一种血小板膜修饰负载铂纳米颗粒的铁钨氧三元化物纳米平台的制备方法及其产品与应用

1.本发明属于纳米材料技术和生物医药领域，特别涉及一种血小板膜修饰负载铂纳米颗粒的铁钨氧三元化物纳米平台的制备方法及其产品与应用。


背景技术：

2.乳腺癌已成为全球最常见的癌症，占全球年度新增癌症病例的12.5％。2020年全球新发乳腺癌有230万例，其中68.5万例死亡，乳腺癌的高死亡率与其高侵袭性相关，约30％的患者在整个治疗过程中会发生转移。肺转移是乳腺癌第二常见的转移部位，发生肺转移后预后很差，其5年生存率约为16.8％。随着治疗手段的发展，目前乳腺癌的治疗以外科手术为主，配合辅助和新辅助疗法，但由于肿瘤细胞残留在循环系统中难以根除，使得其仍有术后复发、转移的可能，且发生肺转移死亡率高的原因和目前的治疗选择有限相关。因此，迫切需要新的治疗方式对抗乳腺癌循环肿瘤细胞，减少乳腺癌肺转移，以降低乳腺癌死亡率。
3.乳腺癌的肺转移是一个复杂的、多步骤的过程，与细胞的局部浸润、血液和淋巴扩散以及远处定植密切相关。乳腺肿瘤细胞能够分泌多种物质降解细胞外基质，使其脱离原始位置，进入循环系统，转移至远处的器官。此时血液高凝状态中活化的血小板和vwf多聚体可促进肿瘤细胞的迁徙和转移。肿瘤的特殊代谢特征使得肿瘤微环境(tme)呈现缺氧状态，这种缺氧状态导致的dna甲基化、warburg效应等进一步促进肿瘤的发生与发展。且在侵袭的过程中肿瘤细胞或基质细胞释放的各种蛋白酶如属蛋白酶-9(mmp-9)、组织蛋白酶家族(cts)将基底膜和结缔组织降解，打破阻碍肿瘤细胞迁徙的屏障。而且乳腺癌细胞高表达cxcr4能使其迁移到cxcl12表达丰富的靶组织，如肺、肝、骨等，从而参与乳腺癌的转移。除此之外，研究表明，由于乳腺癌转移前肺部微环境的改变，使得肺转移前龛呈现cxcr4高表达的状态。近年来，许多研究对蛋白酶的机制进行了探讨并证实蛋白酶可以作为抑制乳腺癌转移、改善乳腺癌预后的潜在靶点。达沙替尼(dasatinib,das)是fda批准的一类酪氨酸酶(scr)抑制剂，近年来的研究表明das可抑制蛋白酶的表达从而抑制乳腺癌的转移，然而其疏水性使其生物利用度受限，通常被用于口服，且易受膳食影响、个体差异大。
4.近年来纳米材料的开发与应用通过改善了药物的生物利用度、降低药物的毒副作用从而增加了许多药物的适用范围，为疾病的治疗提供了更多可能，但由于其异质性使其容易被机体免疫系统识别而清除。
5.光热疗法(photothermaltherapy，ptt)是利用细胞摄取的光热转换材料在光吸收时产生热量，温度升高，导致癌细胞热损伤及细胞死亡。为了避免对健康细胞的非特异性温度升高，材料必须在近红外(near-infrared，nir)光处具有强吸收。与用于治疗癌症的常规治疗方法(化疗、放疗及手术等)相比，由于大多数生物系统在700～1100nm范围内nir区域缺乏吸收，使用nir光来诱导局部温度升高特别具有吸引力。
6.光动力疗法(photdynamictherapy,pdt)是一种通过产生活性氧(ros)诱导细胞凋
亡和坏死的细胞毒性治疗方法。材料在接受特定波长的光能后通过光化学反应和能量传递将光能转化为分子内能，在有氧条件下产生多种活性氧，包括单线态氧、氧自由基、羟自由基等，从而对蛋白质、核酸等细胞成分产生破坏作用，是抗肿瘤治疗的一种有前景的策略。


技术实现要素：

7.鉴于目前存在的上述问题，本发明提供一种血小板膜修饰负载铂纳米颗粒的铁钨氧三元化物纳米平台的制备方法及其产品与应用。本发明的纳米平台，通过血小板膜囊泡的包埋从而避免被机体免疫系统识别而清除，生物安全性好，无毒副作用。本发明的纳米平台通过表面靶向分子的修饰，结合光热作用、光动力作用及药物化疗，能够发挥抗原位乳腺癌及预防乳腺癌肺转移的作用，同时其优异的ct、mri成像特性能够用于监控体内肿瘤及药物情况。
8.为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
9.本发明提供的这种血小板膜修饰负载铂纳米颗粒的铁钨氧三元化物纳米平台的制备方法，包括如下步骤：
