一种修饰核苷酸及其应用

1.本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种修饰核苷酸及其应用。


背景技术：

2.反义寡核苷酸被定义为化学合成的寡核苷酸，通常长度为12-30个核苷酸，通过waston-cick碱基配对与细胞内核酸(dna或rna)特异结合形成杂交分子，从而在转录和翻译水平抑制特定基因表达的基因治疗技术，是一种新的药物开发方法。其机制是：1、反义寡核苷酸与靶mrna结合形成dna-rna杂合分子，可以激活rnase h，该酶可以切割杂合分子中的rna链，导致靶mrna降解。2、不能激活rnase h活性的反义寡核苷酸可以通过空间位阻效应阻止核糖体结合来抑制靶rna的翻译：另外还可以通过封闭剪接位点有选择的促进蛋白某个可变剪接体的表达，从而纠正错误的剪接。
3.反义寡核苷酸对于小分子及抗体药物优势众多，良好的生物利用度、较低的免疫原性、稳定性好易于保存，尤其是对于抗体和小分子不能结合的目标分子而言，反义寡核苷酸药物都能经过合理的设计及递送进行靶向目标分子。但是在发展中发现，反义寡核苷酸的脱靶性及毒性成为制约核酸药物发展的瓶颈。因此有必要研发一种改善反义寡核苷酸药物的脱靶性以及毒性的方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种修饰核苷酸及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该修饰核苷酸能够降低核酸药物的脱靶性以及毒性。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供一种修饰核苷酸，所述修饰核苷酸的结构式如下：
[0007][0008]
本发明还提供上述的修饰核苷酸在制备反义寡核苷酸药物中的应用。
[0009]
本发明还提供一种降低反义寡核苷酸药物脱靶性的方法，包括将所述反义寡核苷酸的序列中至少一个胸苷酸替换成上述的修饰核苷酸，制备得到含有所述修饰核苷酸的反义寡核苷酸药物的步骤。
[0010]
本发明还提供一种降低反义寡核苷酸药物毒性的方法，包括将所述反义寡核苷酸
的序列中至少一个胸苷酸替换成上述的修饰核苷酸，制备得到含有所述修饰核苷酸的反义寡核苷酸药物的步骤。
[0011]
本发明还提供一种反义寡核苷酸药物，所述反义寡核苷酸药物中的反义寡核苷酸是将如seq id no.1所示序列中全部的胸苷酸替换为上述的修饰核苷酸得到。
[0012]
进一步地，所述反义寡核苷酸药物还包括药学上可接受的辅料。
[0013]
本发明还提供一种上述的修饰核苷酸的制备方法，包括以下步骤：
[0014]
(1)3-羟基苯甲醇和3-硝基溴苄反应生成(3-((2-硝基苄基)氧基)苯基)甲醇；
[0015]
(2)所述(3-((2-硝基苄基)氧基)苯基)甲醇与三溴化磷反应生成1-((3-(溴甲基)苯氧基)甲基)-2-硝基苯；
[0016]
(3)所述1-((3-(溴甲基)苯氧基)甲基)-2-硝基苯与dmt-dt亚磷酰胺单体反应生成(2s，3r，5s)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(5-甲基-3-(3-((2-硝基苄基)氧基)苄基)-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)四氢呋喃-3-基(2-氰基乙基)二异丙基磷酰胺，即为所述修饰核苷酸。
[0017]
进一步地，在步骤(1)中，所述反应在碳酸钾存在下进行。
[0018]
进一步地，在步骤(2)中，所述反应避光进行。
[0019]
进一步地，在步骤(3)中，所述反应在碳酸铯存在下进行。
[0020]
本发明公开了以下技术效果：
[0021]
本发明提供了一种修饰核苷酸，利用该修饰核苷酸制备反义寡核苷酸药物，能够降低反义寡核苷酸药物的脱靶性以及毒性。利用该修饰核苷酸，本发明制备得到了具有紫外(uv)-酪氨酸酶(tyr)特异性刺激响应性的反义寡核苷酸药物m-aso，该药物通过与靶标(mc1r)作用发挥药效，减低其蛋白的表达。
[0022]
本发明以黑色素细胞内黑色素表达的治疗为例，展示了具有该修饰核苷酸的反义寡核苷酸药物在人体正常黑色素细胞和黑色素瘤细胞中，在降低目标蛋白mc1r(即降低黑色素的表达)中，与阳性核酸药物(即不具有该修饰核苷酸)具有相同效果；在正常细胞中具有该修饰核苷酸的反义寡核苷酸药物相较于阳性核酸药物，毒性大大降低。
