一种可提高体外合成RNA产量的转录缓冲液及转录反应体系的制作方法

一种可提高体外合成rna产量的转录缓冲液及转录反应体系
技术领域
1.本发明涉及生物检测领域，尤其是涉及一种可提高体外合成rna产量的转录缓冲液及转录反应体系。


背景技术：

2.mrna疫苗是将编码疾病特异性抗原的mrna通过递送系统引入体内，利用宿主细胞的蛋白质合成机制产生抗原，从而触发免疫应答。除了疫苗，mrna技术作为通用性平台技术，理论上mrna具有合成任意一种蛋白的潜能，有可能一定程度上替代和补充蛋白质疗法。2020年全球首个mrna疫苗的成功上市标志mrna技术进入商业化时代，随着前期的技术积累的迫切需求，mrna技术进入快速发展时期。尽管如此，mrna疗法的大发展还有待进一步的技术突破。
3.mrna疫苗的生产主要包括：dna模板序列的设计与制备、mrna原液的制备及纯化、脂质纳米颗粒包裹等步骤。mrna原液制备过程直接影响mrna的质量和生产成本，其中体外转录合成mrna的产量和质量是影响mrna原液的制备工艺关键因素。
4.体外转录是指在体外无细胞体系中，以包含启动子区域的线性dna为模板，添加rna聚合酶，转录缓冲液和核苷酸等原料，模拟体内转录生成rna的过程。体外转录反应体系中需要：(1)含有t7启动子的线性化质粒模板；(2)4种游离核苷酸；(3)rna酶抑制剂，抑制体外转录反应体系里可能存在的rnase；(4)无机焦磷酸酶，降解ivt反应积累的焦磷酸；(5)转录缓冲液，含镁离子、抗氧化剂以及多胺。
5.转录缓冲液中，镁离子作为t7 rna polymerase的辅因子，对于t7酶的活性至关重要。但镁离子浓度过高会导致转录副产物dsrna的大量生成，dsrna可以通过rig-i/mda-5-mavs途径激活先天免疫，从而削弱mrna翻译；同时会导致转录时产生大量焦磷酸镁，由于焦磷酸镁溶解性差，会连带产物rna析出，从而使反应体系出现沉淀，大大降低反应产量。


技术实现要素：

6.基于上述技术问题，本技术提供了一种可提高体外合成rna产量的转录缓冲液及转录反应体系。
7.本技术的第一发明目的在于提供一种可提高体外合成rna产量的转录缓冲液，采用如下技术方案：一种可提高体外合成rna产量的转录缓冲液，包括如下终浓度的各组分：tris-hcl盐300～500mm；醋酸镁300～460mm；亚精胺10～30mm；二硫苏糖醇50～200mm。
8.本技术涉及的转录缓冲液中采用的镁离子盐型为醋酸镁，醋酸镁中的镁离子浓度较低，可减少转录副产物以及反应体系沉淀的生成，并且通过实验筛选出最佳浓度的醋酸
镁，可大幅度地提升rna的产量。
9.优选的，所述转录缓冲液包括如下终浓度的各组分：tris-hcl盐350～450mm；醋酸镁300～460mm；亚精胺15～25mm；二硫苏糖醇80～150mm。
10.优选的，所述转录缓冲液包括如下终浓度的各组分：tris-hcl盐350～450mm；醋酸镁400～460mm；亚精胺15～25mm；二硫苏糖醇80～150mm。
11.优选的，所述转录缓冲液包括如下终浓度的各组分：tris-hcl盐350～450mm；醋酸镁300～350mm；亚精胺15～25mm；二硫苏糖醇80～150mm。
12.优选的，所述转录缓冲液包括如下终浓度的各组分：tris-hcl盐400mm；醋酸镁400～460mm；亚精胺20mm；二硫苏糖醇100mm。
13.优选的，所述转录缓冲液包括如下终浓度的各组分：tris-hcl盐400mm；醋酸镁460mm；亚精胺20mm；二硫苏糖醇100mm。
14.本技术的转录缓冲液中醋酸镁的浓度在400～460mm时，rna产量和rna完整性都比较高。
15.本技术的转录缓冲液中醋酸镁的浓度在300～350mm时，和同等浓度的氯化镁相比，rna产量和rna完整性较高。
