一种假尿苷工程菌及其应用、生产假尿苷的方法

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种假尿苷工程菌及其应用、生产假尿苷的方法。


背景技术：

2.假尿嘧啶核苷简称假尿苷(pseudouridine，ψ)。与尿苷相比，假尿苷的碱基与核糖之间不是通过n-c键而是c-c键相连。是核糖与尿嘧啶(uracil，u)通过c1
’‑
c5相连后成为尿苷的异构体。是生物体内广泛存在的一种rna修饰方式，因此它也被称为“第五个碱基”。假尿苷的结构式如图1。
3.研究发现，假尿苷广泛存在与trna,rrna，mrna，snrna和snorna中，增强rna的稳定性和提高蛋白质的翻译效率。假尿苷具有仅从肾脏排泄的特点，可用于监测肿瘤的发生、发展及肾病的诊治。随着对假尿苷研究的深入，研究者还发现痛风、银屑病患者尿液假尿苷水平明显升高。因此，假尿苷可作为一个潜在的生物标志物，用于肾病与肿瘤等多种疾病的诊断、疗效监测。近年来核酸药物开发中发现，假尿苷替代尿苷后，能提高抗原表达水平以及增强免疫反应。因此，假尿苷的潜在需求越来越大，其生产方法也引起广泛关注。
4.目前假尿苷有以下几种生产方法。一种是化学合成法。化学合成法反应步骤多，收率低，同时还面临生产安全、环保压力。2021年美国科学家提出了半酶法合成方法，但是总体收率仍然有待提高，而且生产起始原料相对比较昂贵。专利cn112592880b利用大肠杆菌发酵生产假尿苷，但是产量还不够高。专利cn112592880b公布了一项链霉菌发酵的方法生产假尿苷，但是产量低，而且链霉菌生长缓慢，还不能实现商业化生产。
5.针对假尿苷生产存在的问题，本发明通过构建高产假尿苷的大肠杆菌基因工程菌，实现假尿苷绿色经济的生产方法。


技术实现要素：

6.为了解决上述问题，本发明提供了一种产假尿苷工程菌：
7.一种产假尿苷工程菌，利用基因工程技术在宿主菌中敲除嘧啶生物合成途径相关的基因且过量表达假尿嘧啶核苷合成相关的基因，得到可产假尿苷的基因工程菌。
8.优选的，敲除的所述嘧啶生物合成途径相关的基因为：pepa、thra和argf基因；所述pepa基因序列是seq id no1，thra基因序列是seq id no8，argf的基因序列是seq id no15。
9.优选的，过量表达的所述假尿嘧啶核苷合成相关的基因是udp、psug、磷酸酶基因，所述udp基因的蛋白序列为seq id no55；所述psug基因的蛋白序列为seq id no56、seq id no57、seq id no58或者seq id no59；所述磷酸酶基因的蛋白序列为seq id no54、seq id no60、seq id no61、seq id no62或者seq id no63。
10.优选的，利用基因工程技术在宿主菌中敲除了假尿嘧啶核苷激酶基因psuk，基因序列是seq id no22。
11.优选的，利用基因工程技术在宿主菌中敲除了基因psut，基因序列是seq id no29。
12.一种产假尿嘧啶核苷的基因工程菌在产假尿苷中的应用。
13.一种生产假尿苷的方法，挑取上述一种假尿嘧啶核苷的基因工程菌的单菌落接种于装有lb培养液的试管，其中加入终浓度为50μg/ml的硫酸卡那霉素，30℃，220rpm培养过夜，然后按1％的接种量接种到装有20ml发酵液的摇瓶，37℃，220rpm培养四个小时后，加入iptg终浓度至50μg/ml,然后摇瓶放置30℃，220rpm发酵培养，从而生产假尿苷。
14.优选的，所述lb培养液的组成是：酵母抽屉粉0.5％，胰蛋白胨1.0％，氯化钠1.0％。发酵培养基组成是：胰蛋白胨1.0％,酵母抽提0.5％,甘油2.0％，硫酸锰0.1mm，kh2po
4 0.231％，k2hpo41.254％，ph 7.0。
15.另一种生产假尿苷的方法，挑取上述一种假尿嘧啶核苷的基因工程菌的单菌落接入种子培养基中，36℃，250rpm培养15h得到种子液，再按照10％的接种量，吸取1单位体积的种子液至发酵培养基中，接种后培养基总体积为10单位体积，所述发酵培养的培养基配方(g/l)如下：葡萄糖15，kh2po44，酵母粉6；硫酸铵8，mgso4·
7h2o 4；培养基中其他组分(mg/l)：feso4·
7h2o 150，mnso4·
7h2o 20，氯化钴3.5，硫酸锌3.5，氯化钙8，另外培养基中加入卡纳霉素50mg/l。
16.优选的，发酵过程中，培养基ph用含氨13mol/l的氨水调控在7.0，发酵温度在0-3h保持在37℃，发酵第3h加入iptg终浓度至50μg/ml，同时发酵温度调整到30℃，流加葡萄糖保持终浓度0.1％左右，发酵过程中通气设定为1.0vvm，通过搅拌转速和溶氧联动，控制溶氧在30％-40％，发酵周期72h。
17.原理说明：
18.1、改造嘧啶生物合成途径
