一种核酸适体及应用其的球形棕囊藻荧光分子检测探针的制作方法

1.本发明属于生物工程技术领域，特别地，涉及一种核酸适体及应用其的球形棕囊藻荧光分子检测探针。


背景技术：

2.球形棕囊藻(phaeocystis globosa scherffel)属于定鞭藻门，定鞭藻纲，是海洋中广泛分布的微藻。是一种广盐广温性的浮游植物，可形成大规模的赤潮。在全世界范围内的近海和开阔海洋中有着广泛的分布，赤潮暴发时形成的大量囊体还可堵塞核电站冷源取水系统，给海洋环境、水产养殖业和核电安全等造成极大危害，威胁核电运行安全，受到各级政府部门的高度关注。
3.球形棕囊藻作为海洋环境、水产养殖业和核电安全等的有害藻类之一，及早发现及提前采取有效防控措施可有效降低损失。因此研发操作便捷、成本低、耗时短、准确度高的快速检测技术，对于控制球形棕囊藻的危害极其重要。
4.核酸适体指的是经体外筛选技术selex(指数富集配体系统进化)筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段。核酸适体具有亲和性和特异性高、稳定性强、易于化学合成和修饰等诸多优点。基于适配体能够高特异性识别靶细胞的生物学特性，核酸适体广泛应用于检测技术开发和生物传感器的构建，能够实现对靶目标的精确检测诊断。因此利用核酸适体的特点开发精准检测球形棕囊藻将具有广阔的应用前景。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种核酸适体及应用其的球形棕囊藻荧光分子检测探针，以提高球形棕囊藻的检测水平，有效提高防控球形棕囊藻的效率。
6.根据本发明的一个方面，提供一种核酸适体，该核酸适体的核苷酸序列如seq id no.1所示。
7.优选地，seq id no.1所示的核苷酸序列上的至少一个碱基被磷酸化、巯基化、甲基化、氨基化或同位素化。
8.优选地，该核酸适体的二级结构如下：
[0009][0010]
优选地，核酸适体被标记物标记，标记物选自生物素、发光物质、酶中的至少一种。
[0011]
根据本发明的第二个方面，提供一种应用上述核酸适体快速检测球形棕囊藻的方法，包括以下步骤：核酸适体被标记物标记；使核酸适体与待测样品进行孵育，接着洗涤待测样品，最后对待测样品进行标记物的标记信号检测，通过标记信号的强度作出待测样品中是否含有球形棕囊藻的判断；该应用不包括在疾病诊断中的应用。
[0012]
根据本发明的第三个方面，提供上述核酸适体在制备检测球形棕囊藻的产品中的应用，该应用不包括在疾病诊断中的应用。
[0013]
根据本发明的第四个方面，提供一种球形棕囊藻的荧光分子检测探针，包括上述核酸适体，标记物为发光物质。
[0014]
与现有的技术相比，本发明的优点在于：
[0015]
①
本发明提供的核酸适体，对球形棕囊藻具有高敏感性，与现有的蛋白类抗体相比，本发明通过selex技术筛选得到的核酸适体对球形棕囊藻具有更高的亲和力和特异性，而且还具有蛋白类抗体所不具备的特点，包括无免疫原性、制备周期短、重现性好、分子量小、便于体外化学合成、便于标记、易于对核酸适体的不同部位进行修饰和取代、序列稳定易于运输和保存等。
[0016]
②
采用基于本发明提供的核酸适体对球形棕囊藻进行检测的检测方法，操作简单迅速、能够达到较高的准确率和灵敏度。可利用该核酸适体构建分子探针或检测试剂盒，并结合酶标仪、流式细胞仪、荧光显微镜等检测设备，实现球形棕囊藻的精确检测。这对于球形棕囊藻的快速检测具有重要意义，在球形棕囊藻的检测领域有广阔的应用前景。
附图说明
[0017]
图1是dna序列为seq id no.1的核酸适体的二级结构预测图；
[0018]
图2是实施例2中流式细胞仪检测的样品fam荧光值的测试结果；
[0019]
图3是测得核酸适体seq id no.1与球形棕囊藻细胞的解离常数绘制曲线。
具体实施方式
[0020]
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
[0021]
实施例1
[0022]
本实施例为筛选和制备可以检测球形棕囊藻的核酸适体。
[0023]
s1.第一ssdna文库的构建和引物的合成
[0024]
设计合成第一ssdna文库library 50，其核苷酸序列如下：
[0025]5’‑
gacgcttactcaggtgtgactcg(50n)cgaaggacgcagatgaagtctc。
[0026]
其中，两端为固定序列，中间50个核苷酸为随机序列。
[0027]
上游引物包括如seq id no.2所示的dna序列，并被羟基荧光素(fam)标记，其具体的序列为：5
’‑
fam-gacgcttactcaggtgtgactcg-3’。
[0028]
下游引物包括如seq id no.3所示的dna序列，并被生物素(biotin)标记，其具体的序列为：5
’‑
biotin-gagacttcatctgcgtccttcg-3’。
[0029]
第一ssdna文库和引物均由上海生工生物有限公司合成。
[0030]
s2.selex筛选获得特异性识别球形棕囊藻细胞的核酸适体(阳性筛选)
[0031]
s2.1将10nmol上述第一ssdna文库溶解在500μl pbs中，92℃恒温水浴5min，然后迅速插入冰中，冰浴10min，将处理后的第一ssdna文库与球形棕囊藻细胞在冰上孵育1h；
[0032]
s2.2孵育结合完成后，离心移除上清，用10ml的pbs洗涤球形棕囊藻细胞，92℃恒温水浴10min，12000g离心收集上清，即为特异性识别球形棕囊藻细胞的第二ssdna文库。
