一种抑制植物病原真菌附着孢形成的多肽及其应用

1.本发明属于植物保护生物农药领域，具体涉及一种抑制植物病原真菌附着孢形成的多肽，其制备方法，及其应用。


背景技术：

2.抗菌肽(amps)是由10-50个氨基酸组成的小分子，在包括植物、昆虫、微生物和哺乳动物在内的多种物种中高度保守。抗菌肽根据其结构主要可以分为3大类：(1)α-螺旋抗菌肽；(2)环形抗菌肽，包括头尾封闭的环形抗菌肽和头尾不封闭，但分子结构中存在二硫键的环形抗菌肽；(3)分子结构中含有大量特殊氨基酸(如脯氨酸、甘氨酸)的抗菌肽。大部分抗菌肽的相对分子质量小于1.0
×
104，具有疏水性，整个分子带正电荷。它们同时具有亲水性和亲脂性形成的两亲性二级结构(包括α-螺旋、β-折叠、β发夹样β-折叠，以及α-螺旋与β-折叠的混合结构)。还有一些特殊结构的抗菌肽。amps具有广谱性、毒性小、靶细胞抗药性低及调节宿主免疫反应的能力，因此可被认为是防治病原微生物的潜在候选药物。
3.抗菌肽昆虫先天免疫重要的组成部分，在阻止外源微生物侵入方面发挥必不可少的作用，因为它们构成了针对多种致病微生物的第一道防线，包括细菌、真菌和病毒。自20世纪80年代boman等人发现了的世界上第一个抗菌肽，目前为止已有339个昆虫amps收录入抗菌肽数据库。昆虫抗菌肽来源之广和独特的特殊结构使昆虫amps在农业、病媒控制和医学等领域具有潜在的应用前景。在烟草中转基因表达一种昆虫防御素(g.mellonellagenerimycin)和抗菌肽(sarcooxin-ia)能赋予烟草对病原真菌的抗性。天蚕素在转基因植物中的表达，包括水稻和番茄，可以赋予对细菌和真菌病原体的抗性。通过将两个抗菌肽活性区域杂交在一起的杂交肽也被用于转基因植物以增强抗性或拓宽对病原菌体的抗性谱。ohsima等发现异源植物防御素的表达可以赋予转基因植物对真菌的抗性(mourgues,f.；brisset,m.n.；chevreau,e.strategies to improve plant resistance to bacterial diseases through genetic engineering.trends biotechnol.1998,16,203-210,doi:10.1016/s0167-7799(98)01189-5.)。heath c发现利用特定的激发子激发异源植物的防御素，能够增强植物特异性的防御能力(heath,m.c.nonhost resistance and nonspecific plant defenses.curr.opin.plant biol.2000,3,315-319,doi:10.1016/s1369-5266(00)00087-x)。akihito nozaka等发现利用氯霉素能够抑制稻瘟菌孢子特异性形成附着胞，利用此原理降低孢子对寄主的侵染(nozaka,a.；nishiwaki,a.；nagashima,y.；endo,s.；kuroki,m.；nakajima,m.；narukawa,m.；kamisuki,s.；arazoe,t.；taguchi,h.；etal.chloramphenicol inhibits eukaryotic ser/thr phosphatase and infection-specific cell differentiation in the rice blast fungus.sci rep2019,9,9283,doi:10.1038/s41598-019-41039-x.)。近些年更多学者将目光放在杂合肽的研究上，利用杂合肽的优势来增强对真菌细菌的抑制效果，例如jose mariasaugar等人利用杂合肽cecropina-melittin来增强对细菌和真菌的抑制效果(saugar,j.m.；rodr
í
guez-hern
á
ndez,m.j.；de la torre,b.g.；pach
ó
n-m.e.；fern
á
ndez-reyes,m.；andreu,d.；
pach
ó
n,j.；rivas,l.activity of cecropin a-melittin hybrid peptides against colistin-resistant clinical strains of acinetobacterbaumannii:molecular basis for the differential mechanisms of action.antimicrob.agents chemother.2006,50,1251-1256,doi:10.1128/aac.50.4.1251-1256.2006.)。