19.天冬氨酸和carbamoyl-p是生物合成嘧啶的前体，同时它们分别由thra和argf合成4-磷酸天冬氨酸和瓜氨酸。因此敲除thra和argf能提高合成嘧啶的代谢流，提高合成假尿苷的前体尿嘧啶的产量。在嘧啶生物合成过程中，基因carab受到pepa的负调控，受嘧啶反馈抑制。因此对pepa进行敲除能解除嘧啶的反馈抑制。对嘧啶生物合成的最后一步的udp基因过量表达，提高尿嘧啶合成效率，减少尿苷的积累。
20.2、以尿嘧啶和5-磷酸核糖为底物催化合成假尿苷(ψ)
21.在原核生物中普遍存在ψmp糖苷酶基因(psug)，能够以催化尿嘧啶和5-磷酸核糖合成ψmp。一部分真核生物中也存在ψmp糖苷酶活性的基因，但是一种双功能基因，其往往还具有ψmp激酶活性。在大肠杆菌中过量表达psug和磷酸化酶基因，能最终产生假尿苷。
22.3、阻断假尿苷的代谢降解途径
23.psug具有双向催化活性，它不但能催化合成假尿苷单磷酸，同时还能催化假尿苷单磷酸分解为5-磷酸核糖和尿嘧啶。而psuk具有假尿苷激酶活性，能使假尿苷磷酸化，然后在psug的催化下降解。因此敲除psuk由利于减少假尿苷的降解。
24.4、阻断假尿苷转运到胞内
25.psut具有假尿苷转运功能，能吸收胞外的假尿苷。敲除psut由利于假尿苷在胞外累。
26.有益效果：相较于现有的假尿苷生产方法，首先，现有的菌种发酵方法产量为7g/
l，而本方案产量可以高达11.6g/l，显著提高了产量，降低了成本；其次，其他原有的生产方法一般以采用化学合成为主，化学合成方法对温度控制要求高，化学步骤药剂多，且药剂危险性较高，污染性大，而本方案直接采用发酵罐发酵，发酵步骤简单，易于大规模生产；最后，本方案采用的原料没有对环境有害的化学物质，对环境压力小，有利于环保。
附图说明
27.图1为假尿苷的结构式图。
具体实施方式
28.现有的微生物按照本发明均能够实现对假尿苷的生产，如大肠杆菌、芽孢杆菌等，申请人对各类菌种均做了相应详细研究，由于大肠杆菌应用度较高，以下各实施例以大肠杆菌菌种为例，具体是escherichia coli mg1665。
29.实施例1在大肠杆菌中敲除pepa
30.基因敲除采用文献(yu jiang，multigene editing inthe escherichia coli genome viathe crispr-cas9 system，appl environmicrobiol.2015，81(7):2506-14)的方法。pepa的基因序列见seq id no1。引物pepf1,pepr1扩增上游同源片段；pepf2,pepr2扩增下游同源片段；以上下游同源片段为模板，引物pepf1,pepr2扩增出用于基因敲除的上下游融合的同源片段。得到的敲除菌株编号δpepa。
31.引物pep20f,pep20r扩增grna质粒。引物的序列分别是：
32.seq id no2：pepf1:cac gaagtcatcgcaaca
33.seq id no3：pepr1:agttgttcctgatactcgtgacgcactttccagtag
34.seq id no4：pepf2:ctactggaaagtgcgtcacgagtatcaggaacaact
35.seq id no5：pepr2:cttcacaggcgatgagca
36.seq id no6：pep20f:gagatgaagtacgatatgtggttttagagctagaaatagc
37.seq id no7：pep20r:cacatatcgtacttcatctcactagtattatacctaggac
38.实施例2在大肠杆菌中敲除thra
39.基因敲除采用文献(yu jiang，multigene editing inthe escherichia coli genome viathe crispr-cas9 system，appl environmicrobiol.2015，81(7):2506-14)的方法。thra的基因序列见seq id no8。引物thrf1,thrr1扩增上游同源片段；thrf2,thrr2扩增下游同源片段；以上下游同源片段为模板，引物thrf1,thrr2扩增出用于基因敲除的上下游融合的同源片段。在δpepa菌株的基础上敲除thra后的菌株编号δpepaδthra。引物thr20f,thr20r扩增grna质粒。引物的序列分别是：
40.seq id no9：thrf1:gttcggcggtacatcagt
41.seq id no10：thrr1:ttgctgacgcttcagttgcaatatcgacggtagatt
42.seq id no11：thrf2:aatctaccgtcgatattgcaactgaagcgtcagcaa
43.seq id no12：thrr2:ctcatgccttcgtctaac
44.seq id no13：thr20f:ggaacggctggccattatctgttttagagctagaaatagc
