一种高产HBD-2的毕赤酵母工程菌株及其制备方法和应用

一种高产hbd-2的毕赤酵母工程菌株及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种高产hbd-2的毕赤酵母工程菌株及其制备方法和应用。


背景技术：

2.近年来，随着抗生素的滥用导致多重耐药菌感染，已经成为临床医学中亟待解决的难题，而新的可用于临床使用的抗生素的挖掘进展缓慢。因此，开发新型的抗菌药物迫在眉睫。防御素是已知发现的内源性抗生素肽家族中最大的亚家族，普遍存在于动物、植物及人体内，分子结构相对稳定，且具有强力广谱抗菌、抗病毒、抗螺旋体及抗肿瘤等生物学活性。其中，人β-防御素2(human β-defensin-2，hbd-2)是一种小分子抗菌肽，是由41个氨基酸残基组成，含有6个半胱氨酸残基，3对二硫键稳定其构型(三条反向平行的b-片层)的短肽。hbd-2表面带有较多正电荷，内部具有较多的疏水氨基酸组成疏水结构区，这样的结构使hbd-2具有亲水又亲脂的两亲性，能够在微生物细胞膜上形成孔道，破坏微生物细胞膜，达到杀菌和抑菌的作用。因此，hbd-2是具有重要应用前景的人源抗菌肽，可以应用于食品、医药、饲料等领域。但hbd-2在机体正常组织中水平很低，不适合通过分离纯化的方法在正常组织中获得具有生物活性的hbd-2。化学法合成hbd-2的价格相当昂贵，从而严重阻碍了hbd-2的大规模生产及其工业化应用。
3.鉴于hbd-2正确折叠需要形成3对二硫键，而微生物细胞自身形成二硫键的能力较弱，所以很难制备获得结构正确的hbd-2。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的第一技术问题在于提供一种高产hbd-2的毕赤酵母工程菌株；本发明所要解决的第二技术问题在于提供上述高产hbd-2的毕赤酵母工程菌株的构建方法；本发明所要解决的第三技术问题在于提供所述的毕赤酵母工程菌株在一步发酵生产hbd-2中的应用。
5.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
6.一种高产hbd-2的毕赤酵母工程菌株，以毕赤酵母为表达菌株，在表达菌株内构建有共表达编码人β-防御素基因hβd-2、硫氧还蛋白基因trxa、蛋白质二硫键异构酶的基因dsca和肠激酶基因rek的质粒；其中，hβd-2的核苷酸序列如seq id no.1所示，trxa的核苷酸序列如seq id no.2所示，dsca的核苷酸序列如seq id no.3所示，rek的核苷酸序列如seq id no.4所示。
7.所述毕赤酵母为毕赤酵母p.pastoris gs 115。
8.所述高产hbd-2的毕赤酵母工程菌株的构建方法，包括以下步骤：
9.1)构建携带有编码人β-防御素基因hβd-2、编码硫氧还蛋白基因trxa、蛋白质二硫键异构酶的基因dsca和肠激酶基因rek的表达载体；
10.2)以毕赤酵母为宿主，转化步骤1)得到的表达载体，获得人β-防御素的毕赤酵母
dsca-t2a4-rek发酵24h后的发酵上清样品，泳道3为重组毕赤酵母p.pastoris gs115ppic9k-hβd-2-t2a3-trxa-t2a4-rek：：ppic9k-hβd-2-t2a3-dsca-t2a4-rek发酵48h后的发酵上清样品，泳道4为重组毕赤酵母p.pastoris gs115ppic9k-hβd-2-t2a3-trxa-t2a4-rek：：ppic9k-hβd-2-t2a3-dsca-t2a4-rek发酵72h后的发酵上清样品，泳道5为重组毕赤酵母p.pastoris gs115ppic9k-hβd-2-t2a3-trxa-t2a4-rek：：ppic9k-hβd-2-t2a3-dsca-t2a4-rek发酵液上清的镍柱纯化样品；
27.图4maldi-tof-ms分析纯化得到的hbd-2样品图；
28.图5是hbd-2的抑菌效果分析结果图；
29.图6是重组毕赤酵母合成hbd-2的成本核算图。
具体实施方式
30.下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
31.实施例1hbd-2重组表达载体的构建
32.1、hbd-2重组表达载体的构建
33.根据备选基因人源β-防御素基因hβd-2的氨基酸序列(genbank：aac69554.1)，经密码子优化合成hbd-2基因序列seq id no.1；根据备选硫氧还蛋白氨基酸序列(genbank：ank04315.1)，经密码子优化合成trxa基因序列seq id no.2；根据备选蛋白质二硫键异构酶氨基酸序列(genbank：emd01501.1)，经密码子优化合成dsca基因序列seq id no.3；根据备选肠激酶氨基酸序列(genbank：cab65555.1)，经密码子优化合成rek基因序列seq id no.4；分别设计引物f1
34.(gagaaaagagaggctgaagctatgcgggtgctgtatcttcttttttc)和r1
