通过细胞重编程及再分化获得的肿瘤特异性杀伤性T细胞及方法

通过细胞重编程及再分化获得的肿瘤特异性杀伤性t细胞及方法
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，特别涉及一种通过细胞重编程及再分化获得的肿瘤特异性杀伤性t细胞及方法。


背景技术：

2.目前，我国大部分原发性肝癌患者的病因均为乙肝病毒感染，现有技术中记载了原发性肝癌(hcc)组织中浸润性t淋巴细胞(til)表达大量衰老分子，浸润性淋巴细胞处于免疫无能和衰老状态。浸润性t淋巴细胞较早即可在慢性肝炎病毒感染中被诱导耐受，原发性肝癌发生后浸润性t淋巴细胞在肿瘤微环境中更进一步被诱导无能和衰老，加上肝脏特有的免疫耐受器官环境，原发性肝癌中的浸润性t淋巴细胞较其它肿瘤的浸润性细胞更难以激活扩增。原发性肝癌中的浸润性t淋巴细胞对cd3单抗等刺激仅能扩增20倍，很难恢复免疫活力。传统方法很难对衰老的浸润性t淋巴细胞进行恢复，如用抗体阻断klrg1、lag3等其他众多衰老分子，很难恢复。因此，突破上述传统方法，寻找恢复浸润性t淋巴细胞的免疫活性的方法至关重要。


技术实现要素：

3.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种通过细胞重编程及再分化获得的肿瘤特异性杀伤性t细胞的方法。
4.本发明的另一目的在于提供一种通过细胞重编程及再分化获得的肿瘤特异性杀伤性t细胞，是通过上述方法制备得到。
5.本发明的目的通过下述技术方案实现：一种通过细胞重编程及再分化获得的肿瘤特异性杀伤性t细胞的方法，包括如下步骤：
6.(1)培养肝癌组织浸润t细胞，再以表达oct4、sox2、c-myc和klf4四种转录因子的仙台病毒感染细胞；
7.(2)转染后第2天，用培养基a培养2天；培养基a为t细胞完全培养基和不含因子的stem-pro 34培养基按体积比1：1混合得到的培养基；
8.(3)将步骤(2)培养得到的细胞转移到基质胶铺板的培养板中用重编程诱导培养液培养；此后每隔1～2天更换为重编程诱导培养液，并在37℃、5％co2的条件下培养，直至出现诱导多能干细胞克隆；
9.(4)出现诱导多能干细胞克隆后更换为mtesr培养基，于35～39℃和3～7％co2的条件下继续培养，培养期间每隔1～2天更换干细胞培养基；
10.(5)待充分重编程后，挑取单克隆，继续扩大培养并筛选，经ap染色为阳性，且表达多能性蛋白nanog、ssea-4、tra-1-60与tra-1-81的细胞即为目的t-ipsc；
11.(6)t-ipsc与op9/dl1细胞共培养分化为肿瘤特异性杀伤性t细胞。
12.步骤(1)中所述的肝癌组织浸润t细胞优选为人肝癌组织浸润t细胞。
13.步骤(1)中所述的肝癌组织浸润t细胞优选为cd8
+
t细胞。
14.步骤(1)中所述的肝癌组织浸润t细胞优选通过如下步骤制备得到：获取肝癌组织，提取浸润的t淋巴细胞，磁珠分选富集ctl。
15.步骤(1)中所述的培养的时间优选为48h。
16.步骤(1)中所述的以表达oct4、sox2、c-myc和klf4四种转录因子的仙台病毒感染细胞的具体步骤优选如下：以表达klf4、oct4、sox2的kos仙台病毒，表达c-myc和表达klf4的仙台病毒感染细胞，各病毒的感染复数的比例是kos:c-myc：klf4＝5:5:3。
17.步骤(3)中所述的重编程诱导培养液优选为不含因子的stem-pro 34培养基。
18.步骤(6)所述的共培养分化的步骤优选如下：
19.1)将t-ipsc细胞克隆置于op9/dll1细胞饲养层上用mtesr培养基培养；
20.2)待t-ipsc细胞克隆贴壁后用培养液b培养；培养液b为mtesr培养基和op9培养基按体积比1：1配比得到；
21.3)当t-ipsc细胞克隆扩大到所需大小，停止加入mtesr培养基，加入含有vegf、scf、flt-3l的op9培养基；
22.4)t-ipsc克隆长大成立体团块克隆大小后，逐渐改用t细胞培养基；t细胞培养基内含有flt-3l和il-7，继续诱导分化，使其重分化为cd3
+
t淋巴系细胞；
23.5)接着加入cd3/cd28单抗刺激，然后加入丝裂霉素处理的pbmcs和细胞因子il-7、il-15继续培养，得到cd8
+
t细胞。
24.步骤4)中所述的继续诱导分化的时间优选为25天。
25.步骤5)中所述的继续培养的时间优选为15天。
