12mol/l的2-n-吗啡代烷磺酸缓冲液中分别投入摩尔量为2-n-吗啡代烷磺酸0.4～0.6倍的氯化钠、0.01～0.015倍的氯化钙，混合搅拌均匀后将所得混合溶液的ph调节至5.8～6.3，最终所得即为浸渍液成品。
10.更进一步地，所述步骤二中冷冻离心处理时的离心力设置为为600～800g，离心时间设置为15～25min。
11.更进一步地，所述步骤三中在对啤酒花、芦荟进行浸渍处理后再对其进行3～4次抽真空处理，每次抽真空时间独立为8～12 s，相邻两次抽真空之间的时间间隔为20～45s。
12.更进一步地，所述步骤四中混合搅拌时搅拌机转速设置为500～800r/min，搅拌时间设置为20～30min。
13.更进一步地，所述步骤四中真空冷冻干燥时真空度设置为10pa，温度设置为-50～-40℃，且冷冻干燥的时间设置为20～45h。
14.更进一步地，所述ca
2+
溶液选用硝酸钙、氯化钙中的任意一种。
15.所述的外泌体冻干粉在护肤品及化妆品领域的应用。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明中以人羊膜间充质干细胞为基材，先采用含有加速分泌助剂的无血清培养基对其进行培养，其中加速分泌助剂的使用不仅能有效地调节和控制细胞的生长发育及分化，可以有效地诱导间充质干细胞最大限度的合成和分泌外泌体，有助于大规模地获取其活性成分。而后再经过超滤浓缩及高速离心处理实现了对外泌体进行纯化的目的，有效地保证了其纯度。
17.此外，本发明中以啤酒花及芦荟等为原料，将其浸渍在浸渍液中不仅能在不破坏外泌体的条件下获取更多的第二外泌体，保证了其结构及功能完整性的同时也提高了第二外泌体的产率。本发明中以第一外泌体、第二外泌体、烟酰胺及棕榈酰三肽作为制备外泌体
冻干粉的原料，其相互协同，相互配合不仅能起到很好的补水效果，同时还具有很好的除皱及淡化细纹的美容效果。由此可知，本技术制备的外泌体冻干粉能广泛地应用在护肤品及化妆品领域。
具体实施方式
18.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
19.实施例1
20.一种外泌体冻干粉制备方法，包括以下步骤：步骤一、采用无血清培养基对生长良好的人羊膜间充质干细胞进行培养，并向培养基中加入质量为其0.2%的胰酶进行消化传代，传至p2代；待其生长至融合度80%时去除无血清培养基，并用pbs清洗3次，再用1640基础培养基进行培养，每天收集培养上清，并更换新鲜的1640培养基，连续收集培养3天后收集培养上清液，保存、备用；其中，无血清培养基中还加入了加速分泌助剂，且加速分泌助剂包括15ng/ml的γ-ifn、3mg/ml的聚-l-赖氨酸溴化氢、2ng/ml的gm-csf、3ng/ml的白细胞介素-6、2ng/ml的肝细胞生长因子、4mm的atp及10mg/dl的硝酸钙溶液；无血清培养基中的含氧量为2%，且ph为6.6；步骤二、将步骤一收集的培养上清液于4℃，1000g离心力条件下离心处理10min；待离心处理完毕后，弃去沉淀，再于载流量为100k条件下对其进行超滤浓缩；收集浓缩液，并将其于3℃，80000g离心力条件下离心处理2h，离心完毕后，收集沉淀，所得第一外泌体保存、备用；其中，浸渍液的制备方法为：向浓度为0.08mol/l的2-n-吗啡代烷磺酸缓冲液中分别投入摩尔量为2-n-吗啡代烷磺酸0.4倍的氯化钠、0.01倍的氯化钙，混合搅拌均匀后将所得混合溶液的ph调节至5.8，最终所得即为