[0023]
由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比有如下优点：
[0024]
1.本发明设计合成了一种修饰核苷酸，可以在光照和酶的联合作用下进行控制。
[0025]
2.本发明制备得到的包含修饰核苷酸的反义寡核苷酸药物在紫外-酪氨酸酶的控制下，能够极大地降低目标分子的脱靶性和毒性。
[0026]
3.本发明获得的含有修饰核苷酸的反义寡核苷酸药物只要针对特定的靶标分子进行合理的结构上的设计，可以进一步应用在所有寡核苷酸药物当中，开发出一种具有良好应用前景的前药设计方案。
附图说明
[0027]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0028]
图1为实施例1中产物6的1h-nmr图谱；
[0029]
图2为实施例1中产物6的
13
c-nmr图谱；
[0030]
图3为实施例1中产物6的hrms图谱；
[0031]
图4为实施例1制备的修饰核苷酸nb-ph-t在紫外光照和酪氨酸酶裂解下前后的高效液相色谱图变化；
[0032]
图5为实施例3制备得到的反义寡核苷酸在紫外光照(a)和酪氨酸酶裂解(b)作用下前后的page图的变化；
[0033]
图6为实施例3制备得到的反义寡核苷酸在细胞内被紫外和酪氨酸酶作用下恢复结构降解靶蛋白的验证图；其中，a为紫外照射后胞内靶蛋白表达含量验证，b为紫外照射后加入酪氨酸酶抑制剂靶蛋白表达含量验证；
[0034]
图7为实施例3制备得到的反义寡核苷酸对正常人体黑色素细胞的细胞活性图。
具体实施方式
[0035]
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0036]
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
[0037]
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
[0038]
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
[0039]
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
[0040]
目前反义寡核苷酸药物的脱靶问题已经成为寡核苷酸药物广泛发展的阻力。反义寡核苷酸药物对靶标的降解主要通过碱基互补配对的原理与目标分子进行互补配对，形成dna-rna杂合分子，可以激活rnase h，该酶可以切割杂合分子中的rna链，导致靶mrna降解。不能激活rnase h活性的反义寡核苷酸可以通过空间位阻效应阻止核糖体结合来抑制靶rna的翻译；另外还可以通过封闭剪接位点有选择的促进蛋白某个可变剪接体的表达，从而纠正错误的剪接。修饰的碱基可以阻断dna和rna之间正常的碱基互补配对程序，在受到紫外酪氨酸酶的作用下，裂解释放修饰的基团恢复互补配对的功能。本发明研制出一种修饰核苷酸及包含至少一个该修饰核苷酸的核酸，可以阻断互补配对程序。该修饰核苷酸为(2s，3r，5s)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(5-甲基-3-(3-((2-硝基苄基)氧基)苄基)-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)四氢呋喃-3-基(2-氰基乙基)二异
丙基磷酰胺(命名为nb-ph-t)，结构式如下：
[0041][0042]
实施例1修饰核苷酸的合成
[0043]
合成路线如下：
[0044][0045]
其中，a：k2co3，丙酮，55℃，8h；b：pbr3，dcm，-10℃，2h；c：cs2co3，无水乙腈，室温，3h。
[0046]
合成步骤：
[0047]
(1)(3-((2-硝基苄基)氧基)苯基)甲醇(中间体3)的合成
[0048]