26.一种通过细胞重编程及再分化获得的肿瘤特异性杀伤性t细胞，通过上述方法制备得到。
27.上述通过细胞重编程及再分化获得的肿瘤特异性杀伤性t细胞在制备抗肿瘤制剂中的应用。
28.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
29.采用本发明提供的方法能够使免疫功能受损的浸润性t淋巴细胞的免疫功能得到恢复，从而能用于抗肿瘤治疗。
附图说明
30.图1为癌旁组织(anlt)和肿瘤组织(hcc)的cd8
+
t细胞检测结果图。可见，与肿瘤组织(hcc)相比，癌旁组织(anlt)cd8
+
t细胞数量明显升高。
31.图2为cd3/28抗体联合il-2、il-7、il-15刺激肿瘤、癌旁组织cd8
+
t细胞数量变化结果图；其中，a和b为癌旁组织cd8
+
t细胞添加il-2、il-7、il-15与cd3/28抗体刺激一周的前后对比图；c为癌旁组织cd8
+
t细胞与肿瘤组织cd8
+
t细胞细胞增殖对比图。
32.图3为癌旁组织cd8
+
t细胞重编程过程照片图；其中，a、c、e和g为饲养层方案，a为转染成功的cd8
+
t细胞铺板于饲养层mef细胞上，c为转染成功的克隆最初的形态，e为转染克隆生长情况，g为克隆长大后的形态；b为转染成功的cd8
+
t细胞铺板于基质胶上，d为转染成功的克隆最初的形态，f为转染克隆生长情况，h为克隆长大后的形态。
33.图4为获得的t-ipsc克隆观察与鉴定结果图；其中，a和b分别为t-ipsc克隆图像及
碱性磷酸酶染色图；c为tipsc的免疫荧光染色照片。
34.图5为t-ipsc的传代与培养的照片图；其中，a为t-ipsc克隆消化传代第一天；b为t-ipsc克隆培养第3天；c为t-ipsc克隆形成第5天。
35.图6为t-ipsc向cd8
+
t细胞的初步分化结果图；其中，a为t-ipsc未分化状态；b为t-ipsc分化第30天，成功分化出双阳性t细胞和单阳性cd8 t+细胞；c为t-ipsc分化第30天；d为t-ipsc分化第60天，单阳性cd8 t
+
细胞比例增加；e为癌旁组织、外周血、再分化cd8
+
t细胞增殖一周细胞数量变化。
具体实施方式
36.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
37.除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
38.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
39.实施例1t淋巴细胞原代分离与培养
40.1、肝组织研磨：
41.(1)用无菌小刀将肝组织剪碎，与下有50ml离心管的滤网中研磨，边沿磨边加入rpmi 1640，直至肝组织研磨成白色纤维状。
42.(2)收集研磨后液体，分装两管，加入等量pbs离心，500
×
g 10min。
43.(3)倒掉上层清液，各管加pbs至30～40ml混匀，50～70
×
g离心1min，取上层清液待用做ficoll。
44.(4)取2支50ml离心管，各加入15ml ficoll液，倾斜30-45
°
，缓慢加入样本30ml，500
×
g，25min。
45.(5)离心管中分4层(自下至上：细胞层、ficoll层、白膜层及上层)，小心吸取白膜层于新的15ml离心管中，各离心管中加等量pbs，500
×
g 10min。
46.(6)去除红细胞：离心后沉淀存在较多红细胞，弹匀，加入红细胞裂解液1-2ml，重悬，放置4
°
冰箱8分钟，再加满pbs至满，500
×
g 6min(如无rbc，可不做)。
47.(7)移除上层清液，混匀，加rpmi至10ml，重悬，细胞计数。
48.2、cd8
+
t细胞的收集，用cd8
+
t细胞磁珠分选试剂盒操作：
49.(1)上述所得细胞离心，500
×
g 10min，去除上清液并小幅度弹匀细胞，加入80μl缓冲液(buffer)/107个细胞。
50.(2)加入cd8磁珠20μl/107个细胞，打匀放置4
°
冰箱15min。
51.(3)选择做与不做：加入10μl cd8-fitc染色抗体，4
°
冰箱避光孵育5min。
52.(4)加入1-2ml buffer/107细胞洗细胞，500
×
g 10min。
53.(5)弹匀，加入500μl buffer/108细胞。