10.1)通过有机相热分解法制得铁钨氧三元化物(fewox)；
11.2)制得铂纳米颗粒(ptnps)；
12.3)将步骤1)制得的fewox与步骤2)制得的ptnps混合，制得负载铂纳米颗粒的铁钨氧三元化物(fp)，再将fp与药物das混合，制得负载铂纳米颗粒和达沙替尼药物的铁钨氧三元化物(fpd)；
13.4)收集抗凝新鲜全血，经离心、洗涤分离出血小板，血小板经反复冻融提取出血小板膜并制成纳米级血小板膜囊泡(pltm)；
14.5)将e5肽和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-氨基化聚乙二醇(dspe-peg2000-nh2)混合，制得二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺修饰的e5肽(dspe-e5)，将dspe-e5与步骤4)制得的pltm混合，制得e5肽修饰的血小板膜囊泡(e-pltm)；
15.6)将步骤5)制得的e-pltm与步骤3)制得的fpd混合，制得血小板膜修饰负载铂纳米颗粒的铁钨氧三元化物纳米平台e-pltm@fpd。
16.所述步骤1)具体为：将二水合钨酸钠、七水合硫酸亚铁与十二烷基苯磺酸钠(sdbs)按摩尔比(0.8～1.2):(0.8～1.2):(1.8～2.2)混合，调节ph至10后，于170～190℃下反应8～16h，离心洗涤，得到fewox。
17.所述步骤2)具体为：将聚乙烯吡咯烷酮(pvp)溶于六水合氯铂酸溶液中，形成a溶液，其中，聚乙烯吡咯烷酮与六水合氯铂酸的质量比为(62～66)：
18.(18～22)；将硼氢化钠溶于冰水中制成浓度为0.5～0.7mg/ml的b溶液；将b溶液滴加入a溶液中，室温反应3～5h后，离心洗涤，得到ptnps。
19.所述步骤3)具体为：将fewox、ptnps分别分散在水中，再将两者混合，其中fewox与ptnps的质量比为1：(5～10)，搅拌过夜，洗涤，得到fp；将fp分散在水中，再与药物das混合，其中fp与das的质量比为1：(1～8)，搅拌20～28h后，再透析20～28h，去除游离的das，得到fpd。
20.所述步骤3)中将fewox与ptnps混合前，fewox和ptnps避光保存。
21.所述步骤4)中血小板经反复冻融提取出血小板膜的具体过程为：将血小板悬于磷
酸盐缓冲液中，于-80℃冻存30min，再37℃融化30min，反复3次，离心，提取出血小板膜。
22.所述步骤4)中将血小板膜制成pltm的具体过程为：将血小板膜悬置于磷酸盐缓冲盐水中，经超声处理后再使用200～400nm聚碳酸酯多孔膜过滤器来回抽提，制得pltm。
23.所述步骤5)中，所述e5肽具有如序列1所示的序列，具体为：gly-gly-arg-ser-phe-phe-leu-leu-arg-arg-ile-gln-gly-cys-arg-phe-arg-asn-thr-val-asp-asp；所述步骤5)的具体过程为：将e5肽和dspe-peg2000-nh2溶于磷酸盐缓冲盐水中，其中，e5肽和dspe-peg2000-nh2的质量比为1：(4～6)，于35～39℃反应4～8h，得到dspe-e5；然后将dspe-e5与pltm按质量比(2～5)：1混合，在35～39℃下搅拌4～8h，获得e-pltm。
24.所述步骤6)的具体过程为：将e-pltm与fpd按质量比(1～4)：1混合，经超声分散、融合后，用200～400nm针式过滤器来回挤压，再离心除去上清液，得到e-pltm@fpd。
25.根据上述制备方法制备的血小板膜修饰负载铂纳米颗粒的铁钨氧三元化物纳米平台。
26.所述血小板膜修饰负载铂纳米颗粒的铁钨氧三元化物纳米平台在作为癌症靶向药物中的应用。
27.本发明的有益效果：
28.本发明纳米平台e-pltm@fpd，是一种多功能纳米平台，其在808nm激光照射下具有优秀的光热(ptt)及光动力(pdt)作用，且其具有类过氧化物酶的活性，能够将h2o2分解为o2，一方面改善肿瘤缺氧状态为乳腺癌创造的良好转移微环境，另一方面为光动力作用提供更多的原材料。其pt还能转换为pt