16.本技术的转录缓冲液中醋酸镁的浓度从400～460mm降至300～350mm时，和氯化镁的浓度从400～460mm降至300～350mm时，rna产量和rna完整性下降幅度较小。
17.优选的，当醋酸镁浓度为300～350mm时，和同等浓度的氯化镁相比，rna产量可提升120％～325％。
18.优选的，当醋酸镁浓度为350mm时，和同等浓度的氯化镁相比，rna产量可提升120％。
19.优选的，当醋酸镁浓度为300mm时，和同等浓度的氯化镁相比，rna产量可提升325％。
20.通过采用上述技术方案，相比于氯化镁(mgcl2)而言，醋酸镁(mgac2)在较低镁离子
浓度下对于保障体外共转录反应浓度和产量上更加有优势。
21.优选的，当醋酸镁浓度为300～350mm时，和同等浓度的氯化镁相比，rna完整性提升0.5～2％。
22.优选的，在tris盐型帽类似物和tris盐型ntp条件下，当醋酸镁浓度为350mm时，和同等浓度的氯化镁相比，rna完整性提升2％。
23.优选的，在tris盐型帽类似物和tris盐型ntp条件下，当醋酸镁浓度为300mm时，和同等浓度的氯化镁相比，rna完整性提升1.5％。
24.优选的，在铵盐型帽类似物和钠盐型ntps条件下，当醋酸镁浓度为350mm时，和同等浓度的氯化镁相比，rna完整性提升0.5％。
25.优选的，在铵盐型帽类似物和钠盐型ntps条件下，当醋酸镁浓度为300mm时，和同等浓度的氯化镁相比，rna完整性提升2％。
26.相比于氯化镁(mgcl2)而言，醋酸镁(mgac2)在较低镁离子浓度下对于保障体外共转录反应产物完整性上更加有优势。
27.本技术的第二发明目的在于提供一种转录反应体系，包括上述的转录缓冲液、t7 rna polymerase mix以及tris盐型的帽类似物和tris盐型的ntps。
28.钠离子与铵离子是共转录反应体系中常见的阳离子，相关研究发现，钠离子浓度过高会对t7酶的活性造成抑制，从而影响体外转录的产量。而共转录体系中钠离子与铵离子往往是由帽类似物及游离核苷酸ntps引入的，因此选择合适的帽类似物及ntp盐型参与共转录反应至关重要。发明人通过大量的实验发现，tris盐型的帽类似物和ntp相比于钠盐型，在共转录产量、产物质量及dsrna的控制等多个方面具有明显优势。
29.优选的，所述t7 rna polymerase mix包括t7 rna polymerase、鼠源r nase抑制剂和无机焦磷酸镁。
30.本技术在t7 rna聚合酶混合体系中，除添加t7 rna聚合酶之外，还额外添加鼠源r nase抑制剂，鼠源r nase抑制剂是抑制镁离子的产生，减小对转录rna产量的影响；添加无机焦磷酸镁，经转录反应后生成可溶的磷酸镁，减少转录反应沉淀的产生。
31.优选的，所述tris盐型的ntps包括如下终浓度的组分：tris盐的atp10mm；tris盐的gtp10mm；tris盐的ctp10mm；tris盐的n1-me-putp10mm。
32.通过采用上述技术方案，本技术的ntps采用tris盐的ntps，相比于钠离子的ntps而言，有助于提高转录的rna产量，还能减少dsrna生成量，从而提高反应质量。
33.一种试剂盒，包括上述的缓冲液或上述的转录反应体系以及可接受的助剂或载体。
34.本技术的转录反应体系可以产业化应用在试剂盒上，该试剂盒转录反应得到的rna产量高，rna完整性好。
35.综上所述，本技术至少具有以下技术效果：1)本技术的转录缓冲液中采用的镁离子盐型为醋酸镁，醋酸镁中的镁离子浓度较低，可减少转录副产物以及反应体系沉淀的生成，并且通过实验筛选出最佳浓度的醋酸镁，可大幅度地提升rna的产量；