54.(6)准备好磁板、磁块、分离柱以及2个15ml离心管：离心管中加入3ml buffer润洗分离柱，待流尽后加入重悬的细胞；流尽后加入3
×
3ml buffer润洗(分三次)；换另一个15ml离心管，将分离柱从磁板上取下，加入5ml buffer，用分离柱配件按压器迅速按压，得到cd8细胞(欲使cd8细胞更纯，可以用ms或者ls重复上述操作)
55.(7)离心，500
×
g 10min，弹匀，加入rpmi1640培养基至10ml，细胞计数。
56.cd8+t细胞培养、活化及计数。
57.(8)离心，500
×
g 10min，弹匀，加入合适的t细胞培养基(细胞密度为1
×
105个细胞/ml)，转移至24孔板培养。
58.(9)隔天半换液，吸弃0.5ml t细胞培养基后加入0.5ml t细胞新鲜培养基和cd3/28抗体。
59.实施例2：仙台病毒诱导t淋巴细胞重编程
60.转染：
61.(1)将24孔板中细胞吸到15ml离心管中，200
×
g离心10min，稀释细胞密度为1
×
106/ml，吸打混匀后取0.5ml t细胞培养基到圆底管中，培养箱中放置备用。
62.(2)将分装好的病毒液从-80℃中取出，将试管底部放置于37℃水浴5-10s，然后室温解冻后，短暂离心管，立即将其置于冰上，加入到0.5ml预热到37℃t细胞悬液中，慢慢枪头吸打混匀。在5min内完成下一步。以表达klf4
–
oct3/4
–
sox2、cmyc和klf4的仙台病毒感染细胞，各病毒的感染复数的比例是kos:c-myc：klf4＝5:5:3。
63.(3)各加0.5ml步骤(2)中含病毒培养基至步骤(1)中的圆底管中，此时2个圆底管中培养基都是1ml。用封口膜封住圆底管边缘，室温离心，1000
×
g，30min。离心完成后，向圆底管中再加入1ml t细胞培养基，重悬细胞，转移这2ml细胞悬液于非组织处理的12孔板中。
64.第1天：
65.(4)收获12孔板细胞到15ml离心管中，1ml t细胞培养基轻轻冲洗12孔板。200
×
g，10min，弃置病毒液，加入0.5ml t细胞完全培养基+0.5ml不含因子的stem-pro 34培养基，将细胞悬浮液转移至非组织处理的24孔板中一孔。在37℃，5％二氧化碳的湿空气中培养细胞2天。
66.第3天：
67.(5)提取准备用基质胶铺板6孔板。加入1ml不含因子的stem-pro 34培养基于24孔板中，轻轻打匀，取10μl计数，细胞稀释成2
×
105个/ml。后各2ml的不含因子的stem-pro 34培养基6孔板上。放置培养箱中培养。
68.第4-6天：
69.(6)第4天和6天分别用不含因子的stem-pro 34培养基给细胞半换液，动作轻柔(如果细胞没有贴壁，可以取出0.5ml细胞离心，再加入0.5ml完全培养基)。
70.第7天：
71.(7)mtesr培养基半换液。
72.第8-28天：
73.(8)24h后，每天全换mtesr培养基；从第8天起，隔天再显微镜下观察细胞克隆是否出现；转染后15天后：克隆会慢慢长大，合适时间挑克隆转移至铺有基质胶的6孔板上，得到t-ipsc。
74.实施例3：t-ipsc鉴定
75.1、碱性磷酸酶染色
76.t-ipsc种板于12孔板上，克隆合适大小时用pbs(0.01mol/l、ph7.4)洗3次，4％多聚甲醛室温下固定10min，pbs洗3次，0.1％ triton x-100室温下10min，加入配制好的alp
作用底物(4.5μl 50mg/ml硝基蓝四氮唑+3.5μl 50mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸+100mm nacl，100mm mgcl2)，室温下孵育5-10min，pbs洗3次，镜下观察。
77.2、免疫荧光染色
78.(1)用pbs洗涤细胞一次。加入4％聚甲醛溶液，室温静置30min。
79.(2)用pbs洗涤细胞三次。
80.(3)加入封闭液，室温静置20min。
81.(4)弃封闭液，加入一抗，4℃孵育过夜或室温孵育1h。
82.(5)用pbs洗涤细胞三次。
83.(6)加入二抗。如需染细胞核，则可在二抗稀释液中一起加入dapi，室温孵育1h。
84.(7)用pbs洗涤细胞三次。共聚焦显微镜下观察。
85.封闭液配方：1ml含1％ bsa 100μl、0.4％ triton-x100 40μl、4％山羊血清(goat serum)40μl、pbs 0.82ml。