4.真菌病原菌引起的病害种类最多。常见的真菌性病性病原菌主要有稻瘟菌，炭疽病菌，禾谷镰刀菌等(the top 10fungal pathogens in molecular plant pathology)。稻瘟病是影响全球水稻生产的最重要的病害，它对粮食安全构成严重威胁。由辣椒尖孢炭疽引起的炭疽病是辣椒生产中最具有破坏性的真菌病害。镰刀菌引起的赤霉病更是危害多种粮食作物的一种重要病害。对于真菌性病害的防治主要依靠杀菌剂，过度使用杀菌剂对人类、生态系统和产生抗杀菌剂菌株造成严重后果。对于这些风险，找到控制稻瘟病、辣椒尖孢炭疽病和赤霉病的替代方法是极其重要的。生物防治是利用某些生物或生物代谢产物及有益生物对病虫害进行控制和防治的技术。其中常用的有利用微生物农药。
5.目前已有研究报道来自多种寄主上的炭疽菌等病原真菌对dmis等多种杀菌剂产生了抗药性，如何克服或延缓病原菌对其抗药性的产生和发展，以延长其使用寿命，是植物病原菌抗药性问题中所面临的重要难题。同时，由于新杀菌剂的药物研发周期长、花费高，极大的限制了其发展速度。抗菌肽既具有种类繁多、理化性质稳定及来源广的特点，同时选择生物农药可降低对环境污染，可以为减少传统广谱杀菌剂的使用提供新途径。
6.基于上述，选择不同种类的抗菌肽结构域构建杂交肽，以cad1、cad5、cad7为亲本，通过选择其中功能结构域，制备杂合抗菌肽溶液，研究杂合抗菌肽的相关生物活性，比较不同浓度亲本抗菌肽与杂合肽的增效情况，明确其抗菌谱的变化。用以阐释亲本抗菌肽杂合后提高真菌对其的敏感性，以延缓真菌产生抗药性，同时筛选最佳的杂合抗菌肽，为其杀菌剂溶液的制备和高效利用提供科学依据，延长高效但容易产生抗药性的药物使用寿命，同时实现农业生产上减肥减药。


技术实现要素：

7.本发明目的是在于提供一种抑制植物病原真菌附着孢形成的多肽，其制备方法和应用。
8.本发明首先提供一种抑制植物病原真菌附着孢形成的复合多肽，其特征在于，是以黑水虻天蚕毒素抗菌肽cad1，cad5，cad7为亲本，按照cad1，cad5，cad7的顺序串联构建cad-con杂合多肽，优选地，其氨基酸序列如seq id no：4所示。
9.进而提供编码所述的复合多肽的核酸，优选地其核苷酸序列如seq id no：5所示。
10.本发明还提供所述的复合多肽的制备方法，其特征在于，其通过化学合成方法得到，或者通过生物工程方法得到。具体地，合成cad1、cad5和cad7串联的编码核苷酸序列，优选为如seq id no：5所示，构建到表达载体中，导入宿主细胞中进行表达得到所述复合多肽。
11.优选地，所述表达载体为原核表达载体，优选为pet-sumo，所述宿主细胞是原核细胞，具体是大肠杆菌，优选为bl21(de3)。
12.本发明也提供所述的复合多肽在抑制或防治植物病原真菌引起植物病害中的应用。优选地，所述植物病原真菌为梨孢属(magnaporthe)、刺盘孢属(colletotrichum)或镰
刀菌属(fusarium)；更优选地，所述植物病原真菌是水稻稻瘟病菌、辣椒尖孢炭疽病菌或禾谷镰刀菌。
13.在具体实施方式中，所述应用是利用抗菌肽80μm水溶液或杂合肽40μm水溶液在植物发病初期喷洒在植物体表。
14.本发明提供一种抑制植物病原真菌附着孢形成的多肽，其特征在于，是来自黑水虻天蚕毒素抗菌肽cad1，或cad5，或cad7，或其混合物。优选地，所述植物病原真菌是水稻稻瘟菌。
15.本发明通过实验表明，以辣椒炭疽病菌、稻瘟病菌、镰刀菌为供试菌株，供试抗菌肽溶液对供试菌株，本发明提供的多肽表现出不同的增效抑菌活性。其中杂合抗菌对辣椒炭疽病菌、稻瘟病菌、镰刀菌均表现出增效抑菌活性，其增效抑菌效果是母本的2.1-2.4倍；cad1，或cad5，或cad7对水稻稻瘟菌也明显的抑制作用。
附图说明
16.图1cad1(cec881)质谱图。
17.图2cad5(cec885)质谱图。
18.图3cad7(cec907)质谱图。
19.图4杂合肽cad-con的检测。其中，左图为蛋白胶考马斯亮蓝染色照片，右图为western blot结果。m：marker；1诱导前蛋白；2、3诱导后蛋白；4、5纯化后蛋白。
20.图5辣椒尖孢炭疽病病原菌孢子对不同抗菌肽的敏感性测定。
21.图6水稻稻瘟病孢子对亲本抗菌肽及杂合抗菌肽的敏感性。
具体实施方式
22.以下结合实施例进一步说明本发明，但不构成对本发明的限制。
