与美洲南瓜侧枝多少相关基因紧密连锁的分子标记及应用

1.本发明属于分子标记技术领域，具体涉及与美洲南瓜侧枝数量相关基因紧密连锁的分子标记及应用。
技术背景
2.育种技术快速发展，以基因编辑技术为代表的第五代育种技术即将应用于生产。基因编辑必须以调控关键性状的基因为靶点，是实现基因功能和育种的定向选育的基础。因此，重点候选基因和其功能的确定，具有至关重要的作用。育种过程中的目的性状选择很大程度上也依赖于基因型和表型，传统的育种技术通过表型鉴定，不仅周期长，而且受环境影响，而分子标记辅助选择技术，具有准确、快速、高效等特点，在越来越多的作物中得到广泛的应用。以图位克隆为基础的紧密连锁分子标记的开发和应用，是当今育种领域的热点和主要竞争领域。
3.南瓜是世界上普遍栽培的蔬菜之一，其中亚洲栽培面积最大。中国是全世界南瓜栽培面积最大和产量最高的国家之一。近些年，随着国家经济的快速发展，南瓜这种以安全、绿色和健康为代表作物的重要园艺产品在生产上备受推崇。这也加快了传统品种的更新换代速度，因此，分子标记的开发和辅助选择育种也在南瓜属逐渐展开，但整体上进度缓慢，且严重缺乏大量可靠的分子标记。
4.葫芦科作物具有长蔓结果的特性，而今为了适应现代化的高效种植和采收模式，中短蔓结果，少或无侧枝的种质是重要的育种方向，其目的在于减少整枝和打杈等工序造成的成本。在西瓜、甜瓜和黄瓜等葫芦科作物中，相继报道了少侧枝或无侧枝等相关的紧密连锁标记和图位克隆基因，但美洲南瓜(cucurbita pepｏ)的育种起步晚，标记开发与定位等报道非常有限，且至今未见侧枝等相关性状的报道。因此，进行美洲南瓜侧枝数量相关紧密连锁标记的开发适合于简约化栽培的要求，且对于构建辅助选择育种体系、种质资源的改良、新品种选育等具有重要的意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的之一在于提供两对与美洲南瓜侧枝数量相关基因紧密连锁的分子标记。
6.本发明的目的之二在于提供上述与美洲南瓜侧枝数量相关基因紧密连锁的分子标记的应用。
7.为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
8.本发明公开了两对与美洲南瓜侧枝数量相关基因紧密连锁的分子标记，位于美洲南瓜第2号染色体上，所述分子标记为indel415和indel555。
9.扩增与美洲南瓜侧枝数量相关基因紧密连锁的分子标记引物对，所述分子标记indel415对应的引物对序列为：
10.indel415-f：aagcttcaccactttgagaca(seq id no.1)；
11.indel415-r：tgactcgaacaacctgaatca(seq id no.2)；
12.所述分子标记indel555对应的引物对序列为：
13.indel555-f：agcttcatgtttatgcccagt(seq id no.3)；
14.indel555-r：acgtccaattgttagtgcgt(seq id no.4)。
15.本发明还公开了上述分子标记引物对在美洲南瓜辅助育种中的应用。也就是说本发明的分子标记可用于今后的分子标记辅助育种中，通过苗期提取叶片的dna，检测是否存在本发明的分子标记，进而来筛选美洲南瓜品种的少/无侧枝相关性状。所述检测可以使用pcr检测的方法，具体可以使用上述的本发明的分子标记引物对，所述检测还可以通过测序方法进行。
16.另外，上述分子标记还可以对在美洲南瓜侧枝数量相关基因定位。上述这些应用均可以按照常规的方法进行。
17.本发明还公开了上述分子标记在鉴定美洲南瓜幼苗期性状中的应用，尤其是在筛选和鉴定美洲南瓜少/无侧枝中的应用，其中，美洲南瓜侧枝数量性状主要包括整株无侧枝、基部少量侧枝和整株侧枝数量较多，用于鉴定侧枝多少性状的具体步骤如下：
18.(1)以供试种质的dna为pcr扩增的模板，以标记indel415或/和indel555为引物，pcr扩增的反应体系如表1：
19.表1 pcr扩增的反应体系
[0020][0021][0022]
pcr扩增程序：第一阶段，95℃、5miｎ；第二阶段，94℃、30s，62℃、45s，72℃、1min，共9个循环；第三阶段，94℃、20s，58℃、30s，72℃、1min，共7个循环；第四阶段，94℃、30s，50℃、30s，72℃、1min，共10个循环；第五阶段，72℃、7min；4℃保存。
[0023]
(2)pcr产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：取1μl，根据条带的结果判断美洲南瓜侧枝数量的结果。