45.seq id no14：thr20r:agataatggccagccgttccactagtattatacctaggac
46.实施例3在大肠杆菌中敲除argf
47.基因敲除采用文献(yu jiang，multigene editing in the escherichia coli genome viathe crispr-cas9 system，appl environ microbiol.2015，81(7):2506-14)的方法。argf的基因序列见seq id no15。引物argf1,argr1扩增上游同源片段；argf2,argr2扩增下游同源片段；以上下游同源片段为模板，引物argf1,argr2扩增出用于基因敲除的上下游融合的同源片段。在δpepaδthra菌株的基础上敲除argf后的菌株编号δpepaδthraδargf。引物arg20f,arg20r扩增grna质粒。引物的序列分别是：
48.seq id no16：argf1:gtggagcagcatgacaaag
49.seq id no17：argr1:gtcggtatagataaagtcagcagagaagtgaactgt
50.seq id no18：argf2:acagttcacttctctgctgactttatctataccgac
51.seq id no19：argr2:gaggatctgcaacgcacg
52.seq id no20：arg20f:tatgacggcattcagtatcggttttagagctagaaatagc
53.seq id no21：arg20r:cgatactgaatgccgtcataactagtattatacctaggac
54.实施例4在大肠杆菌中敲除psuk
55.基因敲除采用文献(yu jiang，multigene editing in the escherichia coli genome viathe crispr-cas9 system，appl environ microbiol.2015，81(7):2506-14)的方法。psuk的基因序列见seq id no22。引物psuf1,psur1扩增上游同源片段；psuf2,psur2扩增下游同源片段；以上下游同源片段为模板，引物psuf1,psur2扩增出用于基因敲除的上下游融合的同源片段。在δpepaδthraδargf菌株的基础上敲除psuk后的菌株编号δpepaδthraδargfδpsuk。引物psu20f,psu20r扩增grna质粒。引物的序列分别是：
56.seq id no23：psuf1:gcctgctcaaatctgcccat
57.seq id no24：psur1:acgttggcaatcgataaaatcgacataaacgccaga
58.seq id no25：psuf2:tctggcgtttatgtcgattttatcgattgccaacgt
59.seq id no26：psur2:gcgatgcacaccaccaat
60.seq id no27：psu20f:accaatgttattaatgttacgttttagagctagaaatagc
61.seq id no28：psu20r:gtaacattaataacattggtactagtattatacctaggac
62.实施例5在大肠杆菌中敲除psut
63.基因敲除采用文献(yu jiang，multigene editing in the escherichia coli genome viathe crispr-cas9 system，appl environ microbiol.2015，81(7):2506-14)的方法。psut的基因序列见seq id no29。引物psutf1,psutr1扩增上游同源片段；psutf2,psutr2扩增下游同源片段；以上下游同源片段为模板，引物psutf1,psutr2扩增出用于基因敲除的上下游融合的同源片段。在δpepaδthraδargfδpsuk菌株的基础上敲除psut后的菌株编号δpepaδthraδargfδpsukδpsut。引物psut20f,psut20r扩增grna质粒。引物的序列分别是：
64.seq id no30：psutf1:gaaattgcccgtgcaatg
65.seq id no31：psutr1:tcatcatcgaaccagcaatgggaagtagagcatgat
66.seq id no32：psutf2:atcatgctctacttcccattgctggttcgatgatga
67.seq id no33：psutr2:ctcaggtaagcgacgaat
68.seq id no34：psut20f:gtgatgtcttacagtgatgcgttttagagctagaaatagc