2+
,与dna结合诱导dna损伤。因含有fe及w元素，其还具有优异的mri、ct成像功能，有助于乳腺癌的诊断和药物的追踪。为了实现对循环肿瘤的高靶向性，本发明通过新型血小板膜伪装并修饰fpd构建了新型载药系统e-pltm@fpd，其通过e5肽与pltm靶向原位、循环肿瘤细胞及肺部转移前龛，并竞争性的抑制乳腺肿瘤细胞与血小板结合从而缓解侵袭的过程。释放小分子药物达沙替尼(das)抑制肿瘤细胞生长。并结合fp的增强pdt和ptt作用杀伤肿瘤细胞。除了对原位肿瘤的杀伤作用，e-pltm@fpd还能够在血液循环中捕捉到肿瘤细胞，预防乳腺癌肺转移。同时该多功能纳米平台具有mri、ct成像功能，可以追踪其疾病发展及治疗效果。
29.本发明通过血小板膜保留了血小板表面特征性蛋白质而避免纳米递药系统被机体单核巨噬系统识别清除，并且pltm通过黏附分子能特异性的肿瘤细胞结合，从而实现对原位肿瘤细胞及循环肿瘤细胞的辅助靶向作用。e5肽是一种能与侵袭性肿瘤高表达(cxcr4)特异性结合的新型拮抗肽，能靶向循环肿瘤细胞甚至是转移前龛状态下的肺部以预防乳腺癌转移。
附图说明
30.图1为本发明制备方法流程示意图；
31.图2为实施例2纳米粒子的tem图；
32.图3为实施例2纳米粒子的uv-vis图；
33.图4为实施例2的药物装载释放：(a)e-pltm@fpd负载das的装载率(ee)和包封率(le)；(b)e-pltm@fpd在不同条件下das的释放情况；(c)das、fpd、pltm@fpd、e-pltm@fpd与乳腺癌肿瘤细胞孵育24小时后的细胞内分布情况，红色荧光为das，蓝色荧光为细胞核，绿
色荧光为溶酶体。
34.图5为实施例2纳米平台的体内靶向性；
35.图6为实施例2纳米平台在小鼠肿瘤治疗中的光热效果图；
36.图7为实施例2纳米平台在治疗乳腺癌荷瘤小鼠中的肿瘤体积变化：(1)pbs、(2)fp、(3)das、(4)fpd、(5)pltm@fpd、(6)e-pltm@fpd、(7)e-pltm@fpd+laser；
37.图8为实施例2纳米平台预防乳腺癌自发肺转移模型的效果图：(1)pbs、(2)fp、(3)das、(4)fpd、(5)pltm@fpd、(6)e-pltm@fpd、(7)e-pltm@fpd+laser；
38.图9为实施例2纳米平台的ct成像效果图：(a)体外ct成像效果，(b)体内肿瘤部位ct成像效果；
39.图10为实施例2纳米平台的肿瘤mri成像效果图。
40.图11为实施例2纳米平台注射入小鼠体内后各主要器官的h&e染色图。
具体实施方式
41.作为本发明的一个优选实施方式，一种血小板膜修饰负载铂纳米颗粒的铁钨氧三元化物纳米平台的制备方法，包括如下步骤：
42.1)将二水合钨酸钠、七水合硫酸亚铁与十二烷基苯磺酸钠(sdbs)混合，其中三者的摩尔比为(0.8～1.2):(0.8～1.2):(1.8～2.2)，用氢氧化钠水溶液调节ph至10后，将其转入反应釜中，于170～190℃下反应8～16h，离心洗涤，沉淀分散在水中，得到fewox分散液，避光，2～8℃保存，备用；
43.2)将聚乙烯吡咯烷酮(pvp)溶于六水合氯铂酸溶液中,质量比为(62～66)：(18～22)，形成a溶液；将硼氢化钠溶于冰水中制成浓度为0.5～0.7mg/ml的b溶液；将b溶液缓慢滴加入a溶液中，室温反应3～5h后，离心洗涤，沉淀分散在水中，得到ptnps分散液，避光，2～8℃保存，备用；
44.3)将fewox分散液与ptnps分散液混合，fewox与ptnps的质量比为1：(5～10)，搅拌过夜，洗涤，沉淀分散在水中，得到fp分散液，避光，2～8℃保存，备用；将fp与达沙替尼(das)混合，fp与das的质量比为1：(1～8)，搅拌20～28h，透析20～28h后去除游离的das，得到fpd；
