一种基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法和应用与流程

1.本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法和应用。


背景技术：

2.基于成像的蛋白质定位法是目前对蛋白质在亚细胞尺度上进行定位和定量分析的技术之一，在探究蛋白质组的复杂结构与功能方面具有重要作用。具有可编程性的dna免疫标记技术已被成功应用于单细胞蛋白成像分析，通过对靶标蛋白的抗体dna标记以及随后的荧光信号输出，经过反复“成像-置换”循环，可对单个细胞的多种蛋白进行多轮成像分析，但由于操作繁琐，以及反复成像造成的细胞变形、信号失真等问题仍有待解决。
3.杂交链式反应(hcr)由r.m.dirks和n.a.pierce等人于2004年首次提出，是一种基于dna链取代反应的等温信号放大技术。在hcr体系中，靶分子引发两种dna茎环交替开环，自组装得到包含大量重复单元的线性双链dna纳米结构，具有恒温、免酶、放大效率高等优点，被广泛应用于生物传感、生物成像和生物医药领域。


技术实现要素：

4.本发明的目的之一在于提供一种构建基于hcr反应的荧光条形编码免疫标记信号放大方法(isafe-hcr)，利用点击化学原理合成引发链dna交联的抗体，形成抗体引物复合体(adc)，进一步利用adc触发hcr反应，其输出信号作为报告标签。
5.本发明的目的之二在于提供上述isafe-hcr方法在细胞中多蛋白靶标同时成像中的应用。
6.本发明的目的之三在于提供一种基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法，采用上述isafe-hcr方法构建细胞各蛋白对应的adc复合物，通过抗体端识别靶标以及dna端触发hcr报告信号，在细胞中对多种蛋白同时孵育标记并进行荧光成像，勾勒细胞整体形态。
7.本发明的目的之四在于提供上述基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法在体外肿瘤细胞中多蛋白成像检测和分析中的应用，采用上述基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法，利用人工+计算机图像智能识别结合的细胞多色区分技术对多蛋白成像的荧光结果进行区分及定量，绘制各自对应蛋白的多色彩复合图像进行分析，针对每一种靶标确定其对应的信号标签，根据成像信号达到精准识别分析的目的。
8.为实现上述目的之一，本发明采用的技术方案是：
9.本发明提供一种构建基于hcr反应的荧光条形编码免疫标记信号放大方法，包括：利用点击化学反应原理将dbco修饰的引发链dna(t链)与叠氮修饰的抗体进行交联，合成抗体引物复合体(adc)，t链特异性触发hcr反应，输出的荧光信号作为报告标签对靶标进行标记；即利用点击化学原理合成引发链dna交联的抗体，一种抗体对应一种引发链dna，一种引
发链dna可以引发一组hcr反应进行信号放大并输出结果，理论上n种靶标可用n种抗体标记，并对应n种信号输出结果。
10.优选地，以一组hcr反应元件为例，所述hcr反应元件为四个具有茎环结构的发夹dna链h1、h2、h3和h4，其序列分别如下表所示，3’端修饰荧光基团分别是pacific blue、fam、tamra和cy5，激发波长分别为405nm、488nm、560nm和633nm，分别用蓝、绿、黄和红色进行伪彩标记；
[0011][0012]
通过颜色、组合或比例的不同组合方式产生的不同情况作为各靶标的报告标签，对不同靶标输出信号差异的区分。
[0013]
为实现上述目的之二，本发明采用的技术方案是：
[0014]
本发明提供上述isafe-hcr方法在细胞中多蛋白靶标同时成像中的应用。
[0015]
为实现上述目的之三，本发明采用的技术方案是：
[0016]
本发明提供一种基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法，采用上述isafe-hcr方法构建细胞各蛋白对应的adc复合物，通过抗体端识别靶标以及dna端触发hcr报告信号，在细胞中对多种蛋白同时孵育标记并进行荧光成像，勾勒细胞整体形态。