浸渍液成品；冷冻离心处理时的离心力设置为为600g，离心时间设置为15min；步骤三、分别按0.02g/ml、0.05g/ml的用量比将啤酒花、芦荟浸渍于30℃的浸渍液中15h；浸渍完毕后弃去上清液，然后将浸渍处理后的啤酒花及芦荟进行冷冻离心处理；待离心完毕后将所得混合组分于4℃的条件下离心处理去除碎片，并于离心力为3000g的条件下对其离心处理2次，每次离心处理的时间为15min；而后于离心力为10000g的条件下对其离心处理25min；收集上清液并将之于100000g离心力的条件下离心处理2h，最后再于4℃的条件下弃去上清液，收集沉淀物，所得即为第二外泌体保存、备用；其中，步骤三中在对啤酒花、芦荟进行浸渍处理后再对其进行3次抽真空处理，每次抽真空时间独立为8s，相邻两次抽真空之间的时间间隔为20s；步骤四、依次向无菌水中加入质量分别为其0.03%的第一外泌体、0.02%的第二外泌体、0.3%的烟酰胺及0.5%的棕榈酰三肽，混合搅拌均匀后，采用真空冷冻干燥工艺对所得混合物料进行冻干处理；然后按国家相关标准进行检验，合格后封装，最终所得即为外泌体冻干粉成品；
其中，步骤四中混合搅拌时搅拌机转速设置为500r/min，搅拌时间设置为20min；真空冷冻干燥时真空度设置为10pa，温度设置为-50℃，且冷冻干燥的时间设置为20h。
21.本发明所制备的外泌体冻干粉在护肤品及化妆品领域的应用。
22.实施例2
23.一种外泌体冻干粉制备方法，包括以下步骤：步骤一、采用无血清培养基对生长良好的人羊膜间充质干细胞进行培养，并向培养基中加入质量为其0.25%的胰酶进行消化传代，传至p2代；待其生长至融合度80%时去除无血清培养基，并用pbs清洗3次，再用1640基础培养基进行培养，每天收集培养上清，并更换新鲜的1640培养基，连续收集培养4天后收集培养上清液，保存、备用；其中，无血清培养基中还加入了加速分泌助剂，且加速分泌助剂包括50ng/ml的γ-ifn、5mg/ml的聚-l-赖氨酸溴化氢、3ng/ml的gm-csf、5ng/ml的白细胞介素-6、3ng/ml的肝细胞生长因子、6mm的atp及12mg/dl的硝酸钙溶液；无血清培养基中的含氧量为3.5%，且ph为6.8；步骤二、将步骤一收集的培养上清液于4℃，1000g离心力条件下离心处理15min；待离心处理完毕后，弃去沉淀，再于载流量为100k条件下对其进行超滤浓缩；收集浓缩液，并将其于4℃，100000g离心力条件下离心处理3h，离心完毕后，收集沉淀，所得第一外泌体保存、备用；其中，浸渍液的制备方法为：向浓度为0.1mol/l的2-n-吗啡代烷磺酸缓冲液中分别投入摩尔量为2-n-吗啡代烷磺酸0.5倍的氯化钠、0.012倍的氯化钙，混合搅拌均匀后将所得混合溶液的ph调节至6.0，最终所得即为浸渍液成品；冷冻离心处理时的离心力设置为为700g，离心时间设置为20min；步骤三、分别按0.035g/ml、0.06g/ml的用量比将啤酒花、芦荟浸渍于35℃的浸渍液中18h；浸渍完毕后弃去上清液，然后将浸渍处理后的啤酒花及芦荟进行冷冻离心处理；待离心完毕后将所得混合组分于4℃的条件下离心处理去除碎片，并于离心力为3000g的条件下对其离心处理2次，每次离心处理的时间为20min；而后于离心力为10000g的条件下对其离心处理30min；收集上清液并将之于100000g离心力的条件下离心处理3h，最后再于4℃的条件下弃去上清液，收集沉淀物，所得即为第二外泌体保存、备用；其中，步骤三中在对啤酒花、芦荟进行浸渍处理后再对其进行4次抽真空处理，每次抽真空时间独立为10 