一种纳米生物荧光探针、荧光传感器及其在检测B型利钠肽中的应用

一种纳米生物荧光探针、荧光传感器及其在检测b型利钠肽中的应用
技术领域
1.本发明涉及医学及生物化学技术领域，特别是涉及一种纳米生物荧光探针、荧光传感器及其在检测b型利钠肽中的应用。


背景技术：

2.脑钠肽(brain natriuretic peptide，bnp)又称b型利钠肽(b-type natriuretic peptide)，是心脏细胞产生的结构相关的肽类激素家族钠尿肽中的一种。当心功能不全时，由于心脏容量负荷或压力负荷增加，心肌受到牵张或室壁压力增大，会使血中bnp的指标浓度增高，是心衰“金标准”。目前商用检测bnp的试剂盒，如酶联免疫法、胶体金免疫层析法，现都基于抗原抗体的特异性识别，然而抗体稳定性有限、批次间差异性显著。核酸适配体(aptamer)是一种通过体外筛选得到的可以与蛋白质等靶物特异性结合的rna或dna片段。相比之下，利用核酸适配体识别作用建立的生物传感方法更稳定、可避免交叉反应。纳米材料，如金属或半导体纳米颗粒和纳米棒，表现出与蛋白质(酶、抗原、抗体)或dna等生物分子相似的尺寸。纳米粒子具有独特的电子、光子和催化特性，而生物材料具有独特的识别、催化和抑制特性，它们结合能产生具有协同特性和功能的新型混合纳米生物材料。因此，若能以此开发一种快速、简便、高灵敏、高特异性、低成本的bnp检测新方法，这对心衰的及时诊断具有非常重大的意义。


技术实现要素：

3.鉴于以上所述现有技术的局限，本发明的目的在于提供一种纳米生物荧光探针、荧光传感器及其在检测b型利钠肽中的应用，为b型利钠肽的检测提供一种操作简单、灵敏度高且稳定的方法。
4.为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种纳米生物荧光探针，包括钯纳米材料与吸附于所述钯纳米材料上的核酸适配体，所述核酸适配体上标记有荧光染料，所述钯纳米材料在600～1100nm范围内有强而宽的吸收。
5.进一步，所述核酸适配体为对b型利钠肽特异的核酸适配体，所述荧光染料修饰的核酸适配体的发射波长在708nm处。
6.进一步，所述纳米生物荧光探针在用于检测b型利钠肽的荧光传感器中作为复合探针使用，所述钯纳米材料作为能量受体，所述核酸适配体作为能量供体，所述钯纳米材料与核酸适配体之间的距离小于预设距离阈值时，两者会在近红外区发生荧光共振能量转移，导致荧光染料荧光猝灭；当样品中存在b型利钠肽时，b型利钠肽通过特异性结合力与所述核酸适配体结合形成复合物，以使所述核酸适配体远离所述钯纳米材料，使荧光染料荧光得以恢复，样品中b型利钠肽的浓度与荧光恢复程度呈正相关关系。
7.进一步，所述核酸适配体序列为：5
’‑
ttt ttt taa acg ctc aaa gga cag agg gtg cgt agg aag ggt att cga cag gag gct cac a-3’。
8.进一步，所述核酸适配体的5’端标记有荧光染料。
9.进一步，所述荧光染料选自菁染料类、荧光素及其衍生物、罗丹明类，优选为菁染料类，更优选为cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、cy7和cy7.5中的任意一种。
10.本发明第二方面提供一种检测b型利钠肽的荧光传感器，所述荧光传感器包括第一方面所述的纳米生物荧光探针。
11.进一步，所述荧光传感器中，所述钯纳米材料的浓度为20～50μg/ml，优选为25～35μg/ml，更优选为30μg/ml。
12.进一步，所述荧光传感器反应体系ph为7.0～8.5，优选为7.0～8.0，更优选为7.4。
13.进一步，采用所述荧光传感器检测样品，在荧光分光光度计上测定溶液荧光强度的测定参数包括：激发波长675nm，发射波长为708nm，发射光谱扫描范围690～750nm。