69.seq id no35：psut20r:gcatcactgtaagacatcacactagtattatacctaggac
70.实施例6在大肠杆菌中过量表达phoa
71.用引物phoaf，phoar扩增phoa基因(基因序列见seq id no36，蛋白序列见seq id no54)，电泳后用上海生工胶回收试剂盒回收。回收片段用ndei和bglii双酶切，然后克隆到pet-30a(+)的ndei和bglii酶切位点上。克隆的质粒命名为pet30phoa。引物序列如下：
72.seq id no37：phoaf:atccatatgaaacaaagcactattg
73.seq id no38：phoar:acaagatct ttttatttcagccccaga
74.实施例7在大肠杆菌中同时过量表达phoa和udp
75.用引物udpf，udpr扩增udp基因(基因序列见seq id no39，蛋白序列见seq id no55)，电泳后用上海生工胶回收试剂盒回收。回收片段用bglii和hindiii双酶切，然后克隆到pet30phoa的hindiii和bglii酶切位点上。克隆的质粒命名为pet30phoaudp。引物序列如下：
76.seq id no40：udpf:acaagatctaaaggaggatatacatatgtccaagtctgatgtt
77.seq id no41：udpr:agaaagcttgaagagaattacagcaga
78.实施例8在大肠杆菌中过量表达psug
79.用引物psugf，psugr扩增大肠杆菌来源的psug基因(基因序列见seq id no42，蛋白序列见seq id no56)，电泳后用上海生工胶回收试剂盒回收。回收片段用ndei和bglii双酶切，然后克隆到pet-30a(+)的ndei和bglii酶切位点上。克隆的质粒命名为pet30psug。引物序列如下：
80.seq id no43 psugf:gtgcatatgtctgaattaaaaatttc
81.seq id no44 psugr:ataagatctctgcccgtcagaaattaa
82.实施例9在大肠杆菌中过量表达psug
83.来源于klebsiella spallanzanii的psug基因(基因序列见seq id no45，蛋白序列见seq id no57)，由南京金斯瑞生物科技公司合成并克隆到pet-30a(+)的ndei和bglii酶切位点上。克隆的质粒命名为pet30psug45。
84.实施例10在大肠杆菌中过量表达psug
85.来源于streptomycesplatensis的psug基因(基因序列见seq id no46，蛋白序列见seq id no58)，由南京金斯瑞生物科技公司合成并克隆到pet-30a(+)的ndei和bglii酶切位点上。克隆的质粒命名为pet30psug46。
86.实施例11在大肠杆菌中过量表达psug
87.来源于rhizobium sp.cf142的psug基因(基因序列见seq id no47，蛋白序列见seq id no59)，由南京金斯瑞生物科技公司合成并克隆到pet-30a(+)的ndei和bglii酶切位点上。克隆的质粒命名为pet30psug47。
88.实施例12在大肠杆菌中同时过量表达phoa、udp、psug
89.以pet30phoaudp为模板，用引物phoaf4，udpr2扩增phoaudp基因，电泳后用上海生工胶回收试剂盒回收。pet30psug用ecorv和xhoi双酶切，电泳后用试剂盒回收。以上两个回收片段用生物科技有限公司的质粒克隆重组试剂盒进行重组克隆。重组质粒命名为pet30psugphoaudp，然后分别转化到大肠杆菌mg1665、实施例3中的菌株δpepaδthraδarg、实施例4中的菌株δpepaδthraδargaδpsuk和实施例5中的菌株δpepaδthraδargaδpsukδpsut，转化后的菌株编号分别为：mg1665-pet30psugphoaudp、δpepaδthra
δarg-pet30psugphoaudp、δpepaδthraδargaδpsuk-pet30psugphoaudp、δpepaδthraδargaδpsukδpsut-pet30psugphoaudp。引物序列如下：
90.seq id no48 phoaf4:tgaagatctgggtacttttgtttaactttaaga
91.seq id no49 udpr2:cagccggatctcagtgaagagaattacagcaga
92.实施例13在大肠杆菌中过量表达pumd
93.pumd基因(基因序列见seq id no50，蛋白序列见seq id no60)，由南京金斯瑞生物科技公司合成并克隆到pet-30a(+)的ndei和bglii酶切位点上。克隆的质粒命名为pet30pumd。