[0017]
优选地，以6种蛋白同时孵育成像为例，6组引发链和荧光报告元件序列分别如下表所示：
[0018]
表2：6组引发链和荧光报告元件序列
[0019]
[0020][0021]
包括以下步骤：
[0022]
步骤a：设计6组针对hela细胞中6种蛋白靶标的信号报告标签的特异性序列，并在不同的发夹上修饰荧光基团，序列如表2所示；
[0023]
步骤b：将dbco修饰的t链，即6组t链与叠氮修饰的6组靶标抗体在pbs缓冲液中反应，由于点击化学原理抗体交联dna，得到用于引发6组hcr反应的adc复合物；
[0024]
步骤c：步骤b所得的交联抗体在固定的hela细胞中同时孵育，并利用步骤a所得6组h1、h2、h3和h4链在固定的hela细胞中同时进行hcr反应；
[0025]
步骤d：步骤c所得的孵育完成的hela细胞通过共聚焦拍摄，获取同一hela细胞中多蛋白的多色成像图。
[0026]
优选地，步骤b的具体步骤为：在总体积为100μl的pbs缓冲液中，将靶标对应的抗体与nhs-peg4-n3交联剂按30μm:1.5mm的摩尔比在室温下1000rpm磁力搅拌2h，超滤离心纯化得到叠氮修饰的抗体；叠氮功能化的抗体与dbco修饰的t链以10μm:100μm的摩尔比在4℃
下孵育1天，同时1000rpm磁力搅拌，多余的t链通过超滤离心去除，t链交联的抗体用1
×
pbs进行重悬，获得t链标记抗体；6组t链依次对应6种抗体，用相同方式制备得到6种用于免疫标记的dna修饰adc复合物。
[0027]
优选地，步骤c的具体步骤为：将1
×
104hela细胞培养于共聚焦小皿中，置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养24h；第二天弃培养液，预冷的pbs洗三次，4％多聚甲醛室温固定15min，pbs洗五次；皿中加入500μl 0.5％ tritonx-100，37℃20min，pbs洗3次；随后皿中加入500μl 5％ bsa，室温30min，pbs洗3次；步骤b所得的6组adc同时进行孵育，4℃过夜，pbs洗3次；随后同时加入6组终浓度为500nm的h1、h2、h3和h4链，37℃反应1.5h，反应结束后pbs洗3次。
[0028]
为实现上述目的之四，本发明采用的技术方案是：
[0029]
本发明提供上述基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法在体外肿瘤细胞中多蛋白成像检测和分析中的应用，采用上述基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法对肿瘤细胞进行荧光成像，结合“人工+计算机辅助”两步法，先针对各蛋白靶标对应细胞位置人工粗略区分，再利用计算机图像智能识别软件对各蛋白进行计算机辅助多激发通道的色彩提取。
[0030]
优选地，所述肿瘤细胞包括但不限于hela细胞、a549细胞和hepg2细胞。
[0031]
优选地，以肿瘤细胞为hela细胞为例，采用上述基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法对肿瘤细胞进行荧光成像，在四种激发光通路下完成对6种蛋白靶标的同时成像分析，具体步骤为：
[0032]
步骤1：根据各蛋白在细胞内的确定位置人工选取框定，得到各蛋白多色的粗略图；
[0033]
步骤2：利用计算机图像智能识别软件在各蛋白中选定一处感兴趣区域(roi)，对原始图像(image_roi)进行针对四激发通道的色彩提取，并复制一份图像(image_fill)用于后续转成rgb格式进行上色；
[0034]
步骤3：针对image_roi图像，在各通道下设定为不同灰度图像，计算对应灰度值，作为各蛋白该通道下的平均荧光值，添加到roi manager中，进行定量分析；
[0035]
步骤4：根据四种伪彩颜色代码，进行十六进制-rgb转换，即红(#ec141f；236,20,31)、绿(#1fcc16；31,204,22)、蓝(#0e6cfa；14,108,250)、黄(#fad60e；250,214,14)，在image_fill中将roi manager中的区域进行上色；