s，相邻两次抽真空之间的时间间隔为35s；步骤四、依次向无菌水中加入质量分别为其0.05%的第一外泌体、0.04%的第二外泌体、0.4%的烟酰胺及0.7%的棕榈酰三肽，混合搅拌均匀后，采用真空冷冻干燥工艺对所得混合物料进行冻干处理；然后按国家相关标准进行检验，合格后封装，最终所得即为外泌体冻干粉成品；其中，步骤四中混合搅拌时搅拌机转速设置为600r/min，搅拌时间设置为25min；真空冷冻干燥时真空度设置为10pa，温度设置为-45℃，且冷冻干燥的时间设置为35h。
24.实施例3
25.一种外泌体冻干粉制备方法，包括以下步骤：
步骤一、采用无血清培养基对生长良好的人羊膜间充质干细胞进行培养，并向培养基中加入质量为其0.3%的胰酶进行消化传代，传至p2代；待其生长至融合度80%时去除无血清培养基，并用pbs清洗4次，再用1640基础培养基进行培养，每天收集培养上清，并更换新鲜的1640培养基，连续收集培养5天后收集培养上清液，保存、备用；其中，无血清培养基中还加入了加速分泌助剂，且加速分泌助剂包括85ng/ml的γ-ifn、8mg/ml的聚-l-赖氨酸溴化氢、5ng/ml的gm-csf、6ng/ml的白细胞介素-6、4ng/ml的肝细胞生长因子、7mm的atp及15mg/dl的硝酸钙溶液；无血清培养基中的含氧量为4.5%，且ph为6.9；步骤二、将步骤一收集的培养上清液于4℃，1000g离心力条件下离心处理20min；待离心处理完毕后，弃去沉淀，再于载流量为100k条件下对其进行超滤浓缩；收集浓缩液，并将其于5℃，120000g离心力条件下离心处理5h，离心完毕后，收集沉淀，所得第一外泌体保存、备用；其中，浸渍液的制备方法为：向浓度为0.12mol/l的2-n-吗啡代烷磺酸缓冲液中分别投入摩尔量为2-n-吗啡代烷磺酸0.6倍的氯化钠、0.015倍的氯化钙，混合搅拌均匀后将所得混合溶液的ph调节至6.3，最终所得即为浸渍液成品；冷冻离心处理时的离心力设置为为800g，离心时间设置为25min；步骤三、分别按0.05g/ml、0.08g/ml的用量比将啤酒花、芦荟浸渍于40℃的浸渍液中20h；浸渍完毕后弃去上清液，然后将浸渍处理后的啤酒花及芦荟进行冷冻离心处理；待离心完毕后将所得混合组分于4℃的条件下离心处理去除碎片，并于离心力为3000g的条件下对其离心处理2次，每次离心处理的时间为25min；而后于离心力为10000g的条件下对其离心处理35min；收集上清液并将之于100000g离心力的条件下离心处理4h，最后再于4℃的条件下弃去上清液，收集沉淀物，所得即为第二外泌体保存、备用；其中，步骤三中在对啤酒花、芦荟进行浸渍处理后再对其进行3～4次抽真空处理，每次抽真空时间独立为12 s，相邻两次抽真空之间的时间间隔为45s；步骤四、依次向无菌水中加入质量分别为其0.08%的第一外泌体、0.05%的第二外泌体、0.3～0.6%的烟酰胺及0.8%的棕榈酰三肽，混合搅拌均匀后，采用真空冷冻干燥工艺对所得混合物料进行冻干处理；然后按国家相关标准进行检验，合格后封装，最终所得即为外泌体冻干粉成品；其中，步骤四中混合搅拌时搅拌机转速设置为800r/min，搅拌时间设置为30min；真空冷冻干燥时真空度设置为10pa，温度设置为-40℃，且冷冻干燥的时间设置为45h。
26.对比例1、与实施例1的不同之处在于：本实施例中未使用加速分泌助剂。
27.对比例2、与实施例1的不同之处在于：本实施例中未使用第二外泌体。
