对金黄色葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌有抑菌活性的表皮葡萄球菌发酵液的制备方法

1.本发明涉及一种对金黄色葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌有抑菌活性的表皮葡萄球菌发酵液的制备方法，属于发酵技术领域。


背景技术：

2.金黄色葡萄球菌是一种常见的食源性致病菌，广泛存在于自然环境中，威胁人类的正常生活。随着菌株的传代和分化，逐渐对传统药物产生了耐药性，甚至分化出了耐抗生素的菌株。对金黄色葡萄球菌的抑制有了新的挑战。痤疮丙酸杆菌，是引起痤疮的主要病源菌。痤疮是一种慢性皮肤炎性疾病且具有极高发病率，在12～24岁的不同人种的青少年间其病发率可高达85％，多见发于面部、胸背部等皮脂多分泌的皮肤区域。对青少年的心理造成了很大的困扰和负面的影响。长期使用抗生素或激素类药物治疗痤疮，易出现细菌耐药、药物依赖等不良后果。发酵是一种利用培养基进行菌体及其代谢产物积累的技术。之前的研究大多数集中于肠道微生物的发酵。对于皮肤天然存在的“第一道防线”—皮肤微生物的研究较少。皮肤微生物长期定殖于皮肤表面，对皮肤无外加伤害和刺激。人体是一个大型的微生物聚集器，为各种微生物提高了丰富且多样的生态环境，其中葡萄球菌占总菌体16.8％，表皮葡萄球菌是人体表面分布最广的共生菌，占体表葡萄球菌的65％-90％。表皮葡萄球菌属于革兰氏阳性菌，凝血酶阴性菌，不产生α溶血素等毒性物质，是一种非致病性葡萄球菌。但是大多数研究都是基于菌与菌之间的相互作用，而非有益微生物发酵液的活性研究，对皮肤微有益生物表皮葡萄球菌发酵液，在抑菌活性方面的研究未见过报道。