23.实施例一抗菌肽cad1、cad5、cad7、cad-con的制备
24.选取黑水虻抗菌肽cad1、cad5与ad7的氨基酸序列，交付于生工生物工程(上海)股份有限公司多肽部门合成，图1-3为抗菌肽cad1、cad5与ad7的质谱图谱。通过反馈回来的质谱分析图可知，亲本抗菌肽cad1、cad5与ad7成功合成。
25.cad1、cad5与ad7的氨基酸序列如下：
26.cad1(seq id no：1)：slwkklfkpveragqrirdatikgiaiaqqganvlatvrggpaippgqg。
27.cad5(seq id no：2)：gwwkkvfkpveklgqrvrdagiqgiaiaqqganvlatvrggppq。
28.cad7(seq id no：3)：gwwkrvfkpveklgqrvrdagiqglqiaqqganvlatvrggppqqg。
29.杂合肽cad-con通过原核表达、纯化回收、浓缩脱盐后保存，检测结果为图4，具体过程如下。
30.杂合肽cad-con的氨基酸序列如下(seq id no：4)：
31.cad-con:slwkklfkpveragqrirdatikgiaiaqqganvlatvrggpaippgqggw wkkvfkpveklgqrvrdagiqgiaiaqqganvlatvrggppqgwwkrvfkpveklgqrv rdagiqglqiaqqganvlatvrggppqqg。
32.杂合肽cad-con的脱氧核糖核酸序列如下(seq id no：5)：
33.atgagtttatggaagaagctcttcaagccagtggaaagagcaggccaaagaattcgtgatgcaaccat
caaaggtattgctattgcccaacaaggagctaatgtactcgcaacagttcgtggtggcccagcaattccccccggacaaggaggttggtggaagagagttttcaagccagtggaaaaacttggtcaacgagttcgtgatgccggtattcaaggactccaaattgctcaacaaggagccaatgttctggccacggttcgaggtggaccaccccaacaaggaggctggtggaagaaagtcttcaagcctgtggagaaacttggtcagcgagttcgtgatgctggaattcaaggaatcgcaattgcccaacaaggagccaatgttttggctacggttcgaggtggaccaccacaa。
34.先按照上述cad-con脱氧核糖核酸序列进行合成(sangon biotech，shanghai，china)。使用bamhi/xhoi将目的片段亚克隆到pet-sumo表达载体中并命名为pet-sumo-cec-con。将构建好的载体质粒导入到大肠杆菌escherichia coli(bl21)中，并在含有50ug/ml kanamycin的luria-bertani中生长。分两阶段生长，在37℃下200rpm生长至od600＝0.6，然后在28℃培养8小时。离心(104rpm，4℃，5分钟)后，将收集到的细胞用缓冲液1～5ml重悬后加入pmsf溶液(1xpbs，1mm pmsf)，为了释放表达蛋白，将悬浮细胞以5s开启，20s关闭的周期破碎10分钟(80％振幅)，然后用离心法(104rpm，4℃，10分钟)将得到的蛋白质分离成可溶与不可溶两组。总蛋白测试采用bradford protein assay kit(beyotime),用等量的2x上样缓冲液混合后在沸水中处理10分钟，加入sds-page凝胶孔中。将分离得到的凝胶蛋白印迹转移到pvdf膜上，然后利用5％的脱脂奶粉在1xtbs-t(0.1％tween 20)中室温孵育1小时，用抗his抗体对封闭膜进行免疫探索(his在tbs-t中稀释1：3000)室温孵育1小时，用1xtbs-t缓冲液洗涤三次，将二抗(山羊抗兔lg，g-hrp)稀释1：5000，在适温孵育1小时，加入显色液显色后仪器扫描。扩大培养，离心收集菌体，重悬菌体，超声波破碎细胞壁，离心后上清使用带有6xhis标签的ni柱将诱导表达的目的蛋白亲和层析纯化。纯化后的液体加入3kda的蛋白脱盐柱中离心(104rpm，4℃，5分钟)，每5分钟观察一次后加入适量的1xpbs，多轮次离心后将收集到的脱盐浓缩液收集至10ml离心管放置于-20℃保存。实施例二：辣椒尖孢炭疽病原菌孢子对抗菌肽cad1、cad5、cad7与杂合肽cad-con的敏感性测定
