一株新根瘤菌NeorhizobiumglycineEC2-8及其应用

一株新根瘤菌neorhizobium glycine ec2-8及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物领域，具体涉及一株隶属于新根瘤菌属neorhizobium的一个新种及其应用。


背景技术：

2.大豆共生生物固氮系统的形成是一个由根瘤菌和大豆相关基因共同参与、相互对话、识别、协同作用并随环境条件和细胞内的生理变化而调节的复杂过程。豆科植物-根瘤菌联合共生过程不仅为自身生长发育提供了所需氮素，还可以通过凋落物分解提高土壤供氮能力。生物固氮作用可减少化学氮肥的施用，降低氮肥过量施用造成的土壤无机氮素累积、土壤酸碱失衡、水体富营养化等风险，促进并提高农田生态系统的健康发展。同时，豆科植物结瘤固氮还可以提高磷的利用效率，间接调节土壤碳氮磷的化学计量比。目前，巴西、美国和阿根廷等大豆生产国，根瘤菌的接种面积达80％以上，而我国根瘤菌接种面积不足5％。因此，分离纯化高效的根瘤菌资源一方面可以为丰富根瘤菌菌种资源库、研发商用根瘤菌菌剂提供候选菌株，另一方面可通过根瘤菌的施入优化土壤碳氮磷元素循环，促进作物生长。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一株从大豆根瘤内分离纯化获得的一株neorhizobium属根瘤菌ec2-8及其应用，补充了现有根瘤菌菌种资源，该根瘤菌能够侵染大豆根部并形成有效结瘤，同时可促进大豆生长。
4.本发明是通过以下技术方案实现的：
5.本发明公开了一株从大豆根瘤内分离纯化获得的一株neorhizobium属根瘤菌及其应用，经生理生化测定和系统发育分析，该菌是neorhizobium属的一个新种，并将其命名为neorhizobium glycine ec2-8，该菌株已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北武汉市武昌区八一路珞珈山，武汉大学；保藏日期2022年5月24日，保藏编号cctcc no：m2022709。
6.结合菌株形态特征、生理生化检测和系统进化分析，确定其为隶属于neorhizobium sp.(新根瘤菌属)的一个新种，与最相近的菌株neorhizobium tomejilensis t17_20
t
的相似性为98.57％。菌株回接实验表明，该根瘤菌能够侵染大豆根部并形成有效结瘤，同时可促进大豆生长。
7.所述的根瘤菌neorhizobium glycine ec2-8，其16s rdna序列如seq id no:1所示，该菌系统分类属于neorhizobium sp.(新根瘤菌属)的一个新种。
8.所述的根瘤菌neorhizobium glycine ec2-8可侵染大豆根部并形成有效根瘤，还可明显增加大豆根长、根表面积和根体积，以及地上鲜重和干重。因此，可以将该菌用于促进大豆生长。
9.所述的根瘤菌neorhizobium glycine ec2-8用于促进大豆生长时，将所述的根瘤
菌进行发酵，获得发酵液，将大豆种子浸泡于所述发酵液内，或采用所述发酵液浇灌大豆幼苗根部。
10.本发明的优点和有益效果为：
11.可降低氮肥的生产投入，减少资源浪费，同时本发明还可减少农作物生产过程中氮肥的施入量，节约农民生产成本，符合绿色、有机食品生产标准，可使农作物的产量和质量都得到提高，促进了农业增产和农民增收，也确保了产出的粮食产品及秸秆饲料质量，使下游产品的品质安全得到保障，社会效益显著。
12.保藏信息
13.根瘤菌neorhizobium glycine ec2-8，该菌株已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：武汉，保藏日期：2022年05月24日，保藏编号cctcc no:m2022709。
附图说明
14.图1是本发明neorhizobiumglycine ec2-8生长形态，其中：a为在yma培养基上的菌株生长形态，b为透射电镜拍摄的菌株形态，c为扫描电镜拍摄的菌株形态；
15.图2是本发明neorhizobiumglycineec2-8的16s rdna系统发育树；
16.图3是本发明neorhizobiumglycineec2-8的全细胞蛋白质的质谱图；