[0024]
利用引物对indel415-f和indel415-r，如果仅能扩增出215bp单一条带，则美洲南瓜种质为少或无侧枝类型；如果能扩增出230bp单一条带，或者215bp和230bp双条带，则美洲南瓜种质为基部多侧枝或整株多侧枝；或/和，利用引物对indel555-f和indel555-r，以美洲南瓜材料基因组dna为模板进行扩增，如果仅能扩增出244bp单一条带，则美洲南瓜种质为少或无侧枝类型，如果能扩增出23lbp单一条带，或者244bp和231bp双条带，则美洲南瓜种质为基部多侧枝或整株多侧枝。
[0025]
其中，215bp条带，其碱基序列如序列表中seq id no.5所示；230bp条带，其碱基序列如序列表中seq id no.6所示；244bp条带，其碱基序列如序列表中seq id no.7所示，231bp条带，其碱基序列如序列表中seq id no.8所示。
[0026]
本发明具有如下优点：
[0027]
(1)本发明获得了两个与美洲南瓜侧枝数量相关基因紧密连锁的分子标记indel415/indel555，标记indel415和基因的遗传距离为11.49cm，标记indel555和基因的遗传距离为11.69cm，利用这一结果，可为最终实现与美洲南瓜侧枝数量相关基因cpelb2.1的克隆奠定基础，进而为南瓜侧枝形成的分子机制研究奠定基础。
[0028]
(2)以标记indel415和indel555进行性状准确度的鉴定，f2群体466株中基因型和表型的吻合度为64.8％，有利于实现精准育种。
[0029]
(3)用与侧枝数量(多/少)性状的连锁的标记来进行筛选，有利于分子标记辅助选择育种，其方法简单可行，有利于提高效率，节省成本。
[0030]
(4)本发明的分子标记具有检测方便、扩增产物稳定、特异性高的特点，可以简便、快速、高通量地应用于美洲南瓜育种实践及品种鉴定。
附图说明
[0031]
图1是indel-index关联值在染色体上的分布；
[0032]
图中，横坐标为染色体名称，彩色的点代表计算出来的indel-index(或δindel-index)值，黑色的线为拟合后的indel-index(或δindel-index)值。上图是隐性混池的indel-index值的分布图；中图是显性混池的indel-index值的分布图；下图是δindel-index值的分布图，其中红色的线代表99百分位数的阈值线；
[0033]
图2是利用qtl icimapping制作的遗传连锁图谱；
[0034]
图3是分子标记indel415在亲本、f1和f2群体中的验证；
[0035]
图中，泳道4为marker，2000bp；泳道1为p1(296)读为“1”隐性，泳道2为p2(356)读为“2”显性，泳道3为f1读为“3”显性，其它泳道为55株f2群体，读胶参考p1、p2、f1来读带，无条带或无法确定读为“4”；
[0036]
图4是分子标记indel555在亲本、f1和f2群体中的验证；
[0037]
图中，泳道5为marker，2000bp；泳道1为p1(296)读为“1”隐性，泳道2为p2(356)读为“2”显性，泳道3为f1读为“3”显性，其它泳道为57株f2群体，读胶参考p1、p2、f1来读带，无条带或无法确定的读为“4”。
具体实施方式
[0038]
下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
[0039]
如果在通篇说明书及权利要求中提及的“包含”或“包括”这一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为本发明的较佳实施方式，然所述描述是以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
[0040]
本发明所选用的材料和试剂如无特殊说明，均能从市场上购买得到。
[0041]
以下实施例以多侧枝美洲南瓜“356”为母本，以少侧枝美洲南瓜“296”为父本，构建了466株的f2分离群体；通过集群分离法(bsa，30株)进行初步定位，结合亲本测序对候选区间标记进行开发，并以f2群体进行了标记的共分离验证。筛选到与侧枝多少紧密连锁的标记indel415和indel555，该标记可用于美洲南瓜侧枝多少/有无的筛选和苗期鉴定。具体如下：
[0042]
材料说明
[0043]
美洲南瓜材料“356”和“296”，均可以通过种质库(国家农作物种质资源平台-蔬菜种质资源子平台)或河南省果树瓜类生物学重点实验室获取。