86.一抗稀释液配方：1ml＝1％ bsa 100μl+0.4％ triton-x 100 40μl+1％ goat serum 10μl+pbs 0.85ml。
87.二抗稀释液配方：1ml＝1％ bsa100μl+0.02％ triton-x100 2μl+pbs 0.9ml。
88.3、qpcr步骤
89.(1)细胞培养和trizol裂解：细胞增长至指数生长期，生长密度大约75％-90％，细胞数量至少106个为宜。
90.粘附细胞：每10cm2培养皿面积，加入1ml 试剂。
91.悬浮细胞：每0.25ml样品加入0.75ml 试剂。
92.(2)trizol裂解
93.超净台紫外消毒30min；
94.贴壁细胞：pbs清洗3次；悬浮细胞：离心，弃上清；
95.加入适量trizol试剂，室温静置10min；
96.培养皿倾斜45
°
吹打培养皿使细胞脱落，收集细胞至无菌ep管中，记录时间、细胞类型，暂时不用则保存至-80℃冰箱。
97.(3)分离提纯：
98.预冷离心机，单个ep管中加入200μl氯仿/1ml trizol，剧烈震荡15s，室温静置3min(室温是为了保证反应充分，震荡及静置为分离的关键时刻)；
99.离心：4℃，12000g，15min；吸取上层透明液体至新无菌ep管中；
100.加入0.5ml异丙醇/1ml trizol，轻柔颠倒混匀，静置10min；
101.离心：4℃，12000g，10min，此时可见ep管底部白色沉淀，即为rna；
102.弃上清，加入1ml 75％乙醇/1ml trizol，轻轻震荡洗涤；
103.离心：4℃，12000g，5min；弃上清，将ep管倒置再纸上以吸去残余液体，自然晾干至白色沉淀干透后变为透明；加入适量depc水溶解，4℃，静置1h以上。
104.(4)测纯度及浓度
105.充分溶解后，从4℃取出，旋转下降(spin down)，充分吹打均匀(溶解不完全时会在ep管底部形成粘稠液体，沾挂枪头)，吸取5μl左右测浓度。
106.nanodrop测浓度：用双蒸水洗3遍；吸取2μl双蒸水调零；吸取2μl相应样品测量浓
度，记录浓度数值x(1ng/μl)以及260/280数值(最好保持在2左右，表明其纯度较高)；测量完毕，双蒸水洗3遍；
107.(5)逆转录得cdna：计算出1μg rna的体积(1000/x)μl；配制20μl逆转录体系，因试剂不同有所差别，具体参照试剂说明书；spin down 10s；pcr仪上机；完成后-20℃或-80℃长久保存(一年左右有效)。
108.(6)上样及上机：
109.以sybr试剂说明书为准，以10μl体系为例：
110.配制稀释引物(引物浓度一般应在300nmol/l～800nmol/l之间，举例若以每孔4μl稀释引物上样，可配制2μl上游引物+2μl下游引物+96μl双蒸水，得100μl稀释引物，终体系中引物浓度为800nm)，稀释cdna(逆转录得到的每管20μl的cdna浓度很高，带有黏性不适合上样，可适当稀释后用于实验，建议稀释3倍或以上)画好上样表格，每个组合至少3个复孔，新手可做4个或更多复孔以保证数据有效，gapdh等内参应当酌情增加复孔。添加引物(4μl)，添加样品(1μl)，避光，添加sybr 5μl；检查是否有挂壁及气泡，确认无气泡后贴膜，锡箔纸包裹避光；低速甩板，上机前可4℃冰箱短时间静置(5～10min)以使体系混合稳定。
111.实施例4：t-ipsc再分化
112.1、准备op9/dll1细胞与t-ipsc共培养：
113.(1)10cm培养皿培养op9/dll1细胞，加入op9/dll1细胞培养基(80％dmem+20％胎牛血清+1
×
青霉素-链霉素]10ml，待细胞达到融合后，抽吸培养液，用5ml pbs缓冲液冲洗一次。
114.(2)抽吸pbs，加入0.05％胰蛋白酶-edta2ml。37℃孵育5min，加入4ml op9培养基，机械分离细胞层，制成单细胞悬液。
115.(3)将细胞悬液转移到50ml锥形管中，以避免细胞结块。在4℃下300
×
g离心5min，抽吸上清液，悬浮在12ml op9培养基中。
116.(4)准备1个基质胶铺板的6孔板，加入2ml上述含op9/dll1的细胞培养基。37℃培养箱培养3天至合适密度。
117.(5)用丝裂霉素预处理6孔板op9/dll1细胞，pbs洗3遍，加入2mlop9/dll1的细胞培养基待用。
118.2、t-ipsc克隆获得：