将3-羟基苯甲醇(15.0g，0.12mol)和150ml的丙酮加入三颈瓶中，加入碳酸钾(33.0g，0.24mol)室温搅拌30min。3-硝基溴苄(17.0g，0.08mol)溶解于150ml丙酮，并在2h内向三颈瓶中缓慢滴加，滴加结束后，升温至55℃反应8h。tlc监测反应结束后，抽滤去除不溶物，滤液减压蒸馏去除溶剂，得到反应粗品。反应粗品由200ml乙酸乙酯溶解，1n氢氧化钠溶液洗涤五次后，有机层经无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去除溶剂，得到无色油状物，即中间体3(19.0g，0.07mol)，收率93％，所得粗品未经纯化直接用于后续反应。
[0049]
(2)1-((3-(溴甲基)苯氧基)甲基)-2-硝基苯(中间体4)的合成
[0050]
将中间体3(19.0g,0.07mol)和200ml的dcm(二氯甲烷)加入到三颈瓶中，氮气保护条件下，冰盐浴降温至-15℃。三溴化磷(39.6g,0.14mol)在100ml的dcm稀释溶解后，向反应中缓慢滴加，避光反应3h。tlc检测反应完全后，向反应中加入预冷的饱和碳酸钠溶液调节ph至7.0，有机层经饱和氯化钠洗涤五次，无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏去除溶剂，得到棕黄
色固体粗品，即中间体4(15.0g，64％)。该棕黄色固体粗品未经纯化，直接用于后续反应。
[0051]
(3)(2s，3r，5s)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(5-甲基-3-(3-((2-硝基苄基)氧基)苄基)-2，4-二氧代-3，4-二氢嘧啶-1(2h)-基)四氢呋喃-3-基(2-氰基乙基)二异丙基磷酰胺(产物6)的合成
[0052]
将dmt-dt亚磷酰胺单体(购买于毕得医药，即中间体5，4.6g，6.2mmol)，碳酸铯(5.0g，15.3mmol)和无水乙腈150ml加入到三颈瓶中，室温搅拌30min。中间体4(2.0g,6.2mmol)溶解于50ml的dcm中，避光条件下向三颈瓶中缓慢滴加，30min内滴加结束，室温继续反应3h。tlc检测反应完全后，抽滤，滤液减压蒸馏去除溶剂，所得粗品由甲醇/二氯甲烷重结晶，得到淡黄色泡沫状固体，即产物6(3.2g,3.2mmol)，收率52％。
[0053]
产物6的核磁图谱见图1-2，质谱图谱见图3，结果如下：
[0054]1h nmr(300mhz,acetone):δ8.18-8.15(d,1h,j＝8.25hz,ar-h),7.90-7.87(d,1h,j＝7.98hz,ar-h),7.79-7.72(m,2h,ar-h),7.64-7.53(m,3h,ar-h),7.43-7.33(m,6h,ar-h),7.30-7.23(m,2h,ar-h),7.13(s,1h,ar-h),7.07-7.04(d,1h,j＝7.59hz,ar-h),6.96-6.91(m,5h,ar-h),6.48-6.43(m,1h,ch),5.50(s,2h,℃h2),5.09(s,2h,nch2),4.84-4.76(m,1h,ch),4.27-4.20(m,1h,ch),3.97-3.60(m,10h),3.51-3.40(m,2h,ch2),2.80-2.76(t,1h,j＝6.57hz,ch),2.68-2.64(t,1h,j＝11.49hz,ch),2.60-2.51(m,2h,ch2),1.57(s,3h,ch3),1.24-1.12(m,12h,ch3)ppm.
[0055]
13
c nmr(75mhz,acetone-d6):δ162.81,158.92,158.36,150.86,147.62,144.98,139.40,135.68,135.64,135.60,135.56,134.23,134.16,133.89,133.31,130.22,129.46,129.07,128.78,128.23,128.19,127.93,126.97,124.82,121.48,118.19,118.02,115.33,113.46,113.20,109.64,109.58,86.73,86.69,85.43,85.35,85.21,85.12,73.85,73.60,73.50,73.29,66.68,63.40,63.30,58.78,58.72,58.52,58.48,54.75,43.83,43.20,43.01,39.61,39.52,39.47,24.14,24.04,20.01,19.94,19.91,19.85,12.16ppm.