35.(tggacctgggttttcctcaacgtcaccgcaagtaagcaaagaacctctaccctcttaaggtttcttacagcacttgg)，f2
36.(gagggtagaggttctttgcttacttgcggtgacgttgaggaaaacccaggtccaatgttatatgagtccgtaagc)和r2
37.(aggacctggattctcttcgacatctccacaggtcaaaagggatccacgtccttcttatgcaaggttagcatcgagg)，f3
38.(gaaggacgtggatcccttttgacctgtggagatgtcgaagagaatccaggtcctatgaccatagaatattttgcc)和r3
39.(aggcgaattaattcgcggccgcttattcatgaccgctttctgaatc)，f4
40.(gaaggacgtggatcccttttgacctgtggagatgtcgaagagaatccaggtcctatgggctcgaagcgggg)和r4
41.(aggcgaattaattcgcggccgcttaatgcaaaaagctttgtatccattcc)，利用高保真pcr聚合酶prime star扩增人源β-防御素、硫氧还蛋白、蛋白质二硫键异构酶和肠激酶的基因片段，经gibbson组装，同源重组整合到ppic9k的snab i和not i位点，构建重组表达载体ppic9khd-2-t2a3-trxa-t2a4-rek(图1)、ppic9k-hβd-2-t2a3-dsca-t2a4-rek(图2)。其中，t2a3肽(核苷酸序列：gagggtagaggttctttgcttacttgcggtgacgttgaggaaaacccaggtcca；氨基酸序列：egrgslltcgdveenpgp)、t2a4肽(核苷酸序列：gaaggacgtggatcccttttgacctgtggagatgtcgaagagaatccaggtcct；氨基酸序列：egrgslltcgdveenpgp)为自我剪切的短小肽链，用
于在真核生物中构建多顺反子。
42.2、毕赤酵母细胞工厂的构建
43.利用实施例1中的重组表达载体ppic9k-hβd-2-t2a3-trxa-t2a4-rek、ppic9k-hβd-2-t2a3-pdi-t2a4-rek各50ng，分别加入5μl限制性快切酶sali和bgl ii，37℃孵育2h后，回收线性化的重组表达载体片段。将得到的片段与毕赤酵母p.pastoris gs115感受态冰上孵育30min后，2000v电击5ms后，加入1ml遇冷的1m山梨醇溶液后，涂布含有4mg/ml g418的md培养皿，筛选阳性转化子，即为毕赤酵母细胞工厂。
44.实施例2人源b-防御素的发酵制备
45.1、毕赤酵母细胞工厂的培养
46.挑取在含有4mg/ml g418的md平板上的单菌落(实施例1制备的阳性转化子)接种于5ml ypd培养液中，30℃培养16h后转接于200ml ypd培养液，30℃培养过夜后转接2l bsm培养基(26.7ml 85％h3po4，0.93gcaso4·
2h2o，18.2g k2so4，14.9g mgso4·
2h2o，4.13g koh，20-60g甘油)，30℃培养6h后，按照350ml/h的速度，恒速流加50％的甘油10小时，继续培养5-6h至溶氧反弹至100％后，流加终浓度为0.5％(v/v)的甲醇溶液，同时将培养温度降低至25℃，培养4d后，8000rpm，4℃离心5min，收集上清，即为hbd-2粗品。
47.2、hbd-2的纯化
48.用buffer a(20mm tris-hcl，0.5m nacl，20mm咪唑，ph 7.4)平衡ni-nta agarose fast flow柱子后，将产物粗品透过0.22μm滤膜后，上清液以3ml/min的速度通过ni-nta agarose fast flow柱子，结合10min后，buffer b(20mm tris-hcl，0.5m nacl，500mm咪唑，ph 7.4)洗脱收集酶活性部分，浓缩，冷冻干燥，即为hbd-2纯品(图3)。
49.结果表明，毕赤酵母分泌表达的hbd-2的大小约为6.5kd(图4)，与hbd-2的理论值相当，经maldi-tof-ms测定表明，纯化得到的蛋白分子量为5157.04，即毕赤酵母分泌表达的蛋白为hbd-2。此外，随着发酵时间的延长，hbd-2的积累量逐渐增加，发酵72h时hbd-2达到63mg/l(图3泳道4)。经镍柱纯化后，得到hbd-2的单一条带(图3泳道5)，以备后续的抑菌试验。
50.实施例3hbd-2的抑菌实验
51.分别挑取大肠杆菌、绿脓杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌单菌落，接种于3ml lb培养基(含有终浓度为10mg/l β-防御素2，对照样品不含有β-防御素2，或50mg/l氨苄青霉素)中，30℃培养24h后测定其od