28.对比例3、与实施例1的不同之处在于：本实施例中的第二外泌体仅以啤酒花为原料。
29.对比例4、与实施例1的不同之处在于：本实施例中的第二外泌体仅以芦荟为原料。
30.对比例5、与实施例1的不同之处在于：本实施例中未使用烟酰胺。
31.对比例6、与实施例1的不同之处在于：本实施例中未使用棕榈酰三肽。
32.性能测试：
33.将实施1～3及对比例1～6提供的外泌体冻干粉样品与玻尿酸及生理盐水按1.5：1：200的质量比混合均匀，然后将各组所得的营养液分别标记为实施1～3及对比例1～6。随机寻找90位面部衰老程度相似的试用者，将其平均分成9组，每组10人；然后用微针将实施例1～3及对比例1～6提供的营养液注入试用者的面部；注射后观察体验者面部是否出现过敏反应，并进行记录，具体观察结果也记录于下表。其中，出现过敏反应的症状为：面部皮肤出现红肿、溃烂。
34.同时，对注射10天、2个月、6个月、12个月、18个月和24个月后观察体验者的面部状态，并采用+记录体验者的面部状态，具体观察结果也记录于下表：其中，+代表：面部皮肤出现皱纹、松弛、凹陷症状，恢复为原来的状态；++代表面部皮肤饱满度下降，薄弱部位出现皱纹；+++代表面部皮肤饱满度下降，弹性减弱；++++代表面部皮肤光滑度及弹性度下降；+++++代表面部皮肤状态饱满，光滑水润有弹性；
35.通过对比及分析表格中的相关数据可知，本发明中以第一外泌体、第二外泌体、烟酰胺及棕榈酰三肽作为制备外泌体冻干粉的原料，其相互协同，相互配合不仅能起到很好的补水效果。同时，还具有很好的除皱及淡化细纹的美容效果，其能广泛地应用在护肤品及化妆品领域。由此表明本发明所提制备的外泌体冻干粉具有更广阔的市场前景，更适宜推广。
36.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
37.以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，
可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

技术特征：
1.一种外泌体冻干粉制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、采用无血清培养基对生长良好的人羊膜间充质干细胞进行培养，并向培养基中加入质量为其0.2～0.3%的胰酶进行消化传代，传至p2代；待其生长至融合度80%时去除无血清培养基，并用pbs清洗3～4次，再用1640基础培养基进行培养，每天收集培养上清，并更换新鲜的1640培养基，连续收集培养3～5天后收集培养上清液，保存、备用；步骤二、将步骤一收集的培养上清液于4℃，1000g离心力条件下离心处理10～20min；待离心处理完毕后，弃去沉淀，再于载流量为100k条件下对其进行超滤浓缩；收集浓缩液，并将其于3～5℃，80000～120000g离心力条件下离心处理2～5h，离心完毕后，收集沉淀，所得第一外泌体保存、备用；步骤三、分别按0.02～0.05g/ml、0.05～0.08g/ml的用量比将啤酒花、芦荟浸渍于30～40℃的浸渍液中15～20h；浸渍完毕后弃去上清液，然后将浸渍处理后的啤酒花及芦荟进行冷冻离心处理；待离心完毕后将所得混合组分于4℃的条件下离心处理去除碎片，并于离心力为3000g的条件下对其离心处理2次，每次离心处理的时间为15～25min；而后于离心力为10000g的条件下对其离心处理25～35min；收集上清液并将之于100000g离心力的条件下离心处理2～4h，最后再于4℃的条件下弃去上清液，收集沉淀物，所得即为第二外泌体保存、备用；步骤四、依次向无菌水中加入质量分别为其0.03～0.08%的第一外泌体、0.02～0.05%的第二外泌体、0.3～0.6%的烟酰胺及0.5～0.8%的棕榈酰三肽，混合搅拌均匀后，采用真空冷冻干燥工艺对所得混合物料进行冻干处理；然后按国家相关标准进行检验，合格后封装，最终所得即为外泌体冻干粉成品。