35.1、培养基的制备
36.pda培养基:购于索莱宝公司的不含抗生素的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，称46g于1lddh2o中溶解，121℃高压灭菌20min，备用。
37.cm液体培养基：50ml 20
×
nitrate salts，1ml trace element，1ml vitamin solution，10g葡萄糖，2g蛋白胨，1g酵母提取物，1g络氨酸，用naoh调节ph至6.5，加去离子水定容至1l。121℃高压灭菌20min，备用。
38.2、多肽实验制剂的配置
39.将保存于-80℃的多肽冻干粉利用ddh2o完全溶解，配置成至500μm的多肽母液，将杂合肽cad-con稀释为200μm的母液。配置过程均在4℃条件下完成。配置完成后放置-20℃冰箱备用。
40.3、辣椒尖孢炭疽病病原菌对多肽的敏感性测定
41.采用生长速率法进行敏感性测定实验。将供试菌株hhdl02(c.acutatum)于不含药物的pda培养基上培养4d，用直径为5mm的打孔器于菌落边缘取菌丝块，分别接种到含有100mg/l amp
+
抗生素工作浓度的cm液体培养基中，于28℃、200rpm恒温摇床中培养48h后，放置于超净工作台利用滤膜过滤菌丝收集孢子液。5000rpm，20℃，10min，ddh2o轻柔重悬，重复上述步骤两次，稀释孢子浓度为2.0
×
107/ml,取12μl孢子液，利用多肽溶液稀释至120μl，吸取20μl滴至盖玻片重复3次。每两小时测一次孢子芽管长度，测量至四小时。拍照并用
excel工作表记录。
42.辣椒尖孢炭疽病病原菌(c.acutatum)孢子对不同种之间的目的抗菌肽的敏感性有较大差异。结果表明：辣椒尖孢炭疽病病原菌孢子对不同种目的抗菌肽的ec
50
值存在显著差异，辣椒尖孢炭疽菌对于不同目的抗菌肽cad1、cad5、cad7与杂合肽cad-con的ec
50
值分别51μm、49μm、44μm和22μm，杂合肽与亲本肽两者最大相差2.32倍(具体见表1、2和图5)。
43.表1不同抗菌肽对辣椒尖孢炭疽孢子附着胞抑制的回归方程
44.抗菌肽线性回归方程(y＝)相关系数r2ec
50
(μm)cad11.5076x-2.07680.943751cad51.1244x-1.34220.945749cad71.2766x-1.65230.93444cad-con0.8462x-0.62470.952422
45.表2不同抗菌肽刺激辣椒尖孢炭疽孢子芽管生长
[0046][0047]
实施例三：水稻稻瘟病原菌孢子对目的抗菌肽的敏感性测定
[0048]
1、培养基的制备
[0049]
cm固体培养基：50ml 20
×
nitrate salts，1ml trace element，1ml vitamin solution，10g葡萄糖，2g蛋白胨，1g酵母提取物，1g络氨酸，用naoh调节ph至6.5，13g琼脂粉，加去离子水定容至1l。121℃高压灭菌20min，备用。
[0050]
sdc培养基(稻草培养基)：称取100g稻杆，煮沸20min，用纱布过滤，去残渣，加入40g玉米粉和15g琼脂混匀，用去离子水定容至1l，121℃高压灭菌20min。
[0051]
2、水稻稻瘟病原菌孢子对目标抗菌肽溶液的敏感性测定
[0052]
采用生长速率法进行敏感性测定实验。将供试菌株guy 11(m.oryzae)于不含药物的cm培养基上培养7天，用直径为5mm的打孔器于菌落边缘取菌丝块，分别接种到不含有药物的stc培养基上，于28℃、50％rh恒温培养箱中黑暗培养7d，菌丝开始生长5d后，刮去培养基上层菌丝，放置于28℃、50％rh乌灯恒温培养箱中培养3-4d，取出stc培养皿，利用ddh2o冲洗培养皿，并收集液体用滤膜过滤。5000rpm，20℃，10min，ddh2o轻柔重悬，重复上述步骤两次，稀释孢子浓度为2.0
×
107/ml，取12μl孢子液，利用多肽溶液稀释至120μl，吸取20μl滴至盖玻片重复3次。每四小时测一次孢子芽管长度，测量至八小时。拍照并用excel工作表记录。
[0053]
水稻稻瘟病原菌孢子对不同目的抗菌肽差异明显，其中杂合抗菌肽cad-con与亲本抗菌肽ec
50
值相比，均明显降低，其中cad5、cad7 ec
50
值为43μm，其次为cad1，ec
50
值为40μ
m，杂合抗菌肽cad-con ec
50
值为15μm。与亲本抗菌肽的ec