94.实施例14在大肠杆菌中过量表达phm8
95.phm8基因(基因序列见seq id no51，蛋白序列见seq id no61)，由南京金斯瑞生物科技公司合成并克隆到pet-30a(+)的ndei和bglii酶切位点上。克隆的质粒命名为pet30phm8。
96.实施例15在大肠杆菌中过量表达sdt1
97.sdt1基因(基因序列见seq id no52，蛋白序列见seq id no62)，由南京金斯瑞生物科技公司合成并克隆到pet-30a(+)的ndei和bglii酶切位点上。克隆的质粒命名为pet30sdt1。
98.实施例16在大肠杆菌中过量表达ykl033w-a
99.ykl033w-a基因(基因序列见seq id no53，蛋白序列见seq id no63)，由南京金斯瑞生物科技公司合成并克隆到pet-30a(+)的ndei和bglii酶切位点上。克隆的质粒命名为pet30ykl033w-a。
100.实施例17在大肠杆菌中同时过量表达sdt1和udp
101.用引物seq id no40，seq id no41扩增udp基因(seq id no39)，电泳后用上海生工胶回收试剂盒回收。回收片段用bglii和hindiii双酶切，然后克隆到pet30sdt1的hindiii和bglii酶切位点上。克隆的质粒命名为pet30sdt1udp。
102.实施例18在大肠杆菌中同时过量表达sdt1、udp、psug
103.以pet30sdt1udp为模板，用引物seq id no48，seq id no49扩增sdt1和udp基因，电泳后用上海生工胶回收试剂盒回收。pet30psug46用ecorv和xhoi双酶切，电泳后用试剂盒回收。以上两个回收片段用吐露港生物科技有限公司的质粒克隆重组试剂盒进行重组克隆。重组质粒命名为pet30psug46sdt1
104.udp。把质粒pet30psug46sdt1udp转化到实施例5中的菌株δpepaδthraδargaδpsukδpsut后，转化菌株编号δpepaδthraδargaδpsukδpsut-pet30psug46sdt1。
105.实施例19hplc检测发酵液中的假尿苷方法如下：
106.发酵24小时后，取发酵液1ml，12000rpm离心10分钟后，取上清过滤。滤液进行hplc检测。检测方法如下：流动相：0.2％乙酸铵：乙腈＝95：5，检测波长260nm，waters xbridge amide c18(250mm
×
460mm)柱温30℃，流速1ml/min,检测时间15min，进样量10μl。
107.实施例20基因工程菌摇瓶发酵实验如下
108.把以上实施例12的菌株(mg1665-pet30psugphoaudp、δpepaδthraδarg-pet30psugphoaudp、δpepaδthraδargaδpsuk-pet30psugphoaudp、δpepaδthraδargaδpsukδpsut-pet30psugphoaudp)和实施例18中菌株(δpepaδthraδargaδpsukδ
gtacaacggg cgctggaattcgctaaaaag gagggtaaca cgctggtcat agtcaccgct gatcacgccc acgccagcca gattgttgcgccggatacca aagctccggg cctcacccag gcgctaaata ccaaagatgg cgcagtgatg gtgatgagttacgggaactc cgaagaggat tcacaagaac ataccggcag tcagttgcgt attgcggcgt atggcccgcatgccgccaat gttgttggac tgaccgacca gaccgatctc ttctacaccatgaaagccgc tctggggctg aaataaseq id no54 phoa蛋白序列
126.val lys gln ser thr ile ala leu ala leu leu pro leu leu phe thr pro val thr lysala arg thr pro glu met pro val leu glu asn arg ala ala gln gly asp ile thr alapro gly gly ala arg arg leu thr gly asp gln thr alaala leu arg asp ser leu serasp lys pro ala lys asn ile ile leu leu ile gly asp gly met gly asp ser glu ilethr ala ala arg asn tyr ala glu gly ala gly gly phe phe lys gly ile asp ala leupro leu thr gly gln tyr thr his tyr ala