14.进一步，所述荧光传感器在样品中b型利钠肽浓度为0.05～10pg/ml时具有良好的线性关系；优选地，所述荧光传感器定量样品溶液中b型利钠肽浓度的标准曲线方程为：y＝0.98lnx+5.696(r＝0.9923)。
15.本发明第三方面提供一种采用第二方面所述的荧光传感器检测b型利钠肽的方法，所述方法非疾病或治疗目的，所述方法包括如下步骤：
16.将钯纳米材料分散液、缓冲液与标记有荧光染料的核酸适配体溶液混匀，静置；再加入待测样品溶液，混匀，静置，在荧光分光光度计上测定溶液的荧光强度。
17.进一步，所述缓冲液的ph为7.0～8.5，优选为7.0～8.0，更优选为7.4。
18.进一步，所述缓冲液选自tris-hcl缓冲液、pbs缓冲溶液中的任意一种。
19.进一步，所述方法的操作过程在室温下进行。
20.进一步，钯纳米材料材料分散液与标记有荧光染料的核酸适配体溶液涡旋混匀后，静置5～15min后再加入待测样品溶液。
21.进一步，加入待测样品溶液涡旋混匀后，静置20～40min后再在荧光分光光度计上测定溶液的荧光强度。
22.进一步，所述钯纳米材料分散液的制备方法包括如下步骤：将钯前驱体盐、柠檬酸、十六烷基三甲基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮溶解于有机溶剂中，再加入六羰基钨，通过溶剂热法进行反应；反应结束后将反应液冷却，离心得钯纳米材料，再将钯纳米材料分散于溶剂中制得钯纳米材料分散液。
23.进一步，所述钯纳米材料分散液的制备方法包括如下步骤：将钯前驱体盐、柠檬酸、十六烷基三甲基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮加入有机溶剂中，使用纳米合成仪于500～800r/min转速下搅拌0.5～2h使其溶解，得到橙黄色溶液；在保护气体气氛下，向橙黄色溶液中加入六羰基钨，加热至75～85℃，通过溶剂热法反应0.5～2h，得到墨绿色反应液；反应结束后将反应液冷却，离心得钯纳米材料，再将钯纳米材料分散于溶剂中制得墨蓝色的钯纳米材料分散液。
24.进一步，所述钯纳米材料分散液的制备方法中，钯前驱体盐、柠檬酸、十六烷基三甲基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮与六羰基钨的摩尔用量比为1～2∶5～20∶2～10∶0.005～0.03∶5～10。
25.进一步，所述钯前驱体盐为二价钯的前驱体盐，优选为乙酰丙酮钯。
26.进一步，所述有机溶剂选自n，n-二甲基甲酰胺。
27.进一步，所述保护气体选自氩气或氦气。
28.进一步，反应结束后将反应液冷却至室温，加入丙酮，混匀后于8000～12000r/min的转速离心10～30min，弃去上清液，下层沉淀用无水乙醇重悬后超声分散，得到钯纳米材料分散液。
29.本发明第四方面提供根据第一方面所述的纳米生物荧光探针、根据第二方面所述的荧光传感器或根据第三方面所述的方法在检测b型利钠肽中的应用，所述应用为非疾病诊断或治疗目的。
30.如上所述，本发明的纳米生物荧光探针、荧光传感器及其在检测b型利钠肽中的应用，具有以下有益效果：
31.本发明构建了一种纳米生物荧光探针和荧光传感器，并基于此构建了一种在近红外区高效共振能量转移的荧光方法，通过共振能量转移效率的提高，大大提高检测b型利钠肽的灵敏度，最低检测限达45fg/ml，并且该方法稳定，可避免交叉干扰，无需对反应溶液进行耗时和繁琐的分离，也不需要磁珠分离，可以使成本降低，适宜推广。
附图说明
32.图1显示为本技术一实施例中基于在近红外区高效共振能量转移的荧光传感方法用于检测bnp；
33.图2显示为本技术一实施例中钯纳米材料的紫外-可见光谱图；
34.图3显示为本技术一实施例中钯纳米材料的紫外-可见吸收光谱(黑线)和cy5.5-aptamer的荧光发射光谱图(红线)；
35.图4显示为本技术一实施例中不同浓度钯纳米材料对cy5.5-aptamer荧光猝灭以及加入bnp后荧光恢复影响柱状图；