45.4)取人抗凝新鲜全血，通过离心和洗涤从全血中分离出血小板，通过在-80℃冷冻30min,再37℃解冻30min，反复冻融3次，提取出血小板膜，将血小板膜悬置于磷酸盐缓冲盐水(pbs)中，超声处理(2-20min,42khz,100w)，然后分别使用200～400nm聚碳酸酯多孔膜过滤器来回抽提，得到纳米级血小板膜囊泡pltm；
46.5)e5肽和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-氨基化聚乙二醇(dspe-peg2000-nh2)溶于pbs中，e5肽和dspe-peg2000-nh2的质量比为1：(4～6)，于35～39℃缓慢搅拌4～8h，得到dspe-e5；然后将dspe-e5与pltm囊泡在35～39℃下混合搅拌4～8h，其中dspe-e5和pltm的质量比为(2～5)：1，最终获得e-pltm；
47.6)通过超声处理(2-20min,42khz,100w)将e-pltm囊泡悬液与fpd分散、融合后，通过200～400nm针式过滤器来回挤压20次，其中e-pltm与fpd的质量比为(1～4)：1，过量的e-pltm通过离心弃上清液去除，制得血小板膜修饰负载铂纳米颗粒的铁钨氧三元化物纳米平台e-pltm@fpd。
48.下面结合具体实施例对本发明作进一步解释与说明。
49.实施例1
50.1)合成铁钨氧三元化物fewox：
51.将8ml0.01m二水合钨酸钠加入8ml0.01m七水合硫酸亚铁与9mlsdbs(0.02m)的混合液中，用1m氢氧化钠水溶液调节ph至10后，将其转入反应釜中，于170℃下反应8h后，10000rpm离心洗涤，沉淀分散在0.5ml水中，得到fewox分散液，避光，2℃保存，备用；
52.2)合成铂纳米颗粒ptnps：
53.将62mgpvp溶于0.9ml六水合氯铂酸溶液(20mg/ml)中，形成a溶液；将18mg硼氢化钠溶于36ml冰水中，形成b溶液；将b溶液缓慢滴加入a溶液中，室温反应3h后，8000rpm离心20min，除去多余的pvp，沉淀分散在0.5ml水中，得到ptnps分散液，避光，2℃保存，备用；
54.3)达沙替尼(das)及铂纳米颗粒ptnps吸附于铁钨氧三元化物fewox上形成fpd：
55.将fewox分散液与ptnps分散液混合，其中fewox的质量为1mg，ptnps的质量为5mg，搅拌过夜，13000rmp离心5min，洗涤，沉淀分散在水中，得到fp分散液，避光，2℃保存，备用；将1mgfp加入1mldas(1mg/ml，溶剂为dmso)中，搅拌20h，透析20h后去除游离的das，得到fpd；
56.4)制备纳米级血小板膜囊泡：
57.取人抗凝新鲜全血，通过离心和洗涤从全血中分离出血小板,加入磷酸盐缓冲盐水(pbs)中制得1ml血小板悬液，通过在-80℃冷冻30min,再37℃解冻30min，反复冻融3次，提取出血小板膜，将血小板膜悬液超声处理(2min,42khz,100w)，然后使用200nm聚碳酸酯多孔膜过滤器来回抽提，得到纳米级血小板膜囊泡pltm。
58.5)制备e5肽修饰的血小板膜囊泡e-pltm：
59.分别称取5mge5肽、20mgdspe-peg2000-nh2溶于5mlpbs中，35℃缓慢搅拌4h，得到dspe-e5；然后将1mgdspe-e5与0.5mgpltm囊泡在35℃下混合搅拌4h，最终获得e-pltm。
60.6)通过超声分散最终得到血小板膜修饰负载铂纳米颗粒的铁钨氧三元化物纳米平台e-pltm@fpd：
61.通过超声处理(2min,42khz,100w)将e-pltm囊泡(1mg)悬液与fpd(1mg)分散在1mlpbs中，融合后通过200nm针式过滤器来回挤压20次后，过量的e-pltm通过离心(2500rpm10min,4℃)弃上清液去除，制得pltm包被的e-pltm@fpd。
62.实施例2
63.1)合成铁钨氧三元化物fewox：