2)本技术的转录缓冲液中醋酸镁的浓度在350～460mm时，rna产量以及完整性较高，进一步的，当醋酸镁的浓度在400～460mm时，rna产量更高，rna完整性更佳；3)本技术的转录缓冲液中，醋酸镁(mgac2)在较低镁离子浓度下对于保障体外共转录反应浓度、产量和反应产物完整性上更加有优势；4)本技术采用tris盐型帽类似物和ntps转录反应体系，有利于提高转录反应得到的rna产量以及提高rna的完整性；5)本技术涉及的试剂盒，包括含醋酸镁的转录缓冲液、tris盐型帽类似物和tris盐型的ntps以及可接受的助剂或载体，具有rna产量高、rna完整性高的优点。
附图说明
36.图1是铵盐型帽类似物和钠盐型ntps以及tris盐型帽类似物和ntps共转录产物中dsrna含量示意图。
具体实施方式
37.以下结合附图和实施例、对比例对本技术做进一步详细说明。本技术实施例、对比例涉及的所有原料成分均为市售购买可得。
38.目前，市场上多家公司t7 rna体外转录试剂盒中所用的转录缓冲液镁离子盐型为氯化镁，发明人将转录缓冲液中氯化镁更换为醋酸镁，并且通过筛选最佳浓度的醋酸镁，显著地提升了rna产量，降低后续rna合成的成本。
39.实施例1：一种可提高体外合成rna产量的转录缓冲液，包括如下终浓度的各组分：tris-hcl盐400mm、醋酸镁460mm、亚精胺20mm、二硫苏糖醇100mm。
40.实施例2：一种可提高体外合成rna产量的转录缓冲液，包括如下浓度的各组分：tris-hcl盐400mm、醋酸镁400mm、亚精胺20mm、二硫苏糖醇100mm。
41.实施例3：一种可提高体外合成rna产量的转录缓冲液，包括如下浓度的各组分：tris-hcl盐400mm、醋酸镁350mm、亚精胺20mm、二硫苏糖醇100mm。
42.实施例4：一种可提高体外合成rna产量的转录缓冲液，包括如下浓度的各组分：tris-hcl盐400mm、醋酸镁300mm、亚精胺20mm、二硫苏糖醇100mm。
43.对比例1：一种可提高体外合成rna产量的转录缓冲液，包括如下浓度的各组分：tris-hcl盐400mm、醋酸镁280mm、亚精胺20mm、二硫苏糖醇100mm。
44.对比例2：一种可提高体外合成rna产量的转录缓冲液，包括如下浓度的各组分：tris-hcl盐400mm、醋酸镁520mm、亚精胺20mm、二硫苏糖醇100mm。
45.对比例3：一种可提高体外合成rna产量的转录缓冲液，包括如下浓度的各组分：tris-hcl盐
400mm、氯化镁460mm、亚精胺20mm、二硫苏糖醇100mm。
46.对比例4：一种可提高体外合成rna产量的转录缓冲液，包括如下浓度的各组分：tris-hcl盐400mm、氯化镁400mm、亚精胺20mm、二硫苏糖醇100mm。
47.对比例5：一种可提高体外合成rna产量的转录缓冲液，包括如下浓度的各组分：tris-hcl盐400mm、氯化镁350mm、亚精胺20mm、二硫苏糖醇100mm。
48.对比例6：一种可提高体外合成rna产量的转录缓冲液，包括如下浓度的各组分：tris-hcl盐400mm、氯化镁300mm、亚精胺20mm、二硫苏糖醇100mm。
49.将实施例与对比例制得的转录缓冲液按照以下实验步骤进行体外转录反应：(1)dna模板的制备通长的模板为线性化质粒、pcr扩增产物或合成的dna片段。针对线性化质粒模板的制备，通长利用酶切或重组等方法将目的片段插入进质粒的多克隆位点，该质粒一般具有相应rna聚合酶的启动位点，如t7、sp6或t3，随后在大肠杆菌等“生物工厂”中进行扩增，对提取纯化的改造质粒利用限制性内切酶进行切割纯化后即可作为mrna体外转录的dna模板。针对pcr扩增产物的制备，通常以dna聚合酶、特异性引物及相关buffer为体系对目标dna片段进行，扩增产物通常包含相应rna聚合酶的启动位点，如t7、sp6或t3等，在本实施例中选用t7 rna聚合酶，扩增产物经过纯化后即可作为mrna体外转录的dna模板。