17.图4是本发明neorhizobium glycine ec2-8的极性酯图谱；
18.图5是本发明neorhizobiumglycineec2-8的结瘤回接实验；
19.对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。
具体实施方式
20.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
21.实施例一：neorhizobium glycine ec2-8的分离纯化
22.样品来源：大豆根瘤
23.采样地点：中国黑龙江省哈尔滨市中国科学院东北地理与农业生态研究所；
24.yma培养基(固体)：k2hpo40.25g/l、kh2po40.25g/l、mgso4.7h2o 0.2g/l、nacl 0.1g/l、酵母提取物0.8g/l、甘露醇10g/l、琼脂18g/l，ph6.8-7.2，121℃灭菌30min。
25.yma培养基(液体)：k2hpo40.25g/l、kh2po40.25g/l、mgso4.7h2o 0.2g/l、nacl 0.1g/l、酵母提取物0.8g/l、甘露醇10g/l，ph6.8-7.2，121℃灭菌30min。
26.分离和纯化步骤：在根瘤形成旺盛期采集新鲜大豆根瘤，用自来水冲洗根瘤表面土壤颗粒，分别置于70％乙醇、次氯酸钠和70％乙醇中各7分钟，再用灭菌水清洗4次，之后用灭菌研钵磨碎根瘤，用无菌水制成一系列稀释浓度的菌液，将每个梯度的菌液涂在含有yma固体培养基的培养皿上，置于28℃恒温培养箱中培养；反复挑取不同稀释浓度上的单菌落进行平板划线培养，分别继代培养4～5代，即可得到纯的、形态一致的单菌落。菌株纯化后4℃保存。
27.实施例二：neorhizobium glycine ec2-8的表型鉴定
28.将neorhizobium glycine ec2-8在yma固体培养基平板上28℃培养3天，菌株在
yma培养基上生长良好，菌落白色，质地厚，菌株杆状，革兰氏阴性，通过透射电镜未观察到菌株有鞭毛，菌株无运动性(图1)。
29.实施例三：neorhizobium glycine ec2-8的系统分类鉴定
30.首先，采用细菌基因组提取试剂盒(天根，50次/盒)进行菌株dna提取，具体步骤按照试剂盒说明书进行。以菌株dna为pcr模板，用细菌通用引物27f(5'-agagtttgatcctggctcag-3')和1492r(5'-ggctaccttgttacgact t-3')进行pcr扩增。pcr反应体系采用10μl体系，体系如下：27f和1492r引物(50pmol)各0.1μl、dna模板0.3μl、dntp(2.5mm takara)1μl、buffer(takara)1μl、rtaq聚合酶(5u
·
μl-1
，takara)0.3μl、无菌水7.2μl，以添加无菌水为模板做为pcr扩增的阴性对照。具体扩增程序为：94℃ 3min，94℃ 1min、55℃ 1min、72℃ 1min(28个循环)，72℃5min。扩增结束后，吸取3μlpcr产物进行1.0％的琼脂糖凝胶检测，观察目的条带有无。pcr产物纯化按照磁珠法纯化试剂盒(10ml/瓶，硕美)流程操作，获得纯化的pcr产物，将纯化后的pcr产物寄送至华大生物进行上机测序。16s rdna序列如seq id no:1所示；将得到的测序序列在ezbiocloud数据库(https://www.ezbiocloud.net)进行同源性比对。结果显示，neorhizobium glycine ec2-8隶属于neorhizobium sp.(新根瘤菌属)的一个新种，与最相近的菌株neorhizobium tomejilensis t17_20
t
的相似性为98.57％。用软件molecular evolutionary genetic analysis software(mega 5.0)构建系统进化树(图2)，与来自neorhizobium属的序列可构成稳定的进化分支。
31.实施例四：neorhizobium glycine ec2-8生理生化特性检测