64.将10ml二水合钨酸钠(0.01m)加入10ml七水合硫酸亚铁(0.01m)与10ml sdbs(0.02m)的混合液中，用氢氧化钠水溶液(1m)调节ph至10后，将其转入反应釜中，于180℃下反应12h后，10000rpm离心洗涤，沉淀分散在0.5ml水中，得到fewox分散液，避光，4℃保存，备用；
65.2)合成铂纳米颗粒ptnps：
66.将64mgpvp溶于1ml六水合氯铂酸溶液(20mg/ml)中，形成a溶液；将22mg硼氢化钠溶于36ml冰水中，形成b溶液；将b溶液缓慢滴加入a溶液中，室温反应4h后，8000rpm离心20min，除去多余的pvp，沉淀分散在0.5ml水中，得到ptnps分散液，避光，4℃保存，备用；
67.3)达沙替尼(das)及铂纳米颗粒ptnps吸附于铁钨氧三元化物fewox上形成fpd：
68.将fewox(1mg)与ptnps(7.5mg)混合，搅拌过夜，13000rmp离心5min，洗涤，沉淀分散在水中，得到fp，避光，4℃保存，备用；将1mgfp加入1mldas(4mg/ml，溶剂为dmso)中，搅拌24h，透析24h后去除游离的das，得到fpd；
69.4)制备纳米级血小板膜囊泡：
70.取人抗凝新鲜全血，通过离心和洗涤从全血中分离出血小板，加入磷酸盐缓冲盐水(pbs)中制得1ml血小板悬液，通过在-80℃冷冻30min,再37℃解冻30min，反复冻融3次，提取出血小板膜，将血小板膜悬液超声处理(5min,42khz,100w)，先后使用400nm和200nm聚碳酸酯多孔膜过滤器来回抽提，得到纳米级血小板膜囊泡pltm。
71.5)制备e5肽修饰的血小板膜囊泡e-pltm：
72.分别称取5mge5肽、25mgdspe-peg2000-nh2溶于5mlpbs中，37℃缓慢搅拌6h，得到dspe-e5，然后将1mgdspe-e5与0.3mgpltm在37℃下混合搅拌6h，最终获得e-pltm。
73.6)通过超声分散最终得到新型血小板膜修饰负载铂纳米颗粒的铁钨氧三元化物纳米平台e-pltm@fpd：
74.通过超声处理(5min,42khz,100w)将e-pltm囊泡(2mg)悬液与fpd(1mg)分散在1mlpbs中，融合后先后通过200nm针式过滤器来回挤压20次后，过量的e-pltm通过离心(2500rpm10min,4℃)弃上清液去除，制得pltm包被的e-pltm@fpd。
75.实施例3
76.1)合成铁钨氧三元化物fewox：
77.将12ml二水合钨酸钠(0.01m)加入12ml七水合硫酸亚铁(0.01m)与11mlsdbs(0.02m)的混合液中，用氢氧化钠水溶液(1m)调节ph至10后，将其转入反应釜中，于190℃下反应16h后，10000rpm离心洗涤，沉淀分散在0.5ml水中，得到fewox分散液，避光，8℃保存，备用。
78.2)合成铂纳米颗粒ptnps：
79.将66mgpvp溶于1.1ml六水合氯铂酸溶液(20mg/ml)中，形成a溶液；将25.2mg硼氢化钠溶于36ml冰水中，形成b溶液；将b溶液缓慢滴加入a溶液中，室温反应5h后，8000rpm离心20min，除去多余的pvp，沉淀分散在0.5ml水中，得到ptnps分散液，避光，8℃保存，备用。
80.3)达沙替尼(das)及铂纳米颗粒ptnps吸附于铁钨氧三元化物fewox上形成fpd：
81.将fewox(1mg)与ptnps(10mg)分散液混合，搅拌过夜，13000rmp离心5min，洗涤，沉淀分散在水中，得到fp分散液，避光，8℃保存，备用；将1mgfp加入1mldas(8mg/ml，溶剂为dmso)中，搅拌28h，透析28h后去除游离的das，得到fpd。
82.4)制备纳米级血小板膜囊泡：
83.取人抗凝新鲜全血，通过离心和洗涤从全血中分离出血小板，加入磷酸盐缓冲盐水中制得1ml血小板悬液，通过在-80℃冷冻30min,再37℃解冻30min，反复冻融3次，提取出血小板膜，将血小板膜悬液超声处理(20min,42khz,100w)，再使用200nm聚碳酸酯多孔膜过滤器来回抽提，得到纳米级血小板膜囊泡pltm。
84.5)制备e5肽修饰的血小板膜囊泡e-pltm：