[0044]
对上述两材料的侧枝多少的田间鉴定显示，296为无侧枝或少侧枝，356为多侧枝，f1为多侧枝。
[0045]
一、遗传分离群体的构建
[0046]
2019年春季对美洲南瓜材料的亲本“356”和“296”进行杂交，获取f1(356
×
296)，f1自交后获得f2代，然后对466株f2分离群体进行表型鉴定和遗传分析，结果显示296为无侧枝，356为多侧枝，f1表型和亲本356吻合，且f2对有无侧枝的分离比例约为1：3(表2)。以上表明：有侧枝对无侧枝为单基因控制的显性性状，将该基因命名为cpelb2.1。
[0047]
表2美洲南瓜p1(356)
×
p2(296)的f2群体侧枝多少遗传规律分析
[0048][0049]
二、美洲南瓜遗传图谱构建和侧枝多少的初步定位
[0050]
1、美洲南瓜基因组dna的提取
[0051]
使用ctab法提取美洲南瓜亲本及f2群体基因组dna，提取的单株dna用于遗传图谱的构建及分析；
[0052]
2、遗传图谱的构建和分析
[0053]
利用30株无侧枝和30株多侧枝进行illumina hiseq的基因组重测序，通过bsa-indel标记的分析方法将候选基因定位于2号1.96mb的区间，共有297个基因，indel-index关联值在染色体上的分布见图1所示。
[0054]
将466株f2群体进行聚丙烯酰胺凝胶电泳进行基因分型，将其基因型与田间统计表型进行对比、分析、统计、转换制作遗传图谱。选用indel054、indel092、indel012、indel088、indel076、indel035、indel135、indel836、indel485、indel808、indel415、indel555、indel393、indel809标记进行图谱的构建和分析，使用qtl icimapping软件初步定位cpelb2.1基因。结果表明：cpelb2.1基因位于标记indel415和ｉｎdel555之间(图2)，标记indel415和cpelb2.1基因的遗传距离为11.9cm，标记ｉｎde1555和cpelb2.1基因的遗传
距离为2.5cm。
[0055]
三、与cpelb2.1基因紧密连锁标记的引物设计
[0056]
根据标记所在的位置，以上下游150bp核苷酸序列为模板，提取序列到primer5中，设计in-del引物，分子标记indel054、inde1092、indel012、indel088、indel076、indel035、ｉｎdel135、ｉｎdel836、indel485、indel808、indel415、indel555、indel393、indel809扩增长度分别是119bp、274bp、252bp、119bp、157bp、217bp、238bp、192bp、235bp、258bp、215bp、244bp、247bp、219bp。
[0057]
标记ｉｎdel054的引物序列为：f：ggcaccttttggattgggt；
[0058]
r：cttggtggccattgcagc；
[0059]
标记ｉｎdel092的引物序列为：f：ggtcgggttggcttggaa；
[0060]
r：tccaatggaaaggcccaa；
[0061]
标记ｉｎdel012的引物序列为：f：tggctgccgagaaacctt；
[0062]
r：gaggaacgtcgacaaagttga；
[0063]
标记ｉｎdel088的引物序列为：f：tgtcggctgtctatcacga；
[0064]
r：gggtgggggaggggttat；
[0065]
标记ｉｎdel076的引物序列为：f：actcgcttgcgttagggt；
[0066]
r：tcacgccctgtttggatcc；
[0067]
标记indel035的引物序列为：f：tggtctagattgggttctcgg；
[0068]
r：agccaaaagtttgtgcgct；
[0069]
标记indel135的引物序列为：f：tggttgtatgcctccgaga；
[0070]
r：actctctcctccaatcccatg；
[0071]
标记indel836的引物序列为：f：ggttgtcgaccccacaaga；
[0072]
r：gattcgagtatgtgggttggt；
[0073]
标记ｉｎdel485的引物序列为：f：ggacttggctcaatacacaca；
[0074]
r：aaccatgcggcgtcatga；
[0075]