50
值相比较，水稻稻瘟菌的孢子对其杂合抗菌肽cad-con敏感性不同程度提高，其增效为亲本肽的2.4倍，表明杂合肽有助于提高抗真菌活性。
[0054]
表3目的抗菌肽及杂合抗菌肽对水稻稻瘟菌孢子抑制的回归方程
[0055][0056]
表4不同抗菌肽刺激水稻稻瘟菌孢子芽管生长
[0057][0058][0059]
实施例四：抗菌肽的杀菌谱确定
[0060]
采用生长速率法进行杀菌谱是否扩大的测定实验。将供试菌株镰刀菌于不含药物的pda培养基上培养5至6天，用直径为5mm的打孔器于菌落边缘取菌丝块，放置于cm液体培养基，于28℃、200rpm恒温摇床中培养48h后，放置于超净工作台利用滤膜过滤菌丝收集孢子液。5000rpm，20℃，10min，ddh2o轻柔重悬，重复上述步骤两次，稀释孢子浓度为2.0
×
107/ml，取12μl孢子液，利用多肽溶液稀释至120μl，吸取20μl滴至盖玻片重复3次。每十二小时测一次孢子芽管长度，测量至四十八小时。拍照并用excel工作表记录。
[0061]
我们利用cad1、cad5、cad7和cad-con进行杀菌谱活性测定，以镰刀菌为研究对象，采用生长速率法进行测定实验。结果如表5所示。
[0062]
表5亲本抗菌肽及其杂合肽对番茄镰刀菌孢子芽管变异的回归方程
[0063][0064]
从表中结果可知，三种抗菌肽及杂合肽对番茄镰刀菌孢子芽管变异的ec
50
值与辣椒胶孢炭疽菌孢子的相当，或略微高于辣椒胶孢炭疽菌孢子形成附着胞的ec
50
。但cad-con的ec
50
值在明显低于ad1、cad5或cad7。

技术特征：
1.一种抑制植物病原真菌附着孢形成的复合多肽，其特征在于，是以黑水虻天蚕毒素抗菌肽cad1，cad5，cad7为亲本，按照cad1，cad5，cad7的顺序串联构建cad-con杂合多肽，优选地，其氨基酸序列如seq id no：4所示。2.编码如权利要求1所述的复合多肽的核酸，优选地其核苷酸序列如seq id no：5所示。3.如权利要求1所述的复合多肽的制备方法，其特征在于，其通过化学合成方法得到，或者通过生物工程方法得到。4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，合成cad1、cad5和cad7串联的编码核苷酸序列，优选为如seq id no：5所示，构建到表达载体中，导入宿主细胞中进行表达得到所述复合多肽。5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述表达载体为原核表达载体，优选为pet-sumo，所述宿主细胞是原核细胞，具体是大肠杆菌，优选为bl21（de3)。6.如权利要求2所述的复合多肽在抑制或防治植物病原真菌引起植物病害中的应用。7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物病原真菌为梨孢属（magnaporthe）、刺盘孢属(colletotrichum)或镰刀菌属(fusarium)；更优选地，所述植物病原真菌是水稻稻瘟病菌、辣椒尖孢炭疽病菌或禾谷镰刀菌。8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于，利用抗菌肽80 μm水溶液或杂合肽40 μm水溶液在植物发病初期喷洒在植物体表。9.一种抑制植物病原真菌附着孢形成的多肽，其特征在于，是来自黑水虻天蚕毒素抗菌肽cad1，或cad5，或cad7，或其混合物。10.如权利要求9所述的多肽在抑制或防治植物病原真菌引起植物病害中的应用，所述植物病原真菌是水稻稻瘟菌。

技术总结
本发明属于植物保护生物农药领域，具体涉及一种抑制植物病原真菌附着孢形成的多肽，其制备方法，及其应用。其是以黑水虻天蚕毒素抗菌肽CAD1，CAD5，CAD7为亲本，按照CAD1，CAD5，CAD7的顺序串联构建CAD-con杂合多肽。通过实验表明，以辣椒炭疽病菌、稻瘟病菌、镰刀菌为供试菌株，供试抗菌肽溶液对供试菌株，本发明提供的多肽表现出不同的增效抑菌活性。其中杂合抗菌对辣椒炭疽病菌、稻瘟病菌、镰刀菌均表现出增效抑菌活性，其增效抑菌效果是母本的2.1-2.4倍；CAD1，或CAD5，或CAD7对水稻稻瘟菌也明显的抑制作用。显的抑制作用。


技术研发人员：谭新球 孙乾隆 王运生 张鑫 陈岳 欧阳英 余苹中 张卓 李成刚 刘思珍 郭盛 吴飞
受保护的技术使用者：湖南省农业科学院
技术研发日：2023.02.08
技术公布日：2023/7/31