32.(1)采用“一般细菌常用鉴定方法”，参照与之相似性最高的菌株生理生化特性，对菌株的酶活性、最佳生长温度、水解吐温80的能力、需求氧气的程度、最适生长的ph和盐浓度范围进行了测定，具体结果如表1：
33.表1菌株neorhizobiumglycineec2-8生理生化特性
[0034][0035]
(2)参照与neorhizobium glycine ec2-8亲缘关系最近的菌株选取的抗生素类型对其进行药敏检测，发现neorhizobium glycine ec2-8对四环素、卡那霉素、链霉素和氨苄西林敏感，而对红霉素不敏感。
[0036]
(3)参照与neorhizobium glycine ec2-8亲缘关系最近的菌株，选取api 20e、api 20ne、api zym和api 50chb试剂盒对菌株酶活和碳源同化能力进行检测，具体结果如表2～5所示：
[0037]
表2菌株neorhizobiumglycineec2-8生理生化特性-酶活、碳源同化(api 20ne)
[0038][0039][0040]
+：阳性反应；-：阴性反应；
[0041]
表3菌株neorhizobium glycine ec2-8生理生化特性-酶活(api zym)
[0042][0043][0044]
+：阳性反应；-：阴性反应；w：弱阳性反应
[0045]
表4菌株neorhizobium glycine ec2-8生理生化特性-酶活、碳源氧化(api 20e)
[0046][0047]
+：阳性反应；-：阴性反应
[0048]
表5菌株neorhizobium glycine ec2-8生理生化特性
‑‑
利用碳源产酸(api chb)
[0049]
[0050][0051]
+：阳性反应；-：阴性反应
[0052]
实施例五：neorhizobium glycine ec2-8 biolog鉴定
[0053]
利用biolog微量分析技术检测菌株neorhizobium glycine ec2-8对95种不同碳源的利用情况，具体如表6所示：
[0054]
表6菌株neorhizobiumglycineec2-8生理生化特性-碳源利用
[0055]
[0056][0057]
+：阳性反应；-：阴性反应；w：弱阳性反应
[0058]
实施例六：neorhizobium glycine ec2-8全细胞蛋白质质谱鉴定
[0059]
基于菌株的全细胞蛋白质(基质辅助激光解析电离飞行时间)质谱仪测定，获得菌株的全细胞蛋白质的质谱图如图3所示，用于进一步辅助说明neorhizobium glycine ec2-8的分类地位。
[0060]
实施例七：菌株细胞脂肪酸成分分析
[0061]
将菌株在tab液体培养基中180rpm，30℃培养2d，8000rpm离心收集菌体，蒸馏水清洗2遍，真空冷冻干燥，制成菌体干菌体，将干菌体送交中国普通微生物保藏管理中心进行全细胞脂肪酸组分测定。经分析，neorhizobium glycine ec2-8的脂肪酸组分如下表7所示：
[0062]
表7neorhizobium glycine ec2-8的脂肪酸组分
[0063]
[0064][0065]
实施例八：菌株细胞中醌组分分析
[0066]
收集冻干菌体约150mg，加入氯仿∶甲醇＝2∶1(v/v)的溶液40ml，在黑暗处磁力搅拌10h左右；用滤纸过滤收集滤液；用减压旋转蒸发仪40～45℃减压蒸馏至干燥，弃馏液；用氯仿∶甲醇＝2∶1(v/v)的溶液1～2ml重新溶解干燥物，长条状点样于gf254硅胶板(规格100
×
200mm，青岛海洋化工厂分厂)；以己烷∶乙醚＝34∶6(v/v)作展层剂展层约20min，取出风干；在波长254nm紫外灯下观察，在绿色荧光背景下呈暗褐色的带即为甲基萘醌的位置(rf＝0.8)，rf＝0.4-0.5位置的带为泛醌；刮下rf＝0.4的带，置于2ml离心管中，用1ml氯仿溶解，然后用细菌滤器抽滤除去硅胶，收集滤液，即得泛醌的氯仿溶液。置于4℃、黑暗处保存；采用反相高压液相色谱分析法测定醌组分。高压液相色谱仪为伊力特高效液相色谱，反相高压液相柱为十八烷基硅烷(ods 5mm,150
×