36.图5显示为本技术一实施例中不同ph值对cy5.5-aptamer荧光猝灭及加入bnp后荧光恢复影响柱状图；
37.图6显示为本技术一实施例中bnp使钯纳米材料/cy5.5-aptamer复合探针荧光恢复的影响光谱图；
38.图7显示为本技术一实施例中荧光恢复效率相对于bnp浓度的指数所拟合的线性关系。
具体实施方式
39.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
40.本技术一实施例提供了一种纳米生物荧光探针，包括钯纳米材料与吸附于所述钯纳米材料上的核酸适配体，所述核酸适配体上标记有荧光染料，所述钯纳米材料在600～1100nm范围内有强而宽的吸收。
41.在本技术的一具体实施方式中，所述核酸适配体为对b型利钠肽特异的核酸适配体，所述荧光染料修饰的核酸适配体的发射波长在708nm处；所述纳米生物荧光探针在用于
检测b型利钠肽的荧光传感器中作为复合探针使用，所述钯纳米材料作为能量受体，所述核酸适配体作为能量供体，所述钯纳米材料与核酸适配体之间的距离小于预设距离阈值时，两者会在近红外区发生荧光共振能量转移，导致荧光染料荧光猝灭；当样品中存在b型利钠肽时，b型利钠肽通过特异性结合力与所述核酸适配体结合形成复合物，以使所述核酸适配体远离所述钯纳米材料，使荧光染料荧光得以恢复，样品中b型利钠肽的浓度与荧光恢复程度呈正相关关系。
42.本发明实施例采用的钯纳米材料在近红外区域表现出可调节的表面等离子体共振吸收特性，除了独特的光学特性外，还具有较大的表面积，在生物水平上具有潜在的应用前景。本发明实施例基于钯纳米材料在600-1100nm范围内有较高能量吸收性质作为能量受体，发射波长在708nm的荧光染料修饰的核酸适配体作为能量供体，当两者距离足够近时，在近红外区发生高效共振能量转移，这个能量转移过程与bnp浓度呈线性正相关，特开发了一种简便、高灵敏和稳定的bnp检测方法，该方法无需磁珠分离，可以使成本降低。
43.在本技术的一具体实施方式中，所述钯纳米材料的制备方法包括如下步骤：将钯前驱体盐、柠檬酸、十六烷基三甲基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮溶解于有机溶剂中，再加入六羰基钨，通过溶剂热法进行反应；反应结束后将反应液冷却，离心得钯纳米材料。具体而言，将钯前驱体盐、柠檬酸、十六烷基三甲基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮加入有机溶剂中，使用纳米合成仪于500～800r/min转速下搅拌0.5～2h使其溶解，得到橙黄色溶液；在保护气体气氛下，向橙黄色溶液中加入六羰基钨，加热至75～85℃，通过溶剂热法反应0.5～2h，得到墨绿色反应液；反应结束后将反应液冷却，离心得钯纳米材料。
44.所述纳米片分散液的制备方法中，钯前驱体盐、柠檬酸、十六烷基三甲基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮与六羰基钨的摩尔用量比为1～2∶5～20∶2～10∶0.005～0.03∶5～10；所述钯前驱体盐为二价钯的前驱体盐，优选为乙酰丙酮钯；所述有机溶剂选自n,n-二甲基甲酰胺；所述保护气体选自氩气或氦气；反应结束后将反应液冷却至室温，加入丙酮，混匀后于8000～12000r/min的转速离心10～30min，弃去上清液，得到的下层沉淀即为钯纳米材料。
45.在本技术的一具体实施方式中，所述核酸适配体序列为：5
’‑
ttt ttt taa acg ctc aaa gga cag agg gtg cgt agg aag ggt att cga cag gag gct cac a-3’；进一步地，所述核酸适配体的5’端标记有荧光染料，优选地，所述荧光染料选自菁染料类、荧光素及其衍生物、罗丹明类，更优选为菁染料类，最优选为cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、cy7和cy7.5中的任意一种。