[0036]
步骤5：通过process-》image calculator，将原图与标注图片相叠加。
[0037]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：以引发链dna交联的抗体对细胞进行免疫标记，通过四发夹介导的hcr信号输出作为报告标签，构建一种isafe-hcr方法，实现靶标-抗体-输出信号一一对应的检测分析，在对靶标信号进行放大的同时，还能够增加细胞蛋白同时成像的数量，达到高通量分析的目的。排除荧光串扰的影响后，可以得到四荧光不同组合、不同比例情况下的信号输出，实现细胞内多蛋白同时成像的目的，解决反复成像造成的操作繁琐、细胞变性等问题，同时结合人工与图像智能识别，实现各蛋白的区分及定量分析，与多轮反复“成像-置换”循环成像相比，在同时空可以对多靶标进行成像分析，勾勒出细胞全态，有助于实现多维、高效、精准的成像，在多靶标、多组学分析等领域具有重要应用价值。
附图说明
[0038]
图1为实施例中利用isafe-hcr方法进行细胞蛋白成像的示意图；通过构建adc复合物一方面特异识别靶标，一方面触发hcr自组装反应，达到信号放大的目的。
[0039]
图2为实施例中四种不同激发光发射的荧光基团组合下的复色示意图(分别选取单编码至四编码中的9种组合)。
[0040]
图3为实施例中以actin为例触发9种不同编码情况下的实际蛋白成像结果图。
[0041]
图4为实施例中以actin为例对t1-t6组触发对应hcr信号的正交性分析结果图。
[0042]
图5为实施例中hela细胞6蛋白同时成像结果图。
[0043]
图6为实施例中细胞多色区分技术的流程分析图。
[0044]
图7为实施例中利用细胞多色区分技术对hela细胞6蛋白同时成像的实际解析图。
具体实施方式
[0045]
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0046]
实施例1
[0047]
四荧光组合的dna多编码hcr信号在细胞内actin蛋白中的共聚焦表征图像
[0048]
将dbco修饰的t链(trigger dna-dbco)与叠氮修饰的actin抗体在pbs缓冲液中反应，由于点击化学原理，抗体可以交联dna，从而得到用于引发hcr反应的actin-t复合物(图1)，具体操作如下：
[0049]
准备一个200μl的ep管，在总体积为100μl的pbs缓冲液中，将actin抗体与nhs-peg4-n3交联剂按30μm:1.5mm的摩尔比进行混合。随后在室温下磁力搅拌2h(1000rpm)，通过10kd的超滤离心柱纯化得到叠氮修饰的actin抗体。随后与dbco修饰的t链以10μm:100μm的摩尔比在4℃下孵育1天，同时进行磁力搅拌(1000rpm)，多余的t链通过超滤离心去除，将t链交联的抗体用1
×
pbs进行重悬，由此获得t链标记抗体(actin-t复合物)。准备9个共聚焦小皿，将1
×
104hela细胞培养其中，第二天弃培养液，并经过固定、打孔、封闭步骤后，加入上述actin-t复合物，4℃孵育过夜，隔天回收抗体。经过pbs清洗3次，分别加入h1、h2、h3、h4各4μl，不同组别h1、h2、h3、h4分别修饰不同的荧光分子：
[0050]
第一组：h1、h2、h3、h4分别修饰fam，0，0，0；
[0051]
第二组：h1、h2、h3、h4分别修饰cy5，0，0，0；
[0052]
第三组：h1、h2、h3、h4分别修饰tamra，0，0，0；
[0053]
第四组：h1、h2、h3、h4分别修饰pacific blue，0，0，0；
[0054]
第五组：h1、h2、h3、h4分别修饰fam，cy5，0，0；
[0055]
第六组：h1、h2、h3、h4分别修饰tamra，pacific blue，0，0；
[0056]
第七组：h1、h2、h3、h4分别修饰fam，tamra，0，0；
[0057]
第八组：h1、h2、h3、h4分别修饰cy5，tarma，pacific blue，0；
[0058]