leu asn lys lys thr gly lys pro asp tyrval thr asp ser ala ala ser ala thr ala trp ser thr gly val lys thr tyr asn glyala leu gly val asp ile his glu lys asp his pro thr ile leu glu met ala lys alaala gly leu ala thr gly asn val ser thr ala glu leu gln asp ala thr pro ala alaleu val ala his val thr ser arg lys cys tyr gly pro ser ala thr ser glu lys cyspro gly asn ala leu glu lys gly gly lys gly ser ile thr glu gln leu leu asn alaarg ala asp val thr leu gly gly gly ala lys thr phe ala glu thr ala thr ala glyglu trp gln gly lys thr leu arg glu gln ala gln ala arg gly tyr gln leu val serasp ala ala ser leu asn ser val thr glu ala asn gln gln lys pro leu leu gly leuphe ala asp gly asn met pro val arg trp leu gly pro lys ala thr tyr his glyasn ile asp lys pro ala val thr cys thr pro asn pro gln arg asn asp ser val prothr leu ala gln met thr asp lys ala ile glu leu leu ser lys asn glu lys gly phephe leu gln val glu gly ala ser ile asp lys gln asp his ala ala asn pro cys glygln ile gly glu thr val asp leu asp glu ala val gln arg ala leu glu phe ala lyslys glu gly asn thr leu val ile val thr ala asp his ala his ala ser gln ile valala pro asp thr lys ala pro gly leu thr gln ala leu asn thr lys asp gly ala valmet val met ser tyr gly asn ser glu glu asp ser gln glu his thr gly ser gln leu
127.arg ile ala ala tyr gly pro his ala ala asn val val gly leu thr asp gln thr asp
128.leu phe tyr thr met lys ala ala leu gly leu lys
129.seq id no39 udp基因序列
130.atgtccaagt ctgatgtttt tcatctcggc ctcactaaaa acgatttaca aggggctacg cttgccatcg tccctggcga
131.cccggatcgt gtggaaaaga tcgccgcgct gatggataag ccggttaagc tggcatctca ccgcgaattc
132.actacctggc gtgcagagct ggatggtaaa cctgttatcg tctgctctac cggtatcggc ggcccgtcta
ala ala alalys gln arg gly ala pro ile val ala leu glu ser thr ile ile thr his gly met pro tyrpro gly asn ile glu met ala arg ser val glu ser ile ile arg asp gln gly ala valpro ala thr ile ala val ile his gly thr leu his ile gly leu glu pro ala glu leu glugln leu ala lys ala lys asp val met lys val ser arg ala asp ile ala phe ser ileala glu arg arg thr gly ala thr thr val ala