标记ｉｎdel808的引物序列为：f：aggggtttggagacgtacc；
[0076]
r：gtcgtgggttcgatcccc；
[0077]
标记ｉｎdel415的引物序列为：f：aagcttcaccactttgagaca；
[0078]
r：tgactcgaacaacctgaatca；
[0079]
标记ｉｎdel555的引物序列为：f：agcttcatgtttatgcccagt；
[0080]
r：acgtccaattgttagtgcgt；
[0081]
标记indel393的引物序列为：f：acgacgacacgtatcggg；
[0082]
r：caccgtggatgctccctt；
[0083]
标记indel809的引物序列为：f：tggaaaggtcctagagggct；
[0084]
r：tcaaagtggactccttgcca；
[0085]
其中，indel415，indel555与cpelb2.1基因遗传距离最近，约为0.1mb，所以选择indel415，ｉｎdel555为最佳分子标记。
[0086]
与cpelb2.1基因紧密连锁的分子标记ｉｎdel415扩增出如seq id no.5所示的序列，长度为215bp。其中标记ｉｎdel415在无侧枝或少侧枝单株中扩增出215bp(seq id no.5
所示)的单一条带，在多侧枝单株中扩增出230bp(seq id no.2所示)的单一条带或215bp和230bp双条带。如图3泳道1为p1(296)读为“1”隐性，泳道2为p2(356)读为“2”显性，泳道3为f1读为“3”显性；亲本p2(356)相对于p1(296)有15bp的插入导致双亲的条带存在差异。
[0087]
seq id no.5的序列：aagcttcaccactttgagacattttttttttatatttatttattattaaataatgaacagaactcaatccaactataaattttttgagataagttggttcactgaccctaatgaaccaaactcaatccaaccataaattttttgagataagttcgttcagattgatccaactcaatccaaccataaatttttattgattcaggttgttcgagtca；共215bp。
[0088]
seq id no.6的序列：aagcttcaccactttgagacattttttttttatatctaacttaaccaccattatttattattaaataatgaacagaactcaatccaactataaattttttgagataagttggttcactgaccctaatgaaccaaactcaatccaaccataaattttttgagataagttcgttｃagattgatccaactcaatccaaccataaatttttattgattcaggttgttcgagtca；共230bp。
[0089]
与cpelb2.1基因紧密连锁的分子标记indel555扩增出如seq id no.7所示的序列，长度为244bp。其中标记ｉｎdel555在无/少侧枝中扩增出244bp(seq id no.7所示)的单一条带，在有/多中扩增出231bp(seq id no.8所示)的单一条带或244bp和231bp双条带。如图4泳道1为p1(296)读为“1”隐性，泳道2为p2(356)读为“2”显性，泳道3为f1读为“3”显性；亲本p2(356)相对于p1(296)有13bp的缺失导致双亲的条带存在差异。
[0090]
seq id no.7的序列：agcttcatgtttatgcccagtttctatttatgttaatgcccatttctagaaaccaaaatacttcaatttttactactttcttctatttacctatttactatttacaattactattctagggtttatataatattcatagggtaacctaccctttatatatatatatatattcttgtcttatttgatgattgattcggtaｔagtgctaaatttgaataattagtaacgcactaacaattggacgt，共244bp。
[0091]
seq id no.8的序列：agcttcatgtttatgcccagtttctatttatgttaatgcccatttctagaaaccaaaatacttcaatttttactactttcttctaｔttacctatttactattctagggtttatataatattcatagggtaacctaccctttatatatatataiatattcttgtcttatttgatgattgattcggtaｔagtgctaaatttgaａtaattagtaacgcactaacaattggacgt，共231bp。