[0056]
hrms(esi)，[m+h]
+
预测c
54h61
n5o
11
p 981.4100，实际981.4111。
[0057]
以上检测结果表明，本实施例成功合成(2s，3r，5s)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(5-甲基-3-(3-((2-硝基苄基)氧基)苄基)-2，4-二氧代-3，4-二氢嘧啶-1(2h)-基)四氢呋喃-3-基(2-氰基乙基)二异丙基磷酰胺(产物6)。
[0058]
实施例2修饰核苷酸对紫外(uv)-酪氨酸酶(tyr)的响应性
[0059]
将实施例1制备得到的修饰核苷酸nb-ph-t溶解于dmso中，制备成10μm的修饰核苷酸储备液。将修饰核苷酸储备液用dmso稀释至100nm后采用南京大卫仪器设备有限公司的zf-7a手提式紫外灯光在功率密度为20mw/cm2条件下，照射2分钟，得到光照后的修饰核苷酸。随后取20μl光照后的修饰核苷酸进行高效液相分析及质谱检测，同时以未进行邻硝基苄基修饰的核苷酸作为对照组。agi1ent1260高效液相色谱仪对修饰核苷酸光照后产物的分析结果表明，单纯的修饰核苷酸保留时间为15.4min，在光照后其邻硝基苄基发生部分裂解，体系在保留时间为10.2min处出现新峰，同时质谱结果也表明出现光解后的分子量，验证了光照裂解过程的存在，以及裂解产物的形成。将上述光解中裂解的修饰核苷酸nb-ph-t用pbs缓冲液稀释至浓度为100nm后，用酪氨酸酶进一步进行裂解修饰的3-甲基苯酚部分。将稀释的光照产物中加入100unit l-1
的酪氨酸酶，并于37℃恒温摇床进行震荡反应2h，随后取20μl反应液进行高效液相色谱分析及质谱检测。高效液相色谱对光照裂解的产物在酪
氨酸酶反应后分析结果表明，单纯的光照裂解产物在的保留时间在10.2min，在加入酪氨酸酶后体系中保留时间为10.2min的峰，保留时间提前至7.8min。同时，nb-ph-t保留时间也为7.8min，验证了酶切过程的存在以及酶切产物的形成。但是值得注意的是，在图4中，未被紫外完全裂解的修饰核苷酸在酪氨酸酶的作用下并没有发生任何裂解。证实了本发明中设计的修饰核苷酸具有对紫外-酪氨酸酶级联响应的机制。
[0060]
实施例3包含修饰核苷酸的反义寡核苷酸药物及阴性对照的合成
[0061]
针对目标分子mc1r人的反义寡核苷酸链(命名为m-aso)，其序列为ttctccaccagactcacca(seq id no.1)，序列中的全部的t替换为修饰核苷酸nb-ph-t，阴性对照为ttctccaccagactcacca序列中全部采用正常的t。以上序列皆由金斯瑞合成，对于修饰的反义寡核苷酸链，提供修饰核苷酸交于金斯瑞通过dna的固相合成进行合成修饰。
[0062]
实施例4包含修饰核苷酸的反义寡核苷酸药物的响应性
[0063]
将实施例3中得到的修饰后的寡核苷酸链m-aso，用pbs稀释至5μm后用紫外光照进行裂解，在光照时间分别为0、2、5、10、30、60s时分别取20μl样进行page表征。将剩余的光照裂解产物加入不同浓度的酪氨酸酶，并于37℃恒温摇床进行震荡反应1h，对体系进行page表征。
[0064]
page表征方法：
[0065]
(1)取10μl的待表征样品，加入loading buffer。
[0066]
(2)上样后，设定电流为120v，缓冲液为1
×
tbe，15wt％尿素聚丙烯酰胺胶上电泳1h。
[0067]
(3)电泳指定位置后，切断电源，将染色溶液倒入合适的聚丙烯容器中，放入凝胶，用铝箔等盖住容器使染料避光。室温振荡染色30分钟。
[0068]
(4)染色结束后，放入凝胶成像仪进行显像。
[0069]
如图5所示，在不同时间的紫外照射下，其page结果表明分子量逐渐发生变化，可以明显看出在光照60s时m-aso链的位置与aso链的位置在同一水平位置处，证明了m-aso对光照的响应性。同时，在不同的酪氨酸酶浓度下，aso发生裂解，与未修饰的阴性对照aso链处于同一水平位置。证明了包含修饰核苷酸的反义寡核苷酸m-aso能够在紫外-酪氨酸酶的作用下产生级联响应，恢复本身的aso结构。
[0070]
实施例5包含修饰核苷酸的反义寡核苷酸药物前药在细胞中的响应性
[0071]
将实施例3中制得的包含修饰核苷酸的m-aso及对照组aso溶于pbs中(2.5μg)，通过赛默飞lipofectamine
tm
2000transfection reagent(lip2k)对mc1r高表达的b16f10细胞(购自购买自上海酶联生物科技有限公司)进行转染，完成后更换完全培养基对细胞进行72h的培养。在转染过程中，主要设计紫外验证实验、酪氨酸酶验证实验对m-aso进行紫外-酪氨酸酶的响应性验证。在培养结束后，提取细胞的全蛋白，进行目标蛋白的wb实验。
[0072]