技术实现要素：

3.为解决上述技术问题，本发明对皮肤微生物表皮葡萄球菌进行发酵调控，以制备具有抑菌活性的表皮葡萄球菌发酵液，通过实验发现，添加两种不同的碳源葡萄糖和甘油后，表皮葡萄球菌的发酵液对金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌表现出明显的抑菌活性。
4.本发明的第一个目的是提供一种对金黄色葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌有抑菌活性的表皮葡萄球菌发酵液的制备方法，所述方法是采用含有甘油或葡萄糖的发酵培养基发酵表皮葡萄球菌，获得所述表皮葡萄球菌发酵液。
5.本发明中所使用的表皮葡萄球菌是通过在bncc(www.bncc.com)上购买得到，编号为bncc330867。
6.进一步地，所述发酵培养基包括：牛肉膏2.0～6.0g/l，蛋白胨12.0～18.0g/l，氯化钠3.0～5.0g/l，甘油或葡萄糖10.0～50.0g/l。
7.进一步地，所述发酵培养基的ph为4.0～9.0。
8.进一步地，所述发酵的温度为25～38℃。
9.进一步地，所述发酵的时间为24～72h。
10.进一步地，所述发酵是按照体积百分比为2％～10％的接种量，接种表皮葡萄球
菌。
11.进一步地，在发酵后，通过离心、抽滤以及过滤，获得所述发酵液。
12.进一步地，所述过滤是采用0.22μm的滤膜进行过滤。
13.本发明的第二个目的是提供所述方法制备得到的对金黄色葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌具有抑制活性的表皮葡萄球菌发酵液。
14.本发明的有益效果是：
15.本发明对皮肤微生物表皮葡萄球菌进行发酵调控，以制备具有抑菌活性的表皮葡萄球菌发酵液，通过实验发现，添加两种不同的碳源葡萄糖和甘油后，表皮葡萄球菌的发酵液对金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌表现出明显的抑菌活性。
附图说明
16.图1为不同甘油添加量对金黄色葡萄球菌的抑菌效果；
17.图2为不同葡萄糖添加量对金黄色葡萄球菌的抑菌效果；
18.图3为不同发酵液对痤疮丙酸杆菌抑菌作用。
具体实施方式
19.下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
20.所用到的仪器有：
[0021][0022]
发酵液培养条件：
[0023]
原培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨15.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1.0l，ph7.0；
[0024]
不同ph培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨15.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1.0l，ph5.5/7.0/9.0；
[0025]
不同无机盐培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨15.0g，氯化钠/镁/钾5.0g，蒸馏水1.0l，ph7.0；
[0026]
不同碳源培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨15.0g，氯化钠5.0g，甘油/葡萄糖20.0g，蒸馏水1.0l，ph7.0；
[0027]
蒸馏水1.0l，121℃，15min灭菌。
[0028]
实施例1：具有抑制金黄色葡萄球菌的表皮葡萄球菌发酵液的筛选
[0029]
在表皮葡萄球菌原培养条件下，通过改变不同ph值、不同培养时间、不同无机盐种类、不同碳源，制备一系列发酵液，按照接菌量为5％接入表皮葡萄球菌种子液，在37℃发酵24h、48h、72h(在其他条件改变时，发酵时间设定为48h)，离心抽滤，过0.22μm的滤膜，制得
表皮葡萄球菌发酵液，并对金黄色葡萄球菌的抑制活性进行探究，实验结果表明：通过添加碳源甘油和葡萄糖后，表皮葡萄球菌发酵液具有明显的抑菌效果。阳性对照采用了抗生素四环0.85mg/ml做对比，结果如下：
[0030]
表1不同发酵条件获得的发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径测定
[0031][0032]
实施例2：甘油和葡萄糖加入量对金黄色葡萄球菌抑菌效果的影响
[0033]
实验方法：
[0034]
取生长到对数生长期的金黄色葡萄球菌菌液与含琼脂的培养基混合，倒板，采用直径6mm的打孔器在琼脂板上打孔，滴加100μl发酵液，置于37℃培养箱静置培养24h，记录抑菌圈的直径大小。实验结果如图1～2所示。
[0035]
图1为不同甘油添加量的表皮葡萄球菌发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，随着甘油添加量的增加，gly sfb对金黄色葡萄球菌的抑制效果明显增强；当添加量至2％之后，抑制效果增加不明显。
[0036]
图2为不同葡萄糖添加量的表皮葡萄球菌发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，随着葡萄糖添加量的增加，glu sfb对金黄色葡萄球菌的抑制效果明显增强；当添加至2％之后，抑制效果增加不明显。
[0037]
实施例3：表皮葡萄球菌发酵液对痤疮丙酸杆菌的抑制作用
[0038]
实验方法：
[0039]
将对数生长期的痤疮丙酸杆菌，取1ml离心，去上清液，无菌pbs洗涤3次，分别用原培养基、表皮葡萄球菌发酵液(sfb)、表皮葡萄球菌甘油发酵液(gly sfb)、表皮葡萄球菌葡萄糖发酵液(glu sfb)重悬痤疮丙酸杆菌菌液，依次用无菌水稀释到10-4
，取100μl涂板，37℃培养箱静置培养，24h后，记录菌体数目；每个样品重复3次。结果如图3所示，结果表明：sfb、gly sfb和glu sfb对比原培养基，对痤疮丙酸杆菌均具有一定的抑菌效果；对痤疮丙酸杆菌抑菌效果从大到小的排序为：glu sfb＞gly sfb＞sfb。
[0040]
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明
的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

技术特征：
1.一种对金黄色葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌有抑菌活性的表皮葡萄球菌发酵液的制备方法，其特征在于，所述方法是采用含有甘油或葡萄糖的发酵培养基发酵表皮葡萄球菌，获得所述表皮葡萄球菌发酵液。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基包括：牛肉膏2.0～6.0g/l，蛋白胨12.0～18.0g/l，氯化钠3.0～5.0g/l，甘油10.0～50.0g/l。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基包括：牛肉膏2.0～6.0g/l，蛋白胨12.0～18.0g/l，氯化钠3.0～5.0g/l，葡萄糖10.0～50.0g/l。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基的ph为4.0～9.0。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵的温度为25～38℃。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵的时间为24～72h。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵是按照体积百分比为2％～10％的接种量，接种表皮葡萄球菌。8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在发酵后，通过离心、抽滤以及过滤，获得所述发酵液。9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述过滤是采用0.22μm的滤膜进行过滤。10.一种权利要求1～9任一项所述方法制备得到的对抑制金黄色葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌具有抑菌活性的表皮葡萄球菌发酵液。

技术总结
本发明公开了一种对金黄色葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌有抑菌活性的表皮葡萄球菌发酵液的制备方法，本发明对皮肤微生物表皮葡萄球菌进行发酵调控，以制备具有抑菌活性的表皮葡萄球菌发酵液，通过实验发现，添加两种不同的碳源葡萄糖和甘油后，表皮葡萄球菌的发酵液对金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌表现出明显的抑菌活性。活性。活性。


技术研发人员：曹玉华 耿文琳 刘光伟
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2023.03.01
技术公布日：2023/7/31