46.本发明另一实施例提供了一种检测b型利钠肽的荧光传感器，所述荧光传感器包括上述实施例所述的纳米生物荧光探针。
47.在本技术的一具体实施方式中，所述荧光传感器中，所述钯纳米材料的浓度为20～50μg/ml，优选为25～35μg/ml，更优选为30μg/ml。
48.在本技术的一具体实施方式中，所述荧光传感器反应体系ph为7.0～8.5，优选为7.0～8.0，更优选为7.4。
49.在本技术的一具体实施方式中，采用所述荧光传感器检测样品，在荧光分光光度计上测定溶液荧光强度的测定参数包括：激发波长675nm，发射波长为708nm，发射光谱扫描范围690～750nm。
50.在本技术的一具体实施方式中，所述荧光传感器在样品中b型利钠肽浓度为0.05
～10pg/ml时具有良好的线性关系；优选地，所述荧光传感器定量样品溶液中b型利钠肽浓度的标准曲线方程为：y＝0.98lnx+5.696(r＝0.9923)。
51.本发明另一实施例了提供了一种采用上述实施例所述的荧光传感器检测b型利钠肽的方法，所述方法非疾病或治疗目的，所述方法包括如下步骤：
52.将钯纳米材料分散液、缓冲液与标记有荧光染料的核酸适配体溶液混匀，静置；再加入待测样品溶液，混匀，静置，在荧光分光光度计上测定溶液的荧光强度。
53.在本技术的一具体实施方式中，所述缓冲液的ph为7.0～8.5，优选为7.0～8.0，更优选为7.4；所述缓冲液选自tris-hcl缓冲液、pbs缓冲溶液中的任意一种。
54.在本技术的一具体实施方式中，所述方法的操作过程在室温下进行。
55.在本技术的一具体实施方式中，钯纳米材料材料分散液与标记有荧光染料的核酸适配体溶液涡旋混匀后，静置5～15min后再加入待测样品溶液；加入待测样品溶液涡旋混匀后，静置20～40min后再在荧光分光光度计上测定溶液的荧光强度。
56.在本技术的一具体实施方式中，所述钯纳米材料分散液的制备方法包括如下步骤：将钯前驱体盐、柠檬酸、十六烷基三甲基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮溶解于有机溶剂中，再加入六羰基钨，通过溶剂热法进行反应；反应结束后将反应液冷却，离心得钯纳米材料，再将钯纳米材料分散于溶剂中制得钯纳米材料分散液。
57.在本技术的另一实施方式中，所述钯纳米材料分散液的制备方法包括如下步骤：将钯前驱体盐、柠檬酸、十六烷基三甲基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮加入有机溶剂中，使用纳米合成仪于500～800r/min转速下搅拌0.5～2h使其溶解，得到橙黄色溶液；在保护气体气氛下，向橙黄色溶液中加入六羰基钨，加热至75～85℃，通过溶剂热法反应0.5～2h，得到墨绿色反应液；反应结束后将反应液冷却，离心得钯纳米材料，再将钯纳米材料分散于溶剂中制得墨蓝色的钯纳米材料分散液。
58.在本技术的一具体实施方式中，所述钯纳米材料分散液的制备方法中，钯前驱体盐、柠檬酸、十六烷基三甲基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮与六羰基钨的摩尔用量比为1～2∶5～20∶2～10∶0.005～0.03∶5～10；所述钯前驱体盐为二价钯的前驱体盐，优选为乙酰丙酮钯；所述有机溶剂选自n，n-二甲基甲酰胺；所述保护气体选自氩气或氦气；反应结束后将反应液冷却至室温，加入丙酮，混匀后于8000～12000r/min的转速离心10～30min，弃去上清液，下层沉淀用无水乙醇重悬后超声分散，得到钯纳米材料分散液。
59.本技术另一实施例提供了根据如上述实施例所述的纳米生物荧光探针、根据如上述实施例所述的荧光传感器或根据如上述实施例所述的方法在检测b型利钠肽中的应用，所述应用为非疾病诊断或治疗目的。本技术的另一实施方式通过以下方法构建了一种纳米生物荧光探针、荧光传感器，并通过试验验证其在b型利钠肽检测中的效果。具体实施过程如下：