各实验组实验操作：紫外验证实验分为五组，分别为对照组(pbs)、紫外组(pbs+uv)、转染m-aso组(m-aso)、转染m-aso加紫外组(m-aso+uv)和未修饰的aso组(aso)。对照组、紫外组加入同等体积的pbs溶液及lipo2k试剂，紫外照射的组别均在转染完成后用手持紫外灯照射2分钟，转染组别按照所设组别进行对应核酸的转染。同上述操作酪氨酸酶验证分为五组，分别为对照组(pbs+uv)、紫外加酪氨酸酶抑制剂曲酸组(pbs+uv+ka)、转染m-aso加紫外加曲酸组(m-aso+uv+ka)，转染m-aso加紫外组(aso+uv)和未修饰的aso组(aso)。曲
酸在完成转染后，更换培养基的同时加入，曲酸的加入量在更换的培养基中的浓度为200nm并且每隔24小时加一次，转然后培养72h共加3次。
[0073]
转染实验方法：
[0074]
(1)将处于对数生长期的b16f10细胞经消化、离心、重悬后铺于六孔板中培养24小时，待细胞生长密度达到50％―70％后将完全培养基移去更换为1640的不完全培养基。同时制备转染复合物，将即将使用的lipo2k轻微摇匀后放置于室温条件下；在1.5ml的无菌ep管中加入150μl无血清培养基，随后加入10μl的lipofectamine
tm
2000，涡旋10s后静置5min。
[0075]
(2)另取1.5ml的无菌ep管同样加入无血清培养基后随后加入2.5μg的核酸及溶剂对照组轻微混匀后静置5min。将静置的核酸的无血清培养基加入至lipo2k的无血清培养基溶液中后，涡旋10s。将混合物在室温条件静置孵育10min，使其形成稳定的反义寡核苷酸复合物。静置完毕后，将反义寡核苷酸转染复合物加入至六孔板中，轻轻摇匀后保持孔板终体积为1.5ml不含血清的1640培养基。
[0076]
(3)在培养箱中孵育6小时后将六孔板的不完全培养基弃去并加入新的含有血清的完全培养基放入培养箱中继续培养72h，用蛋白印迹法(wb)表征修饰核酸在紫外酪氨酸酶作用下降解蛋白的响应性。
[0077]
wb实验方法：
[0078]
(1)倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走)。
[0079]
(2)每瓶细胞加3ml 4℃预冷的pbs(0.01m ph7.2～7.3)。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将pbs弃净后把培养瓶置于冰上。
[0080]
(3)按1ml裂解液加10μlpmsf(苯甲基磺酰氟，100mm)，摇匀置于冰上(pmsf要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合)。
[0081]
(4)每瓶细胞加400μl含pmsf的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
[0082]
(5)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快)，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中(整个操作在冰上进行)。
[0083]
(6)于4℃下12000rpm离心5min(提前开离心机预冷)。
[0084]
(7)将离心后的上清即为培养细胞的全蛋白。
[0085]
(8)将上述制得的蛋白样品加入loading buffer在水中煮沸10分钟。
[0086]
(9)marker孔加入10μl，其余将上述变形蛋白总上样量40μg。
[0087]
(10)接上电源后，先用80v恒压电泳至溴酚蓝指示剂到浓缩胶与分离胶交界处后改为恒压120v直至溴酚蓝电泳到凝胶底部。
[0088]
(11)取出凝胶，根据marker切下目的条带，裁剪与sds-page凝胶相同大小的pvdf膜，滤纸应与纤维垫相同大小；在200ma横流下转膜90分钟。
[0089]
(12)将转膜完成的pvdf膜取出后，用含5wt％脱脂奶粉的tbst(封闭液)浸泡30分钟。
[0090]
(13)封闭完成后进行目标蛋白mc1r特特异性一抗4℃恒温摇床下过夜孵育。
[0091]
(14)一抗孵育完毕后，在室温下二抗孵育60分钟。
[0092]
(15)孵育完毕后，将pvdf放置于成像仪上，均匀滴加ecl工作液，排出气泡，开始曝光。
[0093]
实验结果见图6。图6中a的第四泳道修饰的反义寡核苷酸m-aso在紫外照射过后与为未经过紫外照射的第三泳道相比，检测的目标蛋白mc1r明显减少。对于对照组第五泳道aso，显示出蛋白降级的效率相当。证明修饰的反义寡核苷酸m-aso能在细胞中对光照进行高效地响应，并裂解。图6中b显示，在加入酪氨酸酶抑制剂曲酸的作用下第三泳道，即使进行了光照的裂解但是酪氨酸酶的活性受到了抑制，m-aso也没有任何降解靶蛋白的作用。上述的实验结果表明，本发明所设计的包含修饰核苷酸的针对mc1r的反义寡核苷酸前药在细胞外光照条件下及胞内酪氨酸酶的作用下，可以恢复本身的作用，降解目标蛋白。
[0094]
实施例6包含修饰核苷酸的反义寡核苷酸药物的毒性
[0095]