[0033]
s3.pcr扩增
[0034]
取100μl筛选得到的第二ssdna文库，使其与上游引物、下游引物进行pcr扩增。pcr反应体系如下(1000μl)：10
×
buffer 100μl,dntp mix(2.5mm)80μl，上游引物40μl，下游引物40μl，第二ssdna文库100μl，rtaq酶12.5μl，ddh2o 627.5μl。按照如下程序进行pcr扩增：92℃5分钟，92℃1分钟，60℃30秒，72℃1分钟，经过25轮循环；72℃5分钟。第一轮循环筛选后得到的上清，要全部用于进行后续的pcr扩增，得到扩增后的dsdna文库。
[0035]
s4.第三ssdna文库的制备
[0036]
将100μl链酶亲和素标记的磁珠与dsdna文库在常温下孵育20min，利用dsdna文库上的生物素与磁珠上链酶亲和素的亲和作用，将dsdna文库结合到磁珠表面，利用磁性分离器上除去上清，用2ml pbs洗涤磁珠，然后在ep管中加入200μl naoh溶液(200mm)，常温反应15min，使dsdna文库变性解链，带有生物素的一条链与链亲和素结合留在磁珠上，以与磁珠结合的单链dna作为第三ssdna文库，利用磁性分离架回收得到上清液；将上清液中正向单链核酸用pcr纯化回收试剂盒纯化回收，收集到的溶液用于下一轮的筛选。
[0037]
s5.反复筛选
[0038]
将s4中得到的第三ssdna文库代替第一ssdna文库，重复s2～s4所示的阳性筛选过程、pcr扩增及单链dna文库的制取过程9次。
[0039]
s6.阴性筛选
[0040]
在s5的第二轮及第二轮以后筛选中，用中肋骨条藻(skeletonema costatum)细胞为对照，将s5后筛选得到的ssdna文库进行阴性筛选以提高筛选效率。具体的阴性筛选过程为：将筛选得到的ssdna文库溶解，在92℃下恒温水浴，与中肋骨条藻细胞在冰上孵育1h，孵育完成后离心收集上清溶液，即为经过阴性筛选的ssdna文库。
[0041]
s7.9轮筛选
[0042]
将s6中收集到含有ssdna文库的上清液，经过s3的pcr扩增和s4的ssdna文库制备后，依次重复进行s6、s2、s3和s4的过程，利用流式细胞仪检测所得ssdna文库对球形棕囊藻细胞的识别能力的变化情况，重复进行9轮筛选，此时得到的ssdna文库对球形棕囊藻识别能力达到最强。将所得扩增产物经克隆测序分析后，最终得到本实施例中可用于检测球形棕囊藻的核酸适体，其dna序列为：
[0043]
gttgtgggtgtttgtgggggtgggtggtgggtttctctctgcgtgggcttggtgtggttggatc(seq id no.1)
[0044]
利用mfold软件(http://mfold.rna.albany.edu/？q＝mfold/dna-folding-form)在线预测seq id no.1的二级结构，预测结果如图1所示，dna序列为seq id no.1的核酸适体形成特殊的茎环结构和发卡结构。
[0045]
实施例2
[0046]
本实施例为检测实施例1中筛选出来的核酸适体对球形棕囊藻细胞的结合效果及其特异性。
[0047]
参试对象：实验ⅰ组、对照组中经过孵育所得到的细胞重悬液。
[0048]
实验组：利用羟基荧光素(fam)对seq id no.1核酸适体进行标记，取10nmol被标记后的seq id no.1核酸适体溶解在500μl pbs中，92℃恒温水浴5min，然后迅速插入冰中，冰浴10min，将处理后的核酸适体与球形棕囊藻细胞在冰上孵育1h，孵育结合完成后，离心移除上清液。
[0049]
对照组：本对照组参照实验组提供的孵育方法，制备得到细胞重悬液，本对照组与实验ⅰ组的区别在于在孵育过程中，选用等量的pbs溶液代替核酸适体。其余原料和制备方法与实验组严格保持一致。
[0050]
测试方法：利用流式细胞仪分别检测参试对象所得到的细胞重悬液。
[0051]
实验结果：测试结果如图2所示，将图2中实验组与对照组的荧光值进行对比，流式细胞仪检测到实验组的细胞表面羟基荧光素(fam)的荧光值更高。由此说明，序列为seq id no.1的核酸适体对球形棕囊藻细胞具有高特异性识别能力。
[0052]
实施例3
[0053]
本实施例利用流式细胞仪与sigmaplot软件分析羟基荧光素(fam)标记的核酸适体对球形棕囊藻细胞相互结合强度。
[0054]
平行配置不同浓度(0～1000nm)的核酸适体seq id no.1的溶液。利用羟基荧光素(fam)对seq id no.1核酸适体进行标记，取被标记后的seq id no.1核酸适体溶解在500μl pbs中，分别制得浓度为62.5、125、250、1000nmol/l的溶液。将溶液于92℃恒温水浴5min，然
后迅速插入冰中，冰浴10min，将处理后的核酸适体与球形棕囊藻细胞在冰上孵育1h，孵育结合完成后，离心清洗3次，用300μlpbs缓冲液重悬，得到细胞重悬液。流式细胞仪检测上述细胞重悬液的荧光平均值，然后使用sigmaplot软件计算核酸适体结合靶标细胞的解离平衡常数(kd)。
[0055]
实验结果：检测结果如图3所示，结果证实，羟基荧光素(fam)标记的seq id no.1所示的核酸适体结合靶球形棕囊藻的亲和力为348.69nmol/l。
[0056]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