60.一、仪器与材料
61.1、仪器
62.rf-5301pc荧光分光光度计(岛津，日本)用来测定样品溶液的荧光强度；紫外可见光谱由uv-2600紫外可见分光光度计(岛津，日本)测定；x-射线衍射图谱是由x-射线粉末衍射仪(布鲁克，美国)测定；动态光散射(dls)数据由zetasizernano-zen3600粒度电位仪(malvem)测得；by-r18高速冷冻离心机(白洋医疗器械，北京)用于fam-aptamer冻干粉末和
干扰蛋白样品的离心；纳米合成仪用于纳米材料的合成。
63.2、材料
64.b型利钠肽(bnp)、氨基端脑钠肽前体(nt-probnp)、c反应蛋白(crp)、(hb)、心肌肌钙蛋白i(c tni)、心钠肽(anp)、脑钠肽前体(probnp)、c-型钠尿肽(cnp)、肌酸激酶同工酶mb(ck-mb)、肿瘤坏死因子-a(tnf-a)、白介素1(il-1)、白介素2(il-2)、白介素6(il-6)、白介素18(il-18)、乳铁蛋白(lf)、胆红素(bil)和d-二聚体(dd)购自西门子医疗诊断有限公司(美国)；钯纳米材料(pdnps)；谷氨酸(gul)、缬氨酸(val)、半胱氨酸(cys)、甘氨酸(lys)、人血清白蛋白(hsa)、牛血清白蛋白(bsa)、精氨酸(arg)和缩氨酸(thr)从sigma-aldrich(美国)购买；缓冲液(tris-hcl，0.1mol/l)用于调节反应溶液的酸度；实验用水为电阻率为18.2mωω
·
cm的超纯水；乙酰丙酮钯(ii)(c
10h14
o4pd-)、柠檬酸(c6h8o7)、十六烷基三甲基溴化铵(c
19h42
brn)、聚乙烯吡咯烷酮(pvp，分子量55000)、n，n-二甲基甲酰胺(c3h
t
no)、六羰基钨(6co.w)购自上海阿拉丁试剂公司；实验中所用的寡核苷酸链均由上海生工生物科技有限公司(中国上海)提供，序列如下：
65.对bnp特异的核酸适配体：5
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cy5.5-ttt ttt taa acg ctc aaa gga cag agg gtg cgt agg aag ggt att cga cag gag gct cac a-3’。
66.二、检测原理
67.如图1所示，钯纳米材料在600-1100nm范围内有强而宽的吸收，cy5.5染料修饰的核酸适配体cy5.5-aptamer的发射波长在708nm处，两者在近红外区距离足够近时发生荧光共振能量转移，导致荧光被高效猝灭；当样品中存在b型利钠肽bnp时，bnp通过特异性结合力与cy5.5-aptamer结合形成复合物，远离钯纳米材料，使荧光得以恢复，bnp与荧光恢复程度呈正相关关系。
68.三、pd纳米材料的制备及表征
69.1、pd纳米材料的制备方法包括以下步骤：
70.(1)称取乙酰丙酮钯(ii)32mg，柠檬酸180mg，十六烷基三甲基溴化铵120mg，pvp(分子量55000)60mg加入到50ml的圆底三颈烧瓶内，溶解于20ml的n,n-二甲基甲酰胺中。
71.(2)使用纳米合成仪以600r/min的转速搅拌1h，得到橙红色溶液(保证固体完全溶解)。
72.(3)在200ml/min的氩气气流和600r/min的转速搅拌下加入200mg六羰基钨，加热使反应温度上升至80℃并保持该温度搅拌反应1h，反应后所得溶液为墨绿色。
73.(4)冷却反应后的溶液至室温，在上述20ml产品中加入20ml丙酮，混匀后分装到两个50ml的离心管中，以10000r/min的转速离心20min，弃去上清液，每管的下层沉淀用10ml的无水乙醇重悬，超声分散后两管中的溶液合并在一起，最终所得的钯纳米材料分散液为墨蓝色溶液。