85.分别称取5mge5肽、30mgdspe-peg2000-nh2溶于5mlpbs中，39℃缓慢搅拌8h，得到dspe-e5；然后将1mgdspe-e5与0.2mgpltm在39℃下混合搅拌8h，最终获得e-pltm。
86.6)通过超声分散最终得到新型血小板膜修饰负载铂纳米颗粒的铁钨氧三元化物
纳米平台e-pltm@fpd：
87.通过超声处理(20min，42khz，100w)将e-pltm囊泡(4mg)悬液与fpd(1mg)分散在1mlpbs中，融合后通过400nm针式过滤器来回挤压20次后，过量的e-pltm通过离心(2500rpm10min,4℃)弃上清液去除，制得pltm包被的e-pltm@fpd。
88.实施例4
89.对实施例2制得的粒子及纳米平台进行相关表征与测试，结果如下：
90.1、粒子的微观测试
91.实施例2制备的e-pltm@fpd的微观形貌如图2所示，可以看出，fpd被e-pltm成功包裹，制得具有壳核结构的e-pltm@fpd。
92.2、粒子的特征
93.实施例2制备的e-pltm@fpd的uv-vis图如图3所示，可以看出，e-pltm@fpd在215nm、260nm和330nm处具有特征性吸收峰，与fp、e5、das的特征性吸收峰一致，说明e-pltm@fpd的成功制备。
94.3、药物装载及释放特性
95.e-pltm@fpd装载释放das特性如图4a、4b所示，das在e-pltm@fpd中的装载率(ee)和包封率(le)分别为122.6％
±
10.2％以及87.0％
±
4.1％。在ph为7.4的生理条件下，e-pltm@fpd中的das释放缓慢，而在模拟肿瘤酸性微环境时(ph为5.4)，das从e-pltm@fpd中大量释放，在第48h时给予808nm近红外光照射后(2w/cm2，5min)，das释放速率进一步提高，这说明e-pltm@fpd释放das具有ph响应性及光照依赖性。
96.4、肿瘤细胞内的亚器官定位
97.e-pltm@fpd在乳腺癌肿瘤细胞中的定位如图4c所示，蓝色荧光为细胞核，绿色荧光为溶酶体，红色荧光为das。在24h孵育后，游离的das少量进入乳腺癌细胞中，pltm@fpd部分进入细胞并主要分布于细胞质的溶酶体内，e-pltm@fpd则大量进入细胞并分布于细胞质的溶酶体及细胞核中，而经过808nm近红外光照射后(2w/cm2，5min)，e-pltm@fpd几乎全部进入细胞核内(e-pltm@fpd+laser组)。这说明将das装载于fpd中，并进行血小板膜包裹及e5肽修饰有利于化疗药物被肿瘤细胞摄取，且近红外光照射有利于药物进入细胞核，这为化疗药物及pt破坏肿瘤细胞dna提供基础。
98.5、靶向性研究
99.为了验证e-pltm@fpd体内靶向乳腺癌部位的能力，构建4t1荷瘤小鼠，将装载荧光标记的das的fpd、pltm@fpd和e-pltm@fpd分别通过尾静脉注射入小鼠体内。如图5所示，通过6h、24h及48h活体成像并取出主要器官、肿瘤组织离体成像显示，e-pltm@fpd在48h时主要积聚于乳腺癌肿瘤部位，其他部位含量很少，证明e-pltm@fpd具有良好的肿瘤靶向性。
100.6、光热效应研究
101.为了验证e-pltm@fpd的体内光热作用，将fpd、pltm@fpd、e-pltm@fpd分别尾静脉注射入4t1荷瘤小鼠中24h后，利用近红外光(808nm，2w/cm2)照射肿瘤部位0、60、180及300s后，通过红外相机拍摄肿瘤部位温度升高的情况，结果如图6所示，在pbs、fpd、pltm@fpd、e-pltm@fpd组，近红外光照射300s后其温度分别上升至46.8
±
0.5℃、57.7
±
1.1℃、57.8
±
0.8℃、59.7
±
0.2℃，注射pbs后经照射300s后温度仅升高约6℃,而其余组均可在300s照射后温度升高15℃以上，特别观察到，e-pltm@fpd组较pltm@fpd、fpd组在肿瘤部位温度升高
幅度较大，这是由于e-pltm@fpd靶向乳腺癌，使其在乳腺癌肿瘤部位浓度较高而发挥光热作用导致的。