50.(2)体外转录体系表1的rna体外合成体系中，t7 rna polymerase mix中含有t7 rna聚合酶，无机焦磷酸酶(inorganic pyrophosphatase)以及鼠源rna酶抑制剂(murine rnase inhibitor)。按照表2进行反应体系依次加样，即最后加入线性化dna模板，以防10
×
transcription buffer中的亚精胺使dna 模板产生沉淀，混合均匀，短暂离心至管底，37℃孵育2.5个小时。dnasei处理，即每管加入2μl dnasei(rnase-free)，37℃孵育15分钟以去除模板dna。
51.表1 t7 rna polymerase mix(2μl)组分和体积组分体积t7rnapolymerase(50u/μl)1μl鼠源rnase抑制剂(murinernaseinhibitor，40u/μl)0.96μl无机焦磷酸酶(inorganicpyrophosphatase，1u/μl)0.04μl表2 tris盐型的帽类似物和ntps的rna体外合成体系
(3)产物纯化：体外转录后的rna可以选用rna cleaner磁珠进行纯化，以去除蛋白、游离的核苷酸等。
52.rna cleaner磁珠纯化法：提前将rna clean beads从4℃阴凉柜取出，平衡至室温(约30分钟)，并用rnase-free h2o将转录产物稀释至50μl。
53.①
颠倒或涡旋振荡使磁珠充分混匀，吸取6
×
磁珠(300μl)加入rna样品中(50μl)，用移液器吹打6次充分混匀。室温孵育5分钟，使rna结合到磁珠上。
54.②
将样品置于磁力架上5分钟，待溶液澄清后，小心移除上清。
55.③
保持样品置于磁力架上，加入200μl 80％乙醇(用rnase-free h2o配置，现配现用)漂洗磁珠，室温孵育30s，小心移除上清。重复此操作一次。
56.④
保持样品始终处于磁力架上，开盖空气干燥磁珠5分钟。
57.⑤
将样品从磁力架上取出，加入200μl rnase-free h2o，用移液器吹打6次以充分混匀，室温静置5分钟。
58.⑥
将样品置于磁力架5分钟，待溶液澄清后，小心转移上清200μl至一个新的rnase-free离心管中。
59.检测手段：(1)rna产量紫外吸收法对纯化后的rna进行浓度检测。通过测定产物的a260读数来确定rna的产量。具体地，使用赛默飞超微量紫外分光光度计nanodrop one，选择rna浓度测定的选项，先用1.5μl rnase-free h2o对该仪器进行三遍校准后，取1.5μl rna样品进行浓度测定，得到各组rna的浓度；根据各组的浓度，再乘以200μl体积，可计算得到各组rna的产量。
60.(2)rna完整度biopticqsep100bio-fragment analyzer检测法测定rna完整性。biopticqsep100bio-fragment analyzer可以用来评估rna完整度，它仅需要少量的rna进行分析。
61.具体步骤为：a.试剂准备：rna卡槽的w(wash)盘、c(clean)盘加入5mldepc水；p(park)位置加入4ml depc水，在s(separation)盘加入4ml 1
×
separation buffer；b.溶液配制：配制marker：在mc1位置放入30μl rnamarker原液；配制0.1
×
dilution buffer：将10
×
dilution buffer使用depc水稀释成0.1
×
备用。
62.c.样本处理：根据检测的mrna产物浓度，使用0.1
×
dilution buffer进行样本稀释，稀释浓度