600nm
值(图5)。
52.结果表明，10mg/l β-防御素2对大肠杆菌、绿脓杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的抑制率分别为96％，98％，96％，100％，抑菌效果与氨苄青霉素相当。
53.实施例4hbd-2的生产成本核算
54.按照实施例2所采用的方法，以5l发酵罐水平重组毕赤酵母胞外β-防御素2的积累水平，计算β-防御素2的生产成本。
55.根据考马斯亮蓝染色测定结果表明重组毕赤酵母生产β-防御素2的产量达到1.2g/l。据此得到毕赤酵母生产β-防御素2的成本约为0.75万元/公斤，远低于动物组织提取β-防御素2的成本(20万元/公斤)(图6)。
56.虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范
围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：
1.一种高产hbd-2的毕赤酵母工程菌株，其特征在于，以毕赤酵母为表达菌株，在表达菌株内构建有共表达编码人β-防御素基因hβd-2、硫氧还蛋白基因trxa、蛋白质二硫键异构酶的基因dsca和肠激酶基因rek的质粒；其中，hβd-2的核苷酸序列如seq id no.1所示，trxa的核苷酸序列如seq id no.2所示，dsca的核苷酸序列如seq id no.3所示，rek的核苷酸序列如seq id no.4所示。2.根据权利要求1所述的高产hbd-2的毕赤酵母工程菌株，其特征在于，所述毕赤酵母为毕赤酵母p.pastoris gs115。3.权利要求1所述高产hbd-2的毕赤酵母工程菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)构建携带有编码人β-防御素基因hβd-2、编码硫氧还蛋白基因trxa、蛋白质二硫键异构酶的基因dsca和肠激酶基因rek的表达载体；2)以毕赤酵母为宿主，转化步骤1)得到的表达载体，获得人β-防御素的毕赤酵母工程菌株。4.根据权利要求3所述高产hbd-2的毕赤酵母工程菌株的构建方法，其特征在于，以ppic9k作为载体质粒，在表达载体ppic9k上同时构建人β-防御素基因hβd-2、硫氧还蛋白基因trxa、蛋白质二硫键异构酶基因dsca和肠激酶基因rek的表达框；得到重组表达载体ppic9k-hβd-2-t2a3-trxa-t2a4-rek，ppic9k-hβd-2-t2a3-dsca-t2a4-rek以毕赤酵母p.pastoris gs115作为宿主菌转化重组表达载体获得hbd-2的重组工程菌株。5.权利要求1所述的毕赤酵母工程菌株在生产人β-防御素中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将毕赤酵母工程菌株活化后，转接到发酵培养基中20-35℃进行发酵培养，培养至od
600nm
为100-500，加入终浓度为0.1％-3％(v/v)的甲醇，诱导72h后离心收集发酵液上清。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：每升培养基中含26.7ml 85％h3po4，0.93g caso4·
2h2o，18.2g k2so4，14.9g mgso4·
2h2o，4.13g koh，20-60g甘油。8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：每升培养基中含26.7ml 85％h3po4，0.93g caso4·
2h2o，18.2g k2so4，14.9g mgso4·
2h2o，4.13g koh，1-20ml甲醇。9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，发酵培养温度为30℃；甲醇的终浓度为0.5％。10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，毕赤酵母培养周期为48-96h。

技术总结
本发明公开了一种高产HBD-2的毕赤酵母工程菌株及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。本发明以毕赤酵母为表达菌株，通过共表达编码人β-防御素的基因hβD-2、编码硫氧还蛋白的基因Trxa、编码蛋白质二硫键异构酶的基因DscA和肠激酶基因rEK，构建人β-防御素2的合成途径，获得人β-防御素2的积累菌株。本发明为人β-防御素2的合成提供了新的策略，其生产效率比酶法切割重组防御素及化学法合成防御素明显提高，生产成本大大降低，为防御素的工业化大规模生产奠定了基础。工业化大规模生产奠定了基础。工业化大规模生产奠定了基础。


技术研发人员：孙彬 查建生 谢光蓉 汪仁 周正雄 李洁 张越
受保护的技术使用者：江苏省中国科学院植物研究所
技术研发日：2023.02.08
技术公布日：2023/7/31