102.7、抗原位乳腺癌作用
103.将1
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105个4t1细胞原位注射入裸鼠左侧腹部脂肪垫后，用pbs、fp、das、fpd、pltm@fpd、e-pltm@fpd、e-pltm@fpd+laser组分别每隔一天治疗一次，治疗3次后，连续记录14天肿瘤体积的变化情况，并于d14安乐死小鼠后取肿瘤组织进行下一步试验。e-pltm@fpd+laser是指e-pltm@fpd+808nm近红外光照射(2w/cm2，5min)。结果如图7所示，较pbs组，fp组肿瘤大小没有明显变化，而das、fpd、pltm@fpd一定程度地延缓乳腺癌肿瘤体积的增长，e-pltm@fpd、e-pltm@fpd+laser组甚至可以减少原位乳腺癌的大小，为d0的0.623
±
0.10和0.41
±
0.04倍。
104.8、抗乳腺癌自发肺转移作用
105.为了验证抗乳腺癌转移的作用，将1
×
105个4t1-luc细胞原位注射入裸鼠左侧腹部脂肪垫后，在d2/d4/d6天进行pbs、fp、das、fpd、pltm@fpd、e-pltm@fpd、e-pltm@fpd+laser组处理，从d14天后每隔7天进行生物成像。e-pltm@fpd+laser是指e-pltm@fpd+808nm近红外光照射(2w/cm2，5min)。结果如图8所示，d21天开始，pbs组就发现了远处转移，到d42天，pbs组肺部、脾脏、骨等多部位出现转移，而经过e-pltm@fpd+laser组处理后至d42，无远处脏器转移的发生。e-pltm@fpd+laser可以明显抑制乳腺癌的自发转移。
106.9、ct成像作用
107.e-pltm@fpd的ct成像效果如图9所示，e-pltm@fpd在ct扫描仪下呈现浓度依赖性，hu(hounsfieldunit)随w的浓度增加而增加，其斜率为1856.0hu(mg/ml)-1
,表明其可作为良好的ct造影剂，并在小鼠体内验证，肿瘤部位注射e-pltm@fpd观察的增强ct图像发现，注射后肿瘤部位图像增亮，ct强度为未注射的6.70倍。
108.10、mri成像作用
109.为了验证其体内成像功能，将e-pltm@fpd原位注射入荷瘤小鼠体内，1h后采用7tmriscanner(phar-mascan70/16us,burker)扫描其核磁成像如图10所示，核磁图像显示较未注射组t1，t2均观察到肿瘤部位变暗。
110.11、生物安全性
111.为了验证e-pltm@fpd的生物安全性，将其尾静脉注射入小鼠体内，42天后取心、肝、脾、肺、肾进行h&e染色，如图11所示，未见主要器官有病理改变，说明其具有良好的生物安全性。

技术特征：
1.一种血小板膜修饰负载铂纳米颗粒的铁钨氧三元化物纳米平台的制备方法，包括如下步骤：1)通过有机相热分解法制得铁钨氧三元化物fewox；2)制得铂纳米颗粒ptnps；3)将步骤1)制得的fewox与步骤2)制得的ptnps混合，得到负载铂纳米颗粒的铁钨氧三元化物fp，再将fp与药物das混合，得到负载铂纳米颗粒和达沙替尼药物的铁钨氧三元化物fpd；4)收集抗凝新鲜全血，经离心、洗涤分离出血小板，血小板经反复冻融提取出血小板膜并制成纳米级血小板膜囊泡pltm；5)将e5肽和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-氨基化聚乙二醇dspe-peg2000-nh2混合，制得二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺修饰的e5肽dspe-e5，将dspe-e5与步骤4)制得的pltm混合，制得e5肽修饰的血小板膜囊泡e-pltm；6)将步骤5)制得的e-pltm与步骤3)制得的fpd混合，制得血小板膜修饰负载铂纳米颗粒的铁钨氧三元化物纳米平台e-pltm@fpd。