技术特征：
1.一种核酸适体，其特征在于：所述核酸适体的核苷酸序列如seq id no.1所示。2.如权利要求1所述核酸适体，其特征在于：所述seq id no.1所示的核苷酸序列上的至少一个碱基被磷酸化、巯基化、甲基化、氨基化或同位素化。3.如权利要求1所述核酸适体，其特征在于，其二级结构如下：4.如权利要求1～3任一项所述核酸适体，其特征在于：所述核酸适体被标记物标记，所述标记物选自生物素、发光物质、酶中的至少一种。5.一种应用如权利要求1～3任一项所述核酸适体快速检测球形棕囊藻的方法，其特征在于，包括以下步骤：所述核酸适体被标记物标记；使所述核酸适体与待测样品进行孵育，接着洗涤所述待测样品，最后对待测样品进行所述标记物的标记信号检测，通过所述标记信号的强度作出所述待测样品中是否含有球形棕囊藻的判断；所述应用不包括在疾病诊断中的应用。6.如权利要求1～3任一项所述核酸适体在制备检测球形棕囊藻的产品中的应用，所述应用不包括在疾病诊断中的应用。7.一种球形棕囊藻的荧光分子检测探针，其特征在于，包括如权利要求4所述核酸适体，所述标记物为发光物质。

技术总结
本发明提供一种核酸适体及应用其的球形棕囊藻荧光分子检测探针，该核酸适体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的核酸适体对球形棕囊藻具有更高的亲和力和特异性，此外，还具有无免疫原性、制备周期短、重现性好、分子量小、便于体外化学合成、便于标记、易于对核酸适体的不同部位进行修饰和取代、序列稳定易于运输和保存等优点。采用基于本发明的核酸适体的快速检测方法对球形棕囊藻进行检测时，操作简单迅速、能够达到较高的准确率和灵敏度。可利用该核酸适体构建分子探针或检测试剂盒，实现对球形棕囊藻的精确检测。实现对球形棕囊藻的精确检测。实现对球形棕囊藻的精确检测。


技术研发人员：程远 李鹏飞 元昌安 余庆 刘明珠 王高学 凌飞
受保护的技术使用者：广西若纳生物科技有限公司
技术研发日：2023.02.14
技术公布日：2023/7/31