ala thr met ile ala ala ala arg alagly ile lys val phe ala thr gly gly ile gly gly val his arg gly ala glu glu thrphe asp ile ser ala asp leu glu glu leu ala arg thr gly val ile val val cys alagly ala lys ala ile leu asp ile pro lys thr leu glu val leu glu thr arg gly valpro val val thr tyr glu ser asp glu phe pro ala phe trp ser arg ser ser gly ilearg ser pro leu thr leu asn ser pro ala ala ile ala asn phe gln thr thr arg glugln leu gly ile asp gly gly met leu ile ala asn pro val pro glu ala asp glu ileala arg glu glu met glu ile tyr ile glu arg ala leu asp ser ala glu arg asp gluile thr gly lys ala val thr pro tyr leu leu ser thr ile phe asp leu thr asp glygln ser leu lys thr asn ile ala leu val glu asn asn ala arg leu ala ala glu ilealaval ala leu gly glu
164.seq id no48 pumd基因序列
165.atgactggaa cagttttatt tgatctattc ggcgttatcg cccgtcacca gagcaccgag ggtaaaaaccgtttgacgcg tactgccggc gtcgccggtc cggcattctg ggatgcgtac tgggaattgc gccctccgtatgatcgcggt gaagttaatg gcccaggtta ttggcgtcaa gttgccgacg caattggcgt ccgttttgat gatcatcgtatcgcagacct ggtggaagcg gacatcgctt cttggagcgc ggttgacgac accatggttg cgctgattgaagagttgacg gcgaccggtc gtcacatggg cctgctgagc aacattccgg aggagcttgc ttcccattacgaggcgcatc acgcgtggct gaagcacttt ccggtgcgtg cgttcagctg ccgtatgggc cacgctaaaccggaacgtgc tgcgtacgag tggtgtcagc atgcgctgcg taccgaaccg gatcgcatcc tgttcgtggatgaccgggct gacaacgtga gagcggcgga agagttaggt atgcagggtc acctgtttac caccccggatcgcctccgcc aagcactgtc gcaatggacc taa
166.seq id no60 pumd蛋白序列
167.met thr gly thr val leu phe asp leu phe gly val ile ala arg his gln ser thr glugly lys asn arg leu thr arg thr ala gly val ala gly pro ala phe trp asp ala tyrtrp glu leu arg pro pro tyr asp arg gly glu val asn gly pro gly tyr trp arg glnval ala asp ala ile gly val arg phe asp asp his arg ile ala asp leu val glu alaasp ile ala ser trp ser ala val asp asp thr met val ala leu ile glu glu leu thrala thr gly arg his met gly leu leu ser asn ile pro glu glu leu ala ser his tyrglu ala his his ala trp leu lys his phe pro val arg ala phe ser cys arg met glyhis ala lys pro glu arg ala ala tyr glu trp cys gln his ala leu arg thr glu proasp arg ile leu phe val asp asp arg ala asp asn val arg ala ala glu glu leugly met gln gly his leu phe thr thr pro asp arg leu arg gln ala leu ser gln trpthr