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)具体为：将二水合钨酸钠、七水合硫酸亚铁与十二烷基苯磺酸钠按摩尔比(0.8～1.2):(0.8～1.2):(1.8～2.2)混合，调节ph至10后，于170～190℃下反应8～16h，离心洗涤，得到fewox。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)具体为：将聚乙烯吡咯烷酮溶于六水合氯铂酸溶液中，形成a溶液，其中，聚乙烯吡咯烷酮与六水合氯铂酸的质量比为(62～66)：(18～22)；将硼氢化钠溶于冰水中制成浓度为0.5～0.7mg/ml的b溶液；将b溶液滴加入a溶液中，室温反应3～5h后，离心洗涤，得到ptnps。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)具体为：将fewox、ptnps分别分散在水中，再将两者混合，其中fewox与ptnps的质量比为1：(5～10)，搅拌过夜，洗涤，得到fp；将fp分散在水中，再与药物das混合，其中fp与das的质量比为1：(1～8)，搅拌20～28h后，再透析20～28h，去除游离的das，得到fpd。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中血小板经反复冻融提取出血小板膜的具体过程为：将血小板悬于磷酸盐缓冲液中，于-80℃冻存30min，再37℃融化30min，反复3次，离心，提取出血小板膜。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中将血小板膜制成pltm的具体过程为：将血小板膜悬置于磷酸盐缓冲盐水中，经超声处理后再使用200～400nm聚碳酸酯多孔膜过滤器来回抽提，制得pltm。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述e5肽具有序列ggrsffllrriqgcrfrntvdd，见seq id no.1所示；所述步骤5)的具体过程为：将e5肽和dspe-peg2000-nh2溶于磷酸盐缓冲盐水中，其中，e5肽和dspe-peg2000-nh2的质量比为1：(4～6)，于35～39℃反应4～8h，得到dspe-e5；然后将dspe-e5与pltm按质量比(2～5)：1混合，在35～39℃下搅拌4～8h，获得e-pltm。8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤6)的具体过程为：将e-pltm与fpd按质量比(1～4)：1混合，经超声分散、融合后，用200～400nm针式过滤器来回挤压，再
离心除去上清液，得到e-pltm@fpd。9.一种如权利要求1～8任一项所述制备方法制备的血小板膜修饰负载铂纳米颗粒的铁钨氧三元化物纳米平台。10.一种如权利要求9所述的血小板膜修饰负载铂纳米颗粒的铁钨氧三元化物纳米平台在作为癌症靶向药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种血小板膜修饰负载铂纳米颗粒的铁钨氧三元化物纳米平台的制备方法及其产品与应用，包括以下步骤：1)通过有机相热分解法合成铁钨氧三元化物；2)合成铂纳米颗粒；3)达沙替尼药物及铂纳米颗粒吸附于铁钨氧三元化物上形成FPD；4)制备纳米级血小板膜囊泡；5)制备E5肽修饰的血小板膜囊泡；6)将FPD与E5肽修饰的血小板膜囊泡超声分散制得纳米平台。本发明纳米平台能高效装载化疗药物达沙替尼，生物安全性好，无毒副作用，能使其靶向原位及循环肿瘤细胞，结合光热作用、光动力作用及药物化疗，发挥抗原位乳腺癌及预防乳腺癌肺转移的作用。同时其优异的CT、MRI成像特性能用于监控体内肿瘤及药物情况。监控体内肿瘤及药物情况。监控体内肿瘤及药物情况。


技术研发人员：桂嵘 黄雪原 李建 董航 刘海艇 陆路
受保护的技术使用者：中南大学湘雅三医院
技术研发日：2023.02.20
技术公布日：2023/7/31