为10ng/μl，体积约50μl；将稀释好的mrna产物放入pcr仪中70℃变性5分钟。
63.d.仪器设置：(3)dsrna检测酶法免疫印迹法用于dsrna的检测，具体步骤为：
①
将mrna待测样品(200ng)印迹到带正电的尼龙印迹膜上，干燥30分钟。
②
使用封闭缓冲液孵育膜1小时。
③
使用tbs-t缓冲液冲洗膜两次。
④
使用抗dsrna抗体室温孵育膜1小时。
⑤
使用tbs-t缓冲液冲洗膜4次，再洗涤6次，每次洗涤5分钟。
⑥
添加检测抗体溶液在室温下孵育膜1小时。
⑦
tbs-t缓冲液冲洗膜4次，再洗涤6次，每次洗涤5分钟。加ecl化学发光试剂，使用合适的成像系统捕捉信号，比对斑点颜色。
70.(4)共转录产物进行细胞转染
①
根据样品的浓度，核苷酸序列计算得到每个样品所需浓度。
71.②
细胞培养(六孔板)：在转染前一天(18-24小时)，按照每孔约20-70万细胞接种到六孔板内进行培养，使第二天细胞密度能达到约70-90％。
72.③
进行转染步骤前，把培养有细胞的六孔板每孔换成2ml新鲜培养液(含有血清，不含抗生素)。
73.④
对于待转染的六孔板中每一个孔的细胞，取两个洁净无菌rnase-free离心管，分别加入125μl不含抗生素和血清的opti-mem培养基，然后于其中一管加入100pmol rna，并用枪轻轻吹打混匀；另一管加入5μllipo6000
tm
转染试剂，用枪轻轻吹打混匀，室温静置5分钟后，将含有rna的培养液用枪轻轻加入含lipo6000
tm
转染试剂的培养液中，轻轻颠倒离心管或者用枪轻轻吹打混匀，室温静置5分钟。
74.⑤
按照六孔板每孔250μl lipo6000
tm
转染试剂-rna混合物的用量，均匀滴加到整个孔内，随后轻轻混匀。
75.⑥
为达到最高的转染效率，细胞在转染后培养4-6小时后宜更换为新鲜的完全培养液。
76.⑦
继续培养12-18小时后，可用荧光显微镜进行拍照。
77.(1)rna产量的检测结果如下所示：a)tris盐型帽类似物和tris盐型ntps中rna产量的检测结果如表3所示：表3
通过表3可知，将本技术记载的转录缓冲液应用在tris盐型的帽类似物和ntps的rna体外转录反应中，当醋酸镁的浓度为300～460mm时，转录得到的rna产量为170～220μg/1μg模板；根据对比例1和对比例2可知，当醋酸镁的浓度为280mm时，转录反应得到的rna下降明显，rna产量仅为80μg/1μg模板，当醋酸镁的浓度为520mm时，转录反应得到的rna产量大幅下降，表明mg
2+
浓度过高时，会导致转录副产物增多，进而影响转录反应rna的产量；因此，醋酸镁浓度在300～460mm范围内，rna产量较高，超出300～460mm范围，rna产量大幅减小，由此可见，醋酸镁浓度在300～460mm时，rna产量显著提高。
78.通过表3可知，本技术的转录缓冲液中，醋酸镁的浓度优选在350～460mm时，转录反应得到的rna为200～220μg/1μg模板；进一步优选的，醋酸镁浓度在400～460mm时，转录反应得到的rna为216～220μg/1μg模板；而由对比例3～6可知，氯化镁的浓度在400～460mm时，rna产量达到180～200μg/1μg模板，而当氯化镁的浓度为350mm时，rna产量为90μg/1μg模板，氯化镁的浓度为300mm时，rna产量为40μg/1μg模板，由此可见，采用含氯化镁的转录缓冲液，在低镁离子浓度条件下，rna产量下降明显且产量较低。
79.若转录反应体系置换为表4，按照表4次序依次加样，进行体外转录反应制得试剂盒，同样地，将体外反应后的rna纯化再进行rna浓度和产量的检测。
80.表4铵盐型帽类似物和钠盐型ntps的rna体外合成体系