第九组：h1、h2、h3、h4分别修饰fam，cy5，tarma，pacific blue(图2)。
[0059]
用1
×
pbs补足至200μl，混匀后置入小皿中于37℃反应1.5h。反应结束后清洗3次，置于100倍油镜下拍摄共聚焦图像。4个不同的荧光激发通道分别为fam-488，cy5-633，tamra-560，pacific blue-405，所有图像的同一荧光拍摄设置参数相同，结果如图3所示。
[0060]
从图3可知，利用actin-t进行多色编码成像，可以实现单编码至四编码的不同颜色组合情况，对其进行简单的通道分析可得第一组只有fam的绿色伪彩；第二组只有cy5的红色伪彩；第三组只有tamra的黄色伪彩；第四组只有pacific blue的蓝色伪彩；第五组有fam、cy5的绿色、红色伪彩；第六组有tamra、pacific blue的黄色、蓝色伪彩；第七组有fam、tamra的绿色、黄色伪彩；第八组有cy5、tarma、pacific blue的红色、黄色、蓝色伪彩；第九组有fam、cy5、tarma、pacific blue的绿色、红色、黄色、蓝色伪彩。说明单一靶标下上述几种荧光条形编码组合可进行有效成像，且各组合下的复色差异大，易区分，有利于后续多蛋白成像的同时分析。
[0061]
实施例2
[0062]
本发明中isafe-hcr方法对hela细胞6蛋白同时成像分析的应用
[0063]
将dbco修饰的t链(trigger dna-dbco)与叠氮修饰的抗体在pbs缓冲液中反应，由于点击化学原理，抗体可以交联dna，从而得到用于引发hcr反应的adc复合物。具体操作如下：
[0064]
准备六个200μl的ep管，分别标记1、2、3、4、5、6。将6种蛋白抗体(actin、ezrin、lamina、gm130、fblr、histone h3)与nhs-peg4-n3交联剂按30μm:1.5mm的摩尔比进行混合。随后在室温下磁力搅拌2h(1000rpm)，分别通过超滤离心柱纯化得到叠氮修饰的抗体。
[0065]
随后与dbco修饰的t1-t6链以10μm:100μm的摩尔比在4℃下孵育1天，同时进行磁力搅拌(1000rpm)，多余的t链通过超滤离心去除，将t链交联的抗体用1
×
pbs进行重悬，由此获得t链标记抗体(adc复合物)。在该过程中，分别合成actin-t1至actin-t6复合物用于后续正交性验证，以及ezrin-t2、lamina-t3、gm130-t4、fblr-t5、histone h3-t6。准备多个共聚焦小皿，将1
×
104hela细胞培养其中，第二天弃培养液，并经过固定、打孔、封闭步骤后，在正交性验证中，分别加入actin-t1至actin-t6复合物，4℃孵育过夜，隔天回收抗体。经过pbs清洗3次，分别加入6组对应的h1、h2、h3和h4链各4μl(终浓度为500nm，仅用一种荧光修饰)。在多色成像中，同时加入actin-t1、ezrin-t2、lamina-t3、gm130-t4、fblr-t5、histone h3-t6 6组复合物，4℃孵育过夜，隔天回收抗体。经过pbs清洗3次，同时加入6组对应的h1、h2、h3和h4链各4μl(终浓度为500nm)。37℃反应1.5h，反应结束后pbs洗3次。置于100倍油镜下拍摄共聚焦图像。随后，结合“人工+计算机辅助”两步法，首先针对各蛋白靶标对应细胞位置做粗略区分(人工)，随后利用计算机图像智能识别软件image j对各蛋白进行四激发通道的色彩提取(计算机辅助)，针对每一种靶标，确定其对应的信号标签，根据成像信号达到精准识别分析的目的，结果如图4、图5、图7。
[0066]
由图4可知，q1-q6组之间的hcr反应具备特异性。在对应t链存在下，才触发反应呈现荧光，而非对应组别无法观察到荧光，说明在后续同时成像应用中有助于多蛋白的成像反应。随后将6组蛋白同时成像，如图5所示，成功勾勒出带多种颜色标识的细胞全态，从在外层的胞膜，到最内层的核仁，依次有对应的颜色进行表征和区分，且差异明显，利于分析。最后，根据细胞多色区分技术(图6)，可以从多色复合图像中提取出对应的6种蛋白，并进一步分析其中roi的具体荧光情况，即细胞膜ezrin仅有tamra通道的荧光；细胞骨架actin仅有cy5通道的荧光；lamina仅有pacific blue通道的荧光；高尔基体gm130有fam、tamra两通道的荧光；核仁fblr有fam、cy5两通道的荧光；细胞核histone h3有cy5、tamra、pacific blue通道的荧光，且各荧光比例相一致，符合理论设想(图7)，说明利用本发明中基于荧光