74.(5)放在4℃冰箱保存，每次用之前先超声1min再取溶液。
75.2、pd纳米材料的表征
76.分别采用紫外可见分光光度计、x-射线衍射仪、zetasizer nano-zen3600粒度电位仪对合成的pd纳米材料进行表征，具体如下：
77.通过使用紫外可见分光光度计对稀释后的材料进行扫描，将合成好的材料用无水乙醇稀释溶液至淡蓝色(300μg/ml)，使用紫外-可见分光光度计扫描其在200～1100nm范围
内的吸收强度。
78.图2是本实施例制备的pd纳米材料的紫外可见光谱图，可以看出，pd纳米材料在近红外区(600～1100nm)有一个强而宽的吸收。
79.图3是本实施例制备的pd纳米材料的紫外-可见吸收光谱(黑线)和cy5.5-aptamer的荧光发射光谱图(红线)，可以看出，两者在近红外区有较好的重叠，提高了荧光共振能量转移的效率。
80.四、溶液的配制及检测方法
81.1、cy5.5-aptamer储备液的制备
82.将cy5.5-aptamer的冻干粉末于6000rpm离心5min，加入800μl超纯水配制成2μmol/l的储备液，于4℃冰箱中保存。
83.tris-hcl(ph7.4)的配置：
84.(1)tris(0.1m)的配置：称取0.485g的tris溶于40ml的超纯水中。
85.(2)hcl(0.1m)的配置：用移液枪取210μl的盐酸(12m)滴入24ml的装有超纯水的试管中，加如790μl的超纯水使总体积为25ml。
86.(3)tris-hcl(ph7.4)的配置：取0.1m的tris25ml和0.1m的hcl 21ml于50ml的试管中，加超纯水4m1使总体积为5ml。
87.2、bnp标准品储备液的配置
88.使用移液枪向bnp冻干粉末中加入2ml的超纯水，室温下(20～30℃)平衡15～20min，使冻干粉末完全溶解，然后轻轻的旋转/颠倒试剂至均匀，配置的储备液的浓度为1471pg/ml，于-20℃冰箱中保存，临用前稀释。
89.3、pd纳米材料分散液浓度的测定方法
90.配置不同浓度的原料乙酰丙酮钯(ii)，使用2ml的王水将其氧化为钯离子，使用分光光度计测定200～450nm的紫外吸收，以浓度为横坐标，以275nm处的紫外吸收光强度为纵坐标，建立标准曲线。
91.取200μl通过测定步骤一合成的pd纳米材料分散液，使用2ml的王水将钯纳米材料氧化为钯离子，待反应完全，即溶液由墨蓝色变为无色或淡黄色，然后使用超纯水进行稀释，使用紫外可见分光光度计测定200～450nm的紫外吸收，将275nm的紫外吸收值带入标准曲线，计算原pd纳米材料分散液的浓度。
92.4、检测方法：
93.空白组1：在1.5ml离心管中依次加入100μltris-hcl缓冲液(ph 7.4)、10μlcy5.5-aptamer(100nmol/l)加超纯水补充至总体积为400μl并涡旋混匀，在荧光分光光度计上测定溶液的荧光强度(激发波长为675nm；发射波长为708nm；发射光谱扫描范围：690-750nm；扫描速度：very fast；狭缝宽度：ex：5nm，em：5nm)，测定的荧光强度记为f0。
94.空白组2：在1.5ml离心管中依次加入100μltris-hcl缓冲液(ph 7.4)、10μlcy5.5-aptamer溶液(100nmol/l)和15μlpd纳米材料分散液(800μg/ml)，加超纯水补充至总体积为400μl，涡旋混匀，室温下静置10min；在荧光分光光度计上测定溶液的荧光强度(激发波长为675nm；发射波长为708am，发射光谱扫描范围：690-750nm；扫描速度：very fast；狭缝宽度：ex：5nm，em：5nm)，测定的荧光强度记为f。
95.实验组：在1.5ml离心管中依次加入100μl tris-hcl缓冲液(ph 7.4)、15μlpd纳米