人表皮黑色素细胞(pig1)在正常的日照条件下能够诱导黑色素的产生，保护皮肤组织，但在极度损伤的情况下可能会导致色素沉积。本实验分为四组验证修饰核酸的毒性，分别分为对照组、lipo2k组、m-aso组、aso组。将处于对数生长期的pig1细胞经消化、离心、重悬后铺于六孔板中培养24小时，待细胞生长密度达到60％后，将完全培养基移去更换为1640的不完全培养基。对照组无需操作，lipo2k组在转染时只加入10μl lipo2k不加入核酸。m-aso和aso组将2.5μg的核酸和10μl的lipo2k进行共孵育形成转染复合物对细胞进行转染，六小时后更换为完全培养基后继续培养72h。72h后每孔加入10μl mtt溶液(5mg/ml，即0.5％mtt)，继续培养4h。
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mtt检测：
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(1)mtt加入培养4h后，结晶可充分形成后，用移液器将上清移走。
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(2)每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪测量各孔的吸光值od
490nm
。
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(3)同时设置调零孔(培养基、mtt、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、mtt、二甲基亚砜)。
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实验结果见图7，结果表明包含修饰核苷酸的m-aso相对于阳性对照aso，对pig1细胞具有较低的毒性，证明了本发明含有修饰核苷酸的前药确实能够降低反义寡核苷酸药物的脱靶性及毒性。
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以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种修饰核苷酸，其特征在于，所述修饰核苷酸的结构式如下：2.一种如权利要求1所述的修饰核苷酸在制备反义寡核苷酸药物中的应用。3.一种降低反义寡核苷酸药物脱靶性的方法，其特征在于，包括将所述反义寡核苷酸的序列中至少一个胸苷酸替换成如权利要求1所述的修饰核苷酸，制备得到含有所述修饰核苷酸的反义寡核苷酸药物的步骤。4.一种降低反义寡核苷酸药物毒性的方法，其特征在于，包括将所述反义寡核苷酸的序列中至少一个胸苷酸替换成如权利要求1所述的修饰核苷酸，制备得到含有所述修饰核苷酸的反义寡核苷酸药物的步骤。5.一种反义寡核苷酸药物，其特征在于，所述反义寡核苷酸药物中的反义寡核苷酸是将如seq id no.1所示序列中全部的胸苷酸替换为如权利要求1所述的修饰核苷酸得到。6.根据权利要求5所述的反义寡核苷酸药物，其特征在于，所述反义寡核苷酸药物还包括药学上可接受的辅料。7.一种如权利要求1所述的修饰核苷酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)3-羟基苯甲醇和3-硝基溴苄反应生成(3-((2-硝基苄基)氧基)苯基)甲醇；(2)所述(3-((2-硝基苄基)氧基)苯基)甲醇与三溴化磷反应生成1-((3-(溴甲基)苯氧基)甲基)-2-硝基苯；(3)所述1-((3-(溴甲基)苯氧基)甲基)-2-硝基苯与dmt-dt亚磷酰胺单体反应生成(2s，3r，5s)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(5-甲基-3-(3-((2-硝基苄基)氧基)苄基)-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)四氢呋喃-3-基(2-氰基乙基)二异丙基磷酰胺，即为所述修饰核苷酸。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述反应在碳酸钾存在下进行。9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述反应避光进行。10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述反应在碳酸铯存在下进行。

技术总结
本发明公开了一种修饰核苷酸及其应用，涉及生物工程技术领域；所述修饰核苷酸的结构式如下：利用该修饰核苷酸制备反义寡核苷酸药物，能够降低反义寡核苷酸药物的脱靶性以及毒性。利用该修饰核苷酸，本发明制备得到了具有紫外-酪氨酸酶特异性刺激响应性的反义寡核苷酸药物M-ASO，该反义寡核苷酸药物通过与靶标(MC1R)作用发挥药效，减低其蛋白的表达。本发明以黑色素细胞内黑色素表达的治疗为例，展示了具有该修饰核苷酸的反义寡核苷酸药物在降低目标蛋白MC1R中，与阳性核酸药物(即不具有该修饰核苷酸)具有相同效果，并且毒性大大降低。并且毒性大大降低。并且毒性大大降低。


技术研发人员：马祎 卞金磊 黄以财 田于成 顾月清
受保护的技术使用者：中国药科大学
技术研发日：2023.03.21
技术公布日：2023/7/31