条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法可成功实现细胞内多蛋白的同时孵育成像分析，简便明了，避免过去反复“成像-清洗”循环的冗杂步骤。

技术特征：
1.一种基于hcr反应的荧光条形编码免疫标记信号放大方法，其特征在于，其构建方法包括：dbco修饰的引发链dna(t链)与叠氮修饰的抗体进行交联，合成抗体引物复合体，t链特异性触发hcr反应，输出的荧光信号作为报告标签对靶标进行标记，得到基于hcr反应的荧光条形编码免疫标记信号放大方法。2.根据权利要求1所述基于hcr反应的荧光条形编码免疫标记信号放大方法，其特征在于，hcr反应元件为四个具有茎环结构的发夹dna链h1、h2、h3和h4，其序列分别如seq id no:1-4所示，3’端修饰荧光基团分别是pacific blue、fam、tamra和cy5，激发波长分别为405nm、488nm、560nm和633nm，分别用蓝、绿、黄和红色进行伪彩标记，t链序列如seq id no:5所示，通过颜色或比例的不同组合方式产生的不同情况作为各靶标的报告标签，对不同靶标输出信号差异化区分。3.权利要求1或2所述基于hcr反应的荧光条形编码免疫标记信号放大方法在细胞中多蛋白靶标同时成像中的应用。4.一种基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法，其特征在于，采用权利要求1或2所述基于hcr反应的荧光条形编码免疫标记信号放大方法构建细胞各蛋白对应的抗体引物复合体，通过抗体端识别靶标以及dna端触发hcr报告信号，在细胞中对多种蛋白同时孵育标记并进行荧光成像，勾勒细胞整体形态。5.根据权利要求4所述基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法，其特征在于，所述细胞为hela细胞，采用6种蛋白同时孵育成像，包括以下步骤：步骤a：设计6组针对hela细胞中6种蛋白靶标的信号报告标签的特异性序列，并在不同的发夹上修饰荧光基团，其中6组引发链和荧光报告元件序列分别如下：q1组：t链序列如seq id no:5所示，四个具有茎环结构的发夹dna链h1、h2、h3和h4序列分别如seq id no:7-10所示；q2组：t链序列如seq id no:11所示，四个具有茎环结构的发夹dna链h1、h2、h3和h4序列分别如seq id no:12-15所示；q3组：t链序列如seq id no:16所示，四个具有茎环结构的发夹dna链h1、h2、h3和h4序列分别如seq id no:17-20所示；q4组：t链序列如seq id no:21所示，四个具有茎环结构的发夹dna链h1、h2、h3和h4序列分别如seq id no:22-25所示；q5组：t链序列如seq id no:26所示，四个具有茎环结构的发夹dna链h1、h2、h3和h4序列分别如seq id no:27-30所示；q6组：t链序列如seq id no:31所示，四个具有茎环结构的发夹dna链h1、h2、h3和h4序列分别如seq id no:32-35所示；步骤b：将6组t链与叠氮修饰的6组靶标抗体在pbs缓冲液中反应，抗体交联dna，得到用于引发6组hcr反应的抗体引物复合体；步骤c：步骤b所得的交联抗体在固定的hela细胞中同时孵育，并用步骤a所得6组h1、h2、h3和h4链在固定的hela细胞中同时进行hcr反应；步骤d：步骤c所得的孵育完成的hela细胞通过共聚焦拍摄，获取同一hela细胞中多蛋白的多色成像图。6.根据权利要求5所述基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法，其特征在