[0092]
这些分子标记稳定性高、重复性好，将在美洲南瓜侧枝多少相关基因分子标记辅助育种体系的构建中起到关键作用。
[0093]
四、标记在亲本和后代分离群体中的检测
[0094]
以亲本“356”、“296”、f1和f2的dna为模板，用indel415和indel555标记分别进行pcr扩增，实验结果分别见图3、图4。并且为了进一步获得表型和基因型共分离的标记，增加标记的准确性，我们利用标记indel415和indel555对f2群体进行了pcr扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测，结果表明：cpelb2.1位于indel415和indel555两个分子标记之间。
[0095]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.与美洲南瓜侧枝数量相关基因紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记为indel415和indel555，位于美洲南瓜第2号染色体上，所述分子标记indel415对应的引物对序列为：indel415-f：aagcttcaccactttgagaca；indel415-r：tgactcgaacaacctgaatca；所述分子标记indel555对应的引物对序列为：indel555-f：agcttcatgtttatgcccagt；indel555-r：acgtccaattgttagtgcgt。2.权利要求1中所述的分子标记在美洲南瓜分子标记辅助育种中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述分子标记用于鉴定或辅助鉴定美洲南瓜侧枝数量性状。4.权利要求1所述的分子标记在美洲南瓜侧枝数量相关基因定位中的应用。5.一种美洲南瓜侧枝数量性状鉴定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)提取待测美洲南瓜基因组dna；(2)以步骤(1)中所提取基因组dna为模板，利用权利要求1所述分子标记的引物对进行pcr扩增，对pcr扩增产物进行电泳检测和/或测序；(3)根据步骤(2)的电泳条带和/或测序结果进行判定，具体标准为：对于分子标记indel415，利用引物对indel415-f、indel415-r，如果pcr扩增产物为如seq id no.5所示的长度为215bp的特征条带，则美洲南瓜为少/无侧枝类型；如果pcr扩增产物为如seq id no.5所示的长度为230bp的特征条带，或者既有一条如seq id no.5所示的长度为215bp的特征条带，又有一条如seq id no.6所示的长度为230bp的特征条带，则美洲南瓜为多侧枝类型；对于分子标记indel555，利用引物对indel555-f、indel555-r，如果pcr扩增产物为如seq id no.7所示的长度为244bp的特征条带，则美洲南瓜为少/无侧枝类型；如果pcr扩增产物为如seq id no.8所示的长度为231bp的特征条带，或者既有一条如seq id no.7所示的长度为244bp的特征条带，又有一条如seq id no.8所示的长度为231bp的特征条带，则美洲南瓜为多侧枝类型。6.一种用于美洲南瓜侧枝数量性状的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1中所述的任何一对或者两对引物对。

技术总结
本发明公开了一种与美洲南瓜侧枝数目相关基因紧密连锁的分子标记及应用。利用标记开发和基因定位技术，首次对侧枝数量性状进行了定位与分析，获得了一个与侧枝数量性状紧密连锁的、具有多态性的、稳定可靠的In-Del分子标记即Indel415和Indel555。本发明中的分子标记可用于CpeLB2.1(Cucurbita pepo lateral branch)基因的克隆和功能分析，同时可用于自然群体和不同侧枝数量的杂交群体后代进行分子标记的辅助选择。该方法简单，快速，准确，有利于简约株型种质的筛选和利用，不但加速育种进程，而且提高育种效率。而且提高育种效率。而且提高育种效率。


技术研发人员：李严曼 朱磊 王永 杨路明 孙守如 胡德菊
受保护的技术使用者：河南农业大学
技术研发日：2023.03.07
技术公布日：2023/7/31