168.seq id no49 phm8基因序列
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技术特征：
1.一种产假尿苷工程菌，其特征在于：利用基因工程技术在宿主菌中敲除嘧啶生物合成途径相关的基因且过量表达假尿嘧啶核苷合成相关的基因，得到可产假尿苷的基因工程菌。2.根据权利要求1所述的一种产假尿苷工程菌，其特征在于：敲除的所述嘧啶生物合成途径相关的基因为：pepa、thra和argf基因；所述pepa基因序列是seq id no1，thra基因序列是seq id no8，argf的基因序列是seq id no15。3.根据权利要求2所述的一种产假尿苷工程菌，其特征在于：过量表达的所述假尿嘧啶核苷合成相关的基因是udp、psug、磷酸酶基因，所述udp基因的蛋白序列为seq id no55；所述psug基因的蛋白序列为seq id no56、seq id no57、seq id no58或者seq id no59；所述磷酸酶基因的蛋白序列为seq id no54、seq id no60、seq id no61、seq id no62或者seq id no63。4.根据权利要求1所述的一种产假尿苷工程菌，其特征在于：利用基因工程技术在宿主菌中敲除了假尿嘧啶核苷激酶基因psuk，基因序列是seq id no22。5.根据权利要求1所述的一种产假尿苷工程菌，其特征在于：利用基因工程技术在宿主菌中敲除了基因psut，基因序列是seq id no29。6.根据权利要求1所述的一种如权利要求1-5所述任一种产假尿嘧啶核苷的基因工程菌在产假尿苷中的应用。7.一种生产假尿苷的方法，挑取权利要求1-5任一种假尿嘧啶核苷的基因工程菌的单菌落接种于装有lb培养液的试管，其中加入终浓度为50μg/ml的硫酸卡那霉素，30℃，220rpm培养过夜，然后按1％的接种量接种到装有20ml发酵液的摇瓶，37℃，220rpm培养四个小时后，加入iptg终浓度至50μg/ml,然后摇瓶放置30℃，220rpm发酵培养，从而生产假尿苷。8.根据权利要求7所述的一种生产假尿苷的方法，其特征在于：所述lb培养液的组成是：酵母抽提粉0.5％，胰蛋白胨1.0％，氯化钠1.0％。发酵培养基组成是：胰蛋白胨1.0％,酵母抽提0.5％,甘油2.0％，硫酸锰0.1mm，kh2po40.231％，k2hpo41.254％，ph 7.0。9.一种生产假尿苷的方法，其特征在于：挑取权利要求1-5任一种假尿嘧啶核苷的基因工程菌的单菌落接入种子培养基中，36℃，250rpm培养15h得到种子液，再按照10％的接种量，吸取1单位体积的种子液至发酵培养基中，接种后培养基总体积为10单位体积，所述发酵培养的培养基配方(g/l)如下：葡萄糖15，kh2po44，酵母粉6；硫酸铵8，mgso4·
7h2o 4；培养基中其他组分(mg/l)：feso4·
7h2o 150，mnso4·
7h2o 20，氯化钴3.5，硫酸锌3.5，氯化钙8，另外培养基中加入卡纳霉素50mg/l。10.根据权利要求9所述的一种生产假尿苷的方法，其特征在于：发酵过程中，培养基ph用含氨13mol/l的氨水调控在7.0，发酵温度在0-3h保持在37℃，发酵第3h加入iptg终浓度至50μg/ml，同时发酵温度调整到30℃，流加葡萄糖保持终浓度0.1％左右，发酵过程中通气设定为1.0vvm，通过搅拌转速和溶氧联动，控制溶氧在30％-40％，发酵周期72h。

技术总结
一种产假尿苷工程菌，利用基因工程技术在宿主菌中敲除嘧啶生物合成途径相关的基因，得到可产假尿苷的基因工程菌；所述宿主菌为大肠杆菌；敲除的所述嘧啶生物合成途径相关的基因为：pepA、thrA和argF基因；过量表达UDP，psuG、磷酸酶基因。UDP基因的蛋白序列为SEQIDNo55；所述psuG基因的蛋白序列为SEQIDNo56、SEQIDNo57、SEQIDNo58或者SEQIDNo59；所述磷酸酶基因的蛋白序列为SEQIDNo54、SEQIDNo60、SEQIDNo61、SEQID No62或者SEQIDNo63。所述菌株敲除psuK、psuT基因。psuK基因序列是SEQ IDNo22，psuT基因序列是SEQIDNo29。psuT基因序列是SEQIDNo29。psuT基因序列是SEQIDNo29。


技术研发人员：周敏 唐正菊
受保护的技术使用者：台州学院
技术研发日：2023.02.10
技术公布日：2023/7/31