于，步骤b的步骤为：在总体积为100μl的pbs缓冲液中，将靶标对应的抗体与nhs-peg4-n3交联剂按30μm:1.5mm的摩尔比在室温下1000rpm磁力搅拌2h，超滤离心纯化得到叠氮修饰的抗体；叠氮功能化的抗体与dbco修饰的t链以10μm:100μm的摩尔比在4℃下孵育1天，同时1000rpm磁力搅拌，多余的t链通过超滤离心去除，t链交联的抗体用1
×
pbs进行重悬，获得t链标记抗体；6组t链依次对应6种抗体，用相同方式制备得到6种用于免疫标记的dna修饰抗体引物复合体。7.根据权利要求5所述基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法，其特征在于，步骤c的步骤为：将1
×
104hela细胞培养于共聚焦小皿中，置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养24h；第二天弃培养液，预冷的pbs洗三次，4％多聚甲醛室温固定15min，pbs洗五次；皿中加入500μl 0.5％tritonx-100，37℃20min，pbs洗3次；随后皿中加入500μl 5％bsa，室温30min，pbs洗3次；步骤b所得的6组抗体引物复合体同时进行孵育，4℃过夜，pbs洗3次；随后同时加入6组终浓度为500nm的h1、h2、h3和h4链，37℃反应1.5h，反应结束后pbs洗3次。8.权利要求4-7任一项所述基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法在体外肿瘤细胞中多蛋白成像检测和分析中的应用，采用所述基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法对肿瘤细胞进行荧光成像，结合人工+计算机辅助两步法，先针对各蛋白靶标对应细胞位置人工粗略区分，再用计算机图像智能识别软件对各蛋白进行计算机辅助多激发通道的色彩提取。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞包括但不限于hela细胞、a549细胞和hepg2细胞。10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞为hela细胞，采用所述基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法对hela细胞进行荧光成像，在四种激发光通路下完成对6种蛋白靶标的同时成像分析，步骤为：步骤1：根据各蛋白在细胞内的确定位置人工选取框定，得到各蛋白多色的粗略图；步骤2：用计算机图像智能识别软件在各蛋白中选定一处roi区域，对image_roi图像进行针对四激发通道的色彩提取，并复制一份image_fill图像用于后续转成rgb格式进行上色；步骤3：针对image_roi图像，在各通道下设定为不同灰度图像，计算对应灰度值，作为各蛋白该通道下的平均荧光值，添加到roi manager中进行定量分析；步骤4：根据四种伪彩颜色代码进行十六进制-rgb转换，在image_fill图像中将roi manager中的区域进行上色；步骤5：通过process->image calculator，将原图与标注图片相叠加。

技术总结
本发明公开了一种基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法和应用，采用基于HCR反应的荧光条形编码免疫标记信号放大方法构建细胞各蛋白对应的ADC复合物，通过抗体端识别靶标以及DNA端触发HCR报告信号，在细胞中对多种蛋白同时孵育标记并荧光成像，利用人工+计算机图像智能识别结合的细胞多色区分对多蛋白荧光成像进行区分及定量，用于体外肿瘤细胞中多蛋白成像检测和分析。本发明基于不同组合下荧光报告信号实现细胞多种蛋白同时成像，解决反复成像造成的操作繁琐、细胞变性等问题，同时结合人工与图像智能识别实现各蛋白的区分及定量分析，在多靶标、多组学分析领域具有重要应用价值。有重要应用价值。有重要应用价值。


技术研发人员：朱小立 孙奋勇 潘秋辉 唐晓晨 毛东升 李文星
受保护的技术使用者：上海市第十人民医院
技术研发日：2023.03.01
技术公布日：2023/7/31