2.根据权利要求1所述的一种外泌体冻干粉制备方法，其特征在于：所述无血清培养基中还加入了加速分泌助剂，且所述加速分泌助剂包括15～85ng/ml的γ-ifn、3～8mg/ml的聚-l-赖氨酸溴化氢、2～5ng/ml的gm-csf、3～6ng/ml的白细胞介素-6、2～4ng/ml的肝细胞生长因子、4～7mm的atp及10～15mg/dl的ca
2+
溶液。3.根据权利要求1所述的一种外泌体冻干粉制备方法，其特征在于：所述无血清培养基中的含氧量为2～4.5%，且ph为6.6～6.9。4.根据权利要求1所述的一种外泌体冻干粉制备方法，其特征在于，所述步骤二中浸渍液的制备方法为：向浓度为0.08～0.12mol/l的2-n-吗啡代烷磺酸缓冲液中分别投入摩尔量为2-n-吗啡代烷磺酸0.4～0.6倍的氯化钠、0.01～0.015倍的氯化钙，混合搅拌均匀后将所得混合溶液的ph调节至5.8～6.3，最终所得即为浸渍液成品。5.根据权利要求1所述的一种外泌体冻干粉制备方法，其特征在于：所述步骤二中冷冻离心处理时的离心力设置为为600～800g，离心时间设置为15～25min。6.根据权利要求1所述的一种外泌体冻干粉制备方法，其特征在于：所述步骤三中在对啤酒花、芦荟进行浸渍处理后再对其进行3～4次抽真空处理，每次抽真空时间独立为8～12 s，相邻两次抽真空之间的时间间隔为20～45s。7.根据权利要求1所述的一种外泌体冻干粉制备方法，其特征在于：所述步骤四中混合搅拌时搅拌机转速设置为500～800r/min，搅拌时间设置为20～30min。8.根据权利要求1所述的一种外泌体冻干粉制备方法，其特征在于：所述步骤四中真空冷冻干燥时真空度设置为10pa，温度设置为-50～-40℃，且冷冻干燥的时间设置为20～
45h。9.根据权利要求2所述的一种外泌体冻干粉制备方法，其特征在于：所述ca
2+
溶液选用硝酸钙、氯化钙中的任意一种。10.一种如权利要求1～9中所述的外泌体冻干粉在护肤品及化妆品领域的应用。

技术总结
本发明涉及生物医药生产技术领域，具体为一种外泌体冻干粉制备方法及其应用；本发明中以人羊膜间充质干细胞为基材，先采用含有加速分泌助剂的无血清培养基对其进行培养，其中加速分泌助剂的使用不仅能有效地调节和控制细胞的生长发育及分化，可以有效地诱导间充质干细胞最大限度的合成和分泌外泌体，有助于大规模地获取其活性成分；而后再经过超滤浓缩及高速离心处理实现了对外泌体进行纯化的目的，有效地保证了其纯度；另外，本发明中以第一外泌体、第二外泌体、烟酰胺及棕榈酰三肽作为制备外泌体冻干粉的原料，其相互协同，相互配合不仅能起到很好的补水效果，同时还具有很好的除皱及淡化细纹的美容效果。皱及淡化细纹的美容效果。


技术研发人员：张惠勇 杨丽平 郑嘉威 吴青 陈宪清
受保护的技术使用者：广州拾纳客生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.09
技术公布日：2023/7/31