4.6mm,i,d)，流动相为甲醇(谱纯)∶异丙醚(色谱纯)＝3∶1(v/v)溶液，流速为1ml/min，柱温为40℃，275nm紫外检测，使用伊力特高效液相色谱完成测定并记录数据。根据参比菌株泛醌组分与洗脱时间的关系，分析实验菌株的醌型。参比菌株为sphingopyxis witflariensis(cgmcc 1.09093)。经上述方法测定分析得到菌株ec2-8细胞泛醌主要是coq-8(4.2％)、coq-10(95.8％)。
[0067]
实施例九：菌株极性脂组分测定和分析
[0068]
(1)极性脂提取方法：采用氯仿-甲醇抽滤法抽提总脂成分，参考英国minnikin等(1977)使用薄板双相层析方法鉴定极性脂成分。
[0069]
(2)极性脂样品制备：
[0070]
1)100mg干菌体，悬浮于9.5ml氯仿：甲醇：0.3％nacl(2.5:5:2)。
[0071]
2)水浴80℃，15min，冷却后，滤纸过滤至50ml离心管中，加入2.5ml氯仿和2.5ml0.3％nacl，4000rpm离心5min，取下层。小心分取下层氯仿相至干净的旋转蒸发仪专用烧瓶中，在旋转蒸发仪上减压旋转蒸发除去氯仿(水浴温度不超过40℃)。若样品中有少量水，滴入少量苯再减压旋转蒸发至获得干燥的总脂样品。
[0072]
3)收集有机相，旋转蒸发后，溶于250μl氯仿-甲醇(2:1，v/v)，4℃冰箱保存备用。
[0073]
(3)极性脂的tlc检测：
[0074]
1)tlc薄板的活化：将10cm
×
10cm的硅胶板(merck公司，25tlc aluminium sheets
[0075]
20cm
×
20cm silica gel 60f254)在110℃烘箱活化1h，取出，冷却。
[0076]
2)点样和展层：用10μl移液器吸取2μl总脂样品点于tlc板上，重复点3次。
[0077]
采用两个密闭层析缸，首先tlc板置于第一个层析缸内展层，第一向展层剂为氯仿∶
[0078]
甲醇∶水(65∶25∶4，v/v)，溶媒展至顶部后取出薄板吹干。再将薄板放入第二个层析缸，第二向展层剂为氯仿∶甲醇∶乙酸∶水(80∶12∶15∶4，v/v)，按与第一向垂直的方向上行，溶媒展至顶部，取出薄板吹干备用。
[0079]
3)薄板显色：
[0080]
检测全脂：磷钼酸显色剂喷洒至tlc板完全湿润，100℃加热5-8min，待清晰斑点显出，立即在扫描仪上扫描tlc板，记录结果。如图4所示，菌株极性脂包括：二磷脂酰甘油(dpg)、磷脂酰甘油(pg)、卵磷脂(pc)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰二甲基乙醇胺(pde)和一个未知的磷脂(pl)。
[0081]
实施例十：neorhizobium glycine ec2-8结瘤回接验证及对大豆生长的促进效果
[0082]
将neorhizobium glycine ec2-8菌株接种于yma液体培养基中，28℃振荡培养48h后，获得菌悬液。将菌悬液离心，向其中加入无菌水，在od600条件下，制成od值为1的菌悬液，将大豆种子用酒精浸泡7分钟后用无菌水冲洗2遍，用上述od值为1的菌悬液浸泡大豆种子过夜，同时，以无菌水浸泡种子作为对照，第二天将对照种子和用菌液浸泡的种子播种在灭菌蛭石中，三次重复，在幼苗生长过程中浇灌灭菌水和无氮营养液(cacl2·
2h2o 0.13g/l,mgso4·
7h2o,0.12g/l,kh2po40.1g/l,na2hpo40.3g/l,fe citrate 0.005g/l,h3bo30.002g/l,mnso40.001g/l)，在生长第2周向浸种处理的幼苗生长盆中浇灌50mlod600＝1的菌液，于幼苗生长第24天收获大豆地上植株，测量植株鲜重和干重，对根部进行扫描，测量根长、根体积和根表面积。结果显示，菌株neorhizobium glycine ec2-8可侵染大豆根部并形成有效根瘤(附图5)，还可明显增加大豆根长、根表面积和根体积，以及地上鲜重和干重(表8)。
[0083]
表8neorhizobiumglycineec2-8对大豆生长的作用
[0084][0085]
实施例十一：neorhizobium glycine ec2-8全基因组测序及结瘤基因分析
[0086]