119.(1)当t-ipsc细胞克隆直径在0.8-1.2mm之间时，在立体显微镜中检查t-ipsc克隆，并使用200μl针尖的塑料边缘去除培养液中的任何分化区域。
120.(2)抽吸废培养液，加入适量的解离液，37℃孵育1min。
121.(3)加入2ml mtesr，机械冲击细胞克隆，切记尽量保护好细胞克隆大小。
122.(4)将获得的t-ipsc克隆转移至上述含op9/dll1细胞饲养层的6孔板，加入2ml mtesr，37℃培养箱培养1天。
123.3、体外诱导分化为cd8
+
t细胞：
124.(1)6孔板内t-ipsc克隆贴壁后加入1ml mtesr和1ml op9培养基，观察t-ipsc克隆的生长情况。
125.(2)6孔板内t-ipsc克隆慢慢扩大到合适大小，停止加入mtesr培养基，加入含有vegf、scf、flt-3l的op9培养基。
126.(3)t-ipsc克隆长大成立体团块克隆大小后，逐渐改用t细胞培养基。t细胞培养基内含有flt-3l和il-7，继续诱导分化25天，使其重分化为cd3
+
t淋巴系细胞。
127.(4)进一步，将上述获得cd3
+
t淋巴细胞在原op9-dl1滋养层细胞上培养并加入cd3/cd28单抗刺激1d，然后将经丝裂霉素处理的pbmcs和细胞因子il-7、il-15加入继续培养14d，最后获得cd8
+
t细胞。
128.实验结果如下：
129.(1)癌旁、肿瘤组织cd8
+
t细胞数量比较(相同体积组织得到的cd8
+
t细胞)：
130.我们收集了原发性肝癌患者术后标本，经组织研磨、提取和细胞分选后检测cd8
+
t细胞数量，结果显示肝癌患者癌旁组织cd8
+
t细胞数量高于肿瘤组织中cd8+t细胞数量，差异具有统计学意义，p＝0.003(图1)。
131.(2)cd3/28抗体联合il-2、il-7、il-15刺激肿瘤、癌旁组织cd8
+
t细胞数量变化
132.为进一步检测肝癌患者癌旁组织cd8
+
t细胞与肿瘤组织中cd8
+
t细胞的增殖能力，我们在细胞基础培养基中添加il-2、il-7、il-15与cd3/28抗体刺激细胞增殖，结果显示癌旁组织cd8
+
t细胞增殖比例大于肿瘤组织cd8
+
t细胞增殖比例，差异具有统计学意义，p《0.05(图2)。
133.(3)癌旁组织cd8
+
t细胞重编程过程及结果
134.肿瘤组织及癌旁组织cd8
+
t细胞均具有肿瘤抗原决定簇，且上述实验结果显示癌旁组织cd8+t细胞数量更多，活性更强，为提高重编程效率，我们利用仙台病毒重编程hcc癌旁组织cd8
+
t细胞为ipsc，因此我们首先加入il-2、il-7、il-15与cd3/28抗体刺激癌旁组织cd8
+
t细胞使其活化，后运用仙台病毒试剂盒将其重编程，结果显示饲养层重编程和无饲养层重编程均能成功将活化的cd8+t细胞重编程为t-ipsc(图3)。
135.(4)获得的t-ipsc克隆观察与鉴定
136.获得的t-ipsc克隆在显微镜下观察，并对其进行碱性磷酸酶染色，结果显示阳性；12孔板tipsc进行干细胞标志nanog、oct 4、tra 1-81及ssea4免疫荧光染色，结果显示tipsc表达干细胞标志物(图4)。
137.(5)t-ipsc的传代与培养
138.t-ipsc培养周期一般为5-7天，待克隆占培养皿75％-90％时，消化克隆并传代(图5)。
139.(6)t-ipsc向cd8
+
t细胞的初步分化
140.t-ipsc在分化培养基和op9-dl1的饲养层培养条件下，经历双阴性阶段、双阳性阶段、单阳性细胞阶段成功分化为cd8
+
t细胞；获得cd8
+
t细胞用cd3/28刺激增殖后结果显示增值效果明显，与健康外周血cd8
+
t细胞相比差异无统计学意义，而与癌旁cd8
+
t细胞相比差异有统计学意义，p《0.05(图6)。
141.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种通过细胞重编程及再分化获得的肿瘤特异性杀伤性t细胞的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)培养肝癌组织浸润t细胞，再以表达oct4、sox2、c-myc和klf4四种转录因子的仙台病毒感染细胞；(2)转染后第2天，用培养基a培养2天；培养基a为t细胞完全培养基和不含因子的stem-pro 