材料分散液(800μg/ml)与10μl的cy5.5-aptamer(100nmol/l)涡旋混匀，静置10min，再加入一定浓度的bnp的样品溶液，加超纯水补充至总体积为400μl，涡旋混匀，室温下静置30min；在荧光分光光度计上测定溶液的荧光强度(激发波长为675nm；发射波长为708nm，发射光谱扫描范围：690-750nm；扫描速度：very fast；狭缝宽度：ex：5nm，em：5nm)，测定的荧光强度记为f1。
96.五、影响因素考察
97.参照上述方法，研究pd纳米材料浓度和体系ph对检测结果的影响，具体如下：
98.1、pd纳米材料浓度的影响：
99.将100μl的tris-hcl缓冲液(ph 7.4)与10μl的cy5.5-aptamer(100nmol/l)混合后用超纯水定容到400μl测荧光强度，记为f0；依次将不同浓度的pd纳米材料分散液加入100μl的tris-hcl缓冲液(ph 7.4)与10μl的cy5.5-aptamer(100nmol/l)的混合夜中，定容至400μl，静置10分钟后测荧光强度，记为f；将相同浓度的bnp的样品溶液加入到上述混合液中，用超纯水定容至400μl，涡旋混匀，室温下静置30min，按步骤三检测方法中设定的荧光参数进行测定，测得的荧光强度记为f1。
100.pd纳米材料浓度为0～70μg/ml时，cy5.5-aptamer的荧光发射强度如图3所示。由图6可知，随pd纳米材料浓度的增加，cy5.5-aptamer的荧光强度逐渐降低，pd纳米材料浓度为30μg/ml时，荧光恢复效率(f1/f)最高，故将pd纳米材料浓度为30μg/ml选为后续实验最优条件。
101.2、体系ph的影响：
102.配置ph值为6.5的pbs缓冲溶液和7.0、7.4、8.0、8.5的tris-hcl缓冲液与10μl的cy5.5-aptamer(100nmol/l)混合后用超纯水定容到400μl测荧光强度，记为f0，依次将不同浓度的pd纳米材料分散液加入100μl的不同ph缓冲液与10μl的cy5.5-aptamer(100nmol/l)的混合夜中，定容至400μl，静置10min后测荧光强度，记为f；将相同浓度的bnp的样品溶液加入到上述混合液中，用超纯水定容至400μl，涡旋混匀，室温下静置30min，按步骤三检测方法中设定的荧光参数进行测定，测得的荧光强度记为f1。每组实验重复三次。
103.测定结果如图7所示。由图5可知，固定浓度的pd纳米材料对探针荧光的猝灭效率在不同ph值下几乎保持不变，而荧光恢复效率随着ph值增加而增强。综合考虑，选择ph 7.4这一生理缓冲值作为后续检测条件。
104.六、标准曲线的绘制
105.在1.5ml离心管中依次加入100μl tris-hcl缓冲液(ph 7.4)、15μl pd纳米材料分散液(800μg/ml)与10μl的cy5.5-aptamer(100nmol/l)涡旋混匀，静置10min，再加入不同浓度的bnp的样品溶液，加超纯水补充至总体积为400μl，涡旋混匀，室温下静置30min，在荧光分光光度计上测定溶液的荧光强度(激发波长为675nm；发射波长为708nm，发射光谱扫描范围：690-750nm；扫描速度：very fast；狭缝宽度：ex：5nm，em：5nm)，测定的荧光强度记为f1，重复做三次实验。
106.由图6可知，cy5.5-aptamer的荧光强度随着bnp浓度的增加而逐渐恢复。由图7可知，以荧光恢复效率f1/f为纵坐标，bnp浓度的对数为横坐标，拟合线性，在0.05～10pg/ml的浓度范围内具有良好的线性关系，标准曲线方程为：y＝0.98lnx+5.696(r＝0.9923)，最低检测限达45fg/ml。因此，本发明提供的方法简便、快速、灵敏度高，可根据线性方程定量
样品溶液中的bnp。
107.上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。

技术特征：