b)铵盐型帽类似物和钠盐型ntps中rna产量的检测结果如表5所示：表5通过表5可知，在铵盐型帽类似物和钠盐型ntps体系中，选用的醋酸镁浓度为350～460mm时，转录反应得到的rna产量为184～200μg/1μg模板，醋酸镁浓度在350mm以下，rna产量下降明显；而选用的氯化镁浓度为400～460mm时，rna产量为180～200μg/1μg模板，氯化镁的浓度在400mm以下时，rna产量大幅度下降，比如氯化镁浓度为350mm时，rna产量仅为60μg/1μg模板，氯化镁浓度为300mm时，rna产量则为20μg/1μg模板；由此可见，相比于氯化镁而言，醋酸镁(mgac2)在较低镁离子浓度下对于保障体外共转录反应浓度和产量上更加有优势。
81.通过表3和表5可知，对照相同浓度醋酸镁来看，tris盐型帽类似物和ntps体系中得到的rna产量大于铵盐型帽类似物和钠盐型ntps体系中得到的rna产量，且在低镁离子浓度下，tris盐型帽类似物和ntps体系更有利于进行rna转录。
82.(2)rna完整性a)tris盐型帽类似物和tris盐型ntps中rna完整性的检测结果如表6所示：表6
样品mgcl2/mgac2浓度(mm)rna完整性(％)实施例1mgac246096.5实施例2mgac240096实施例3mgac235095实施例4mgac230093.5对比例3mgcl246095对比例4mgcl240094对比例5mgcl235093对比例6mgcl230092b)铵盐型帽类似物和钠盐型ntps中rna完整性的检测结果如表7所示：表7样品mgcl2/mgac2浓度(mm)rna完整性(％)实施例1mgac246095实施例2mgac240094实施例3mgac235093.5实施例4mgac230093对比例3mgcl246094.8对比例4mgcl240093对比例5mgcl235093对比例6mgcl230091由表6和表7可知，不管是在铵盐型帽类似物和钠盐型ntps，还是tris盐型帽类似物和tris盐型ntps条件下，相比于氯化镁(mgcl2)而言，醋酸镁(mgac2)在较低镁离子浓度下对于保障体外共转录反应产物完整性上更加有优势。具体地，在tris盐型帽类似物和tris盐型ntps条件下，醋酸镁浓度为460mm时，转录后rna完整性可达96.5％，且醋酸镁浓度为350～460mm时，rna完整性保持在95％以上，当醋酸镁浓度为300mm时，rna完整性为93％；而在铵盐型帽类似物和钠盐型ntps条件中，醋酸镁浓度为460mm时，rna完整性最高达95％，醋酸镁浓度为300mm时，rna完整性仅为93％；当氯化镁浓度为300mm时，rna完整性低至91％。
83.(3)副产物dsrna的产生情况参见图1，竖线左侧为tris盐型帽类似物和tris盐型ntps条件下dsrna含量的示意区，竖线右侧为铵盐型帽类似物和钠盐型ntps条件下dsrna含量的示意区，由酶法免疫印迹的数据可知，tris盐型帽类似物和tris盐型ntps条件下的副产物dsrna含量很少，而铵盐型帽类似物和钠盐型ntps条件下的副产物dsrna含量显著增加，460mm醋酸镁的10
×
transcription buffer条件下，相比于铵盐型帽类似物和钠盐型ntps，tris盐型的帽类似物和ntps可减少副产物dsrna的产生。
84.(4)共转录产物的翻译效果表8铵盐型帽类似物和钠盐型ntps条件下，各组细胞荧光相对强度组别细胞荧光相对强度(相对于460mmmgcl2)460mmmgcl21400mmmgcl20.9