34培养基按体积比1：1混合得到的培养基；(3)将步骤(2)培养得到的细胞转移到基质胶铺板的培养板中用重编程诱导培养液培养；此后每隔1～2天更换为重编程诱导培养液，并在37℃、5％co2的条件下培养，直至出现诱导多能干细胞克隆；(4)出现诱导多能干细胞克隆后更换为mtesr培养基，于35～39℃和3～7％co2的条件下继续培养，培养期间每隔1～2天更换干细胞培养基；(5)待充分重编程后，挑取单克隆，继续扩大培养并筛选，经ap染色为阳性，且表达多能性蛋白nanog、ssea-4、tra-1-60与tra-1-81的细胞即为目的t-ipsc；(6)t-ipsc与op9/dl1细胞共培养分化为肿瘤特异性杀伤性t细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的肝癌组织浸润t细胞为人肝癌组织浸润t细胞。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的肝癌组织浸润t细胞为cd8
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t细胞；步骤(1)中所述的肝癌组织浸润t细胞通过如下步骤制备得到：获取肝癌组织，提取浸润的t淋巴细胞，磁珠分选富集ctl；步骤(1)中所述的培养的时间为48h。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的以表达oct4、sox2、c-myc和klf4四种转录因子的仙台病毒感染细胞的具体步骤如下：以表达klf4、oct4、sox2的kos仙台病毒，表达c-myc和表达klf4的仙台病毒感染细胞，各病毒的感染复数的比例是kos:c-myc：klf4＝5:5:3。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的重编程诱导培养液为不含因子的stem-pro 34培养基。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(6)所述的共培养分化的步骤如下：1)将t-ipsc细胞克隆置于op9/dll1细胞饲养层上用mtesr培养基培养；2)待t-ipsc细胞克隆贴壁后用培养液b培养；培养液b为mtesr培养基和op9培养基按体积比1：1配比得到；3)当t-ipsc细胞克隆扩大到所需大小，停止加入mtesr培养基，加入含有vegf、scf、flt-3l的op9培养基；4)t-ipsc克隆长大成立体团块克隆大小后，逐渐改用t细胞培养基；t细胞培养基内含有flt-3l和il-7，继续诱导分化，使其重分化为cd3
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t淋巴系细胞；5)接着加入cd3/cd28单抗刺激，然后加入丝裂霉素处理的pbmcs和细胞因子il-7、il-15继续培养，得到cd8
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t细胞。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
步骤4)中所述的继续诱导分化的时间为25天。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤5)中所述的继续培养的时间为15天。9.一种通过细胞重编程及再分化获得的肿瘤特异性杀伤性t细胞，其特征在于：通过权利要求1～8任一项所述的方法制备得到。10.权利要求9所述的通过细胞重编程及再分化获得的肿瘤特异性杀伤性t细胞在制备抗肿瘤制剂中的应用。

技术总结
本发明公开了一种通过细胞重编程及再分化获得的肿瘤特异性杀伤性T细胞及方法。该方法包括：提取肝癌组织浸润的T细胞，将表达Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4四种转录因子的仙台病毒载体导入T细胞后进行重编程得到T-iPSC，并做功能鉴定，最后T-iPSC在体外再分化为年轻化的T细胞。采用本发明提供的方法能够将免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞的免疫功能恢复。能受损的浸润性T淋巴细胞的免疫功能恢复。能受损的浸润性T淋巴细胞的免疫功能恢复。


技术研发人员：胡安斌 杨道朋 凌象超
受保护的技术使用者：中山大学附属第一医院
技术研发日：2023.03.06
技术公布日：2023/7/31