将菌株neorhizobium glycine ec2-8接种于yma液体培养基中，28℃振荡培养72h后，获得菌悬液。将菌悬液离心，弃掉上清后用无菌水洗涤再次离心，弃掉上清，获得纯净的菌体，然后按照基因组dna纯化试剂盒(promega)说明书对菌体进行基因组dna提取。纯化的基因组dna采用tbs-380荧光仪(turner biosystems inc.，sunnyvale，ca)进行定量。高质量的dna(od260/280＝1.8～2.0，dna总量≥5μg，浓度≥60ng/μl)用于建库测序，具体的测序委托华大基因完成。测序结束后，对原始数据进行质控处理过滤掉低质量reads，保留高质量reads。利用canu(https://canu.readthedocs.io/en/latest/)对样品质控之后的有效数据进行基因组组装。将reads比对到组装好的基因组序列，统计组装结果的测序深度分布情况，评估拼接结果质量。然后将原始数据比对到组装结果的序列，利用arrow软件进行组装结果的优化，将错误组装区域进行校正。结果显示菌株neorhizobium glycine ec2-8的基因组大小为6.77mbp，gc含量为61.34％，在同源基因族数据库(database ofclusters of orthologous genes，cogs)对基因功能进行比对注释后，可以注释6819个基因(表9)。
[0087]
使用ezbiocloud网站(https://www.ezbiocloud.net/tools/ani)计算菌株neorhizobium glycine ec2-8与最相似菌株的平均核苷酸一致性(average nucleotide identity,ani)。结果如表10所示，neorhizobium glycine ec2-8与最相似菌株的ani值界
于80.62％-88.67％，根据同一物种的ani临界值需大于95％的界定，再次说明neorhizobium glycine ec2-8属于neorhizobium的一个新种。
[0088]
表9neorhizobiumglycine ec2-8基因组特征。
[0089][0090]
表10neorhizobium glycine ec2-8与相似菌株ani值
[0091][0092][0093]
结合系统发育分析，将上述neorhizobium glycine ec2-8的形态学、生理生化特征、细胞化学组分分析、分子学分析与图2所示的系统进化树上亲缘关系最相近的菌株进行比较，进一步表明neorhizobium glycine ec2-8与同一个属分类水平下的不同种确实存在差别(表11)，可以确定其为该属的一个新种。
[0094]
表11neorhizobiumglycineec2-8与同一个属分类水平下的不同种性质比较
[0095]
[0096][0097]
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种根瘤菌(neorhizobiumglycine)ec2-8，其特征在于，其保藏编号为cctccno：m2022709。2.一种根据权利要求1所述的根瘤菌在促进大豆生长中的应用。3.一种根据权利要求1所述的根瘤菌在增加大豆根长、根表面积和根体积，以及增加大豆地上部分鲜重和干重过程中的应用。4.一种包含权利要求1所述根瘤菌的培养物或其加工物。5.一种大豆生长调节剂，含有权利要求1所述的根瘤菌、权利要求4所述的培养物或其加工物。6.一种促进大豆生长的方法，其特征在于，将权利要求1所述的根瘤菌进行发酵，获得发酵液，将大豆种子浸入所述发酵液内进行预处理。7.一种促进大豆生长的方法，其特征在于，将权利要求1所述的根瘤菌进行发酵，获得发酵液，将所述发酵液浇灌大豆根部。8.根据权利要求7所述的促进大豆生长的方法，其特征在于，将所述发酵液浇灌大豆幼苗根部。

技术总结
本发明公开了一株从大豆根瘤内分离纯化获得的一株Neorhizobium属根瘤菌及其应用，经生理生化测定和系统发育分析，该菌是Neorhizobium属的一个新种，并将其命名为NeorhizobiumglycineEC2-8。菌株回接实验表明，该根瘤菌能够侵染大豆根部并形成有效结瘤，并可促进大豆生长。并可促进大豆生长。并可促进大豆生长。


技术研发人员：于镇华 李彦生 龙永 刘长锴 胡岩峰 王新珍 毛梦凡
受保护的技术使用者：中国科学院东北地理与农业生态研究所农业技术中心
技术研发日：2023.02.08
技术公布日：2023/7/31