350mmmgcl20.3300mmmgcl20.1460mmmgac21400mmmgac21350mmmgac21300mmmgac20.4表9tris盐型帽类似物和tris盐型ntps条件下，各组细胞荧光相对强度组别细胞荧光相对强度(相对于460mmmgcl2)460mmmgcl21400mmmgcl21350mmmgcl20.4300mmmgcl20.2460mmmgac21400mmmgac21350mmmgac20.9300mmmgac20.4将共转录得到的gfp rna转染进入细胞24h后，通过观察细胞内gfp的荧光情况，由表8和表9的数据可知，不论是采用氯化镁还是醋酸镁，浓度在400～460mm之间，不管是tris盐型帽类似物和tris盐型ntps条件还是铵盐型帽类似物和钠盐型ntps条件，细胞荧光的相对强度均较高，基本在0.9以上；在较低镁离子浓度下，醋酸镁(mgac2)体系的体外共转录反应产物rna在细胞内的荧光更强，即翻译效果优于氯化镁(mgcl2)；另外，tris盐型帽类似物和tris盐型ntps条件比铵盐型帽类似物和钠盐型ntps条件体外转录的翻译效果更好。

技术特征：
1.一种可提高体外合成rna产量的转录缓冲液，其特征在于包括如下终浓度的各组分：tris-hcl盐 300~500mm；醋酸镁 300~460mm；亚精胺 10~30mm；二硫苏糖醇 50~200mm。2.根据权利要求1所述的一种可提高体外合成rna产量的转录缓冲液，其特征在于包括如下终浓度的各组分：tris-hcl盐 350~450mm；醋酸镁 300~460mm；亚精胺 15~25mm；二硫苏糖醇 80~150mm。3.根据权利要求1所述的一种可提高体外合成rna产量的转录缓冲液，其特征在于包括如下终浓度的各组分：tris-hcl盐 350~450mm；醋酸镁400~460mm；亚精胺 15~25mm；二硫苏糖醇 80~150mm。4.根据权利要求1所述的一种可提高体外合成rna产量的转录缓冲液，其特征在于包括如下终浓度的各组分：tris-hcl盐 350~450mm；醋酸镁300~350mm；亚精胺15~25mm；二硫苏糖醇80~150mm。5.根据权利要求1所述的一种可提高体外合成rna产量的转录缓冲液，其特征在于：当醋酸镁浓度为300~350mm时，和同等浓度的氯化镁相比，rna产量可提升120%~325%。6.根据权利要求1所述的一种可提高体外合成rna产量的转录缓冲液，其特征在于：当醋酸镁浓度为300~350mm时，和同等浓度的氯化镁相比，rna完整性提升0.5~2%。7.一种转录反应体系，其特征在于：包括权利要求1~4任意一项的转录缓冲液、t7 rna polymerase mix以及tris盐型的帽类似物和tris盐型的ntps。8.根据权利要求7所述的一种转录反应体系，其特征在于：所述t7 rna polymerase mix包括t7 rna polymerase、鼠源r nase抑制剂和无机焦磷酸镁。9.根据权利要求7所述的一种转录反应体系，其特征在于，所述tris盐型的ntps包括如下终浓度的组分：tris盐的atp10mm；tris盐的gtp10mm；tris盐的ctp10mm；tris盐的n1-me-putp10mm。10.一种试剂盒，其特征在于：包括权利要求1~6任意一项所述的缓冲液或如权利要求7~9任意一项所述的转录反应体系以及可接受的助剂或载体。

技术总结
本发明公开了一种可提高体外合成RNA产量的转录缓冲液，包括如下终浓度的各组分：Tris-HCl盐300~500mM；醋酸镁300~460mM；亚精胺10~30mM；二硫苏糖醇50~200mM；本申请涉及的转录缓冲液中采用的镁离子盐型为醋酸镁，醋酸镁中的镁离子浓度较低，可减少转录副产物以及反应体系沉淀的生成，并且通过实验筛选出最佳浓度的醋酸镁，可大幅度地提升RNA的产量。可大幅度地提升RNA的产量。


技术研发人员：肖潇 尹丹丹 华成品 鲁笑笑
受保护的技术使用者：江苏申基生物科技有限公司
技术研发日：2023.07.01
技术公布日：2023/7/31