1.一种纳米生物荧光探针，其特征在于，包括钯纳米材料与吸附于所述钯纳米材料上的核酸适配体，所述核酸适配体上标记有荧光染料，所述钯纳米材料在600～1100nm范围内有强而宽的吸收。2.根据权利要求1所述的纳米生物荧光探针，其特征在于：所述核酸适配体为对b型利钠肽特异的核酸适配体，所述荧光染料修饰的核酸适配体的发射波长在708nm处。3.根据权利要求2所述的纳米生物荧光探针，其特征在于：所述纳米生物荧光探针在用于检测b型利钠肽的荧光传感器中作为复合探针使用，所述钯纳米材料作为能量受体，所述核酸适配体作为能量供体，所述钯纳米材料与核酸适配体之间的距离小于预设距离阈值时，两者会在近红外区发生荧光共振能量转移，导致荧光染料荧光猝灭；当样品中存在b型利钠肽时，b型利钠肽通过特异性结合力与所述核酸适配体结合形成复合物，以使所述核酸适配体远离所述钯纳米材料，使荧光染料荧光得以恢复，样品中b型利钠肽的浓度与荧光恢复程度呈正相关关系。4.根据权利要求2所述的纳米生物荧光探针，其特征在于：所述核酸适配体序列为：5
’‑
ttt ttt taa acg ctc aaa gga cag agg gtg cgt agg aag ggt att cgacag gag gct cac a-3’。5.一种检测b型利钠肽的荧光传感器，其特征在于：所述荧光传感器包括权利要求1～4任一项所述的纳米生物荧光探针。6.根据权利要求5所述的检测b型利钠肽的荧光传感器，其特征在于：所述荧光传感器中，所述钯纳米材料的浓度为20～50μg/ml；和/或，所述荧光传感器反应体系ph为7.0～8.5；和/或，采用所述荧光传感器检测样品，在荧光分光光度计上测定溶液荧光强度的测定参数包括：激发波长675nm，发射波长为708nm，发射光谱扫描范围690～750nm；和/或，所述荧光传感器在样品中b型利钠肽浓度为0.05～10pg/ml时具有良好的线性关系。7.一种采用权利要求5～6任一项所述的荧光传感器检测b型利钠肽的方法，其特征在于，所述方法非疾病或治疗目的，所述方法包括如下步骤：将钯纳米材料分散液、缓冲液与标记有荧光染料的核酸适配体溶液混匀，静置；再加入待测样品溶液，混匀，静置，在荧光分光光度计上测定溶液的荧光强度。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述缓冲液的ph为7.0～8.5；和/或，所述缓冲液选自tris-hcl缓冲液、pbs缓冲溶液中的任意一种；和/或，所述方法的操作过程在室温下进行。9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：钯纳米材料材料分散液与标记有荧光染料的核酸适配体溶液涡旋混匀后，静置5～15min后再加入待测样品溶液；和/或，加入待测样品溶液涡旋混匀后，静置20～40min后再在荧光分光光度计上测定溶液的荧光强度。10.根据权利要求1～4任一项所述的纳米生物荧光探针、根据权利要求5～6任一项所述的荧光传感器或根据权利要求7～8任一项所述的方法在检测b型利钠肽中的应用，所述应用为非疾病诊断或治疗目的。

技术总结
本发明属于医学及生物化学技术领域，具体公开了一种纳米生物荧光探针、荧光传感器及其在检测B型利钠肽中的应用。所述纳米生物荧光探针包括钯纳米材料与吸附于所述钯纳米材料上的核酸适配体，所述核酸适配体上标记有荧光染料，所述钯纳米材料在600～1100nm范围内有强而宽的吸收；所述荧光传感器包括所述纳米生物荧光探针，所述核酸适配体为对B型利钠肽特异的核酸适配体，所述荧光染料修饰的核酸适配体的发射波长在708nm处；所述钯纳米材料与核酸适配体距离足够相近时在近红外区会发生荧光共振能量转移，通过荧光供体与受体之间的能量转移过程实现心衰标志物B型利钠肽的检测，具有操作简单、灵敏度高以及稳定的优点。灵敏度高以及稳定的优点。灵敏度高以及稳定的优点。


技术研发人员：张普 李孟娇 王燚
受保护的技术使用者：重庆医科大学
技术研发日：2023.03.08
技术公布日：2023/7/31