一株解淀粉芽孢杆菌及其应用

1.本发明属于微生物应用领域，具体涉及本发明涉及生防菌剂技术领域中一株防病促生的解淀粉芽孢杆菌及其应用。


背景技术：

2.真菌病害频发是影响果蔬作物生产的主要因素之一，化学防治是主要的防控措施，但易造成农药残留、生态环境污染以及病原菌抗药性问题出现。生物防治具有环境友好、生态安全、病原菌不易产生抗药性等特点，在农业生产上逐渐被推广应用。病害的生物防治包括微生物菌剂、植物诱导剂的使用等，其中微生物菌剂种类主要包括细菌、真菌和放线菌，芽孢杆菌(bacilus spp.)是内生芽孢的革兰氏阳性细菌，也是目前生防细菌中研究较多的一类，主要包括解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)、蜡状芽孢杆菌(b.cereus)、枯草芽孢杆菌(b.subtilis)、多粘芽孢杆菌(b.polymyxa)等。其中解淀粉芽孢杆菌具有生长快、贮藏期长、易产生抗逆芽孢等特点，使用后能够在寄主表面定殖和大量繁殖，形成防护层，阻断多种病原菌的侵染，因此解淀粉芽孢杆菌也是现在生物防治的一个研究热点。
3.解淀粉芽孢杆菌的生物防治机制主要包括两种，其一为促进植物生长，其二为产生次级代谢产物，fzb42是该种属中研究最多的1株菌株，已被abitep gmbh公司作为一种生物化肥用于商业生产。目前筛选具有高拮抗活性的微生物，开发成可逐步替代化学农药的新型微生物产品对于果蔬作物的病害防控具有重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明涉及一株具有防病促生功能的解淀粉芽孢杆菌及其应用。
5.本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(bacilus amyloliquefaciens)bj-10菌株，已于2021年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmcc no.22613。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(bacilus amyloliquefaciens)bj-10分离自土壤。所述解淀粉芽孢杆菌bj-10的菌落呈淡黄色，不透明，表面隆起有褶皱，边缘不规则。
6.本发明提供了解淀粉芽孢杆菌(bacilus amyloliquefaciens)bj-10对植物病原真菌葡萄白粉病菌、葡萄溃疡病菌、葡萄炭疽病菌、葡萄黑根病菌、葡萄蔓枯病菌、番茄早疫病菌、番茄灰霉病菌、辣椒疫霉病菌、辣椒枯萎病菌、草莓立枯丝核菌、草莓疫霉菌等的抑制作用。
7.本发明提供了解淀粉芽孢杆菌(bacilus amyloliquefaciens)bj-10发酵液的制备及在防治葡萄白粉病、葡萄灰霉病中的应用。
8.本发明提供了解淀粉芽孢杆菌(bacilus amyloliquefaciens)bj-10在促进黄瓜、葡萄生长方面的应用。
9.本发明提供了解淀粉芽孢杆菌bj-10的获得与鉴定，所述获得方法包括以下步骤：
10.1)将从北京昌平菜园采集的土壤样品研细；
11.2)将研细的土样放入装有无菌水的离心管中震荡得到土壤悬浮液；
12.3)将土壤悬浮液梯度稀释，得到不同浓度的土壤悬浮液；
13.4)选取浓度为105、106和107的土壤悬浮液，加入到na培养基平板上进行涂布处理，放到28℃培养箱中培养，得到菌落；
14.5)挑选形态不一的单菌落进行划线培养，24小时后得到相应菌落，其中长势旺盛者命名为bj-10；
15.所用培养基配方：牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠10g、琼脂20g、超纯水1000ml。
16.对上述分离的菌株bj-10，通过生物学特性观察，进行形态鉴定，方法如下：观察菌落的形态、大小、凹凸度、边缘、革兰氏染色等，对该菌16s rdna序列进行分析和系统发育树构建。
17.所述的解淀粉芽孢杆菌在制备菌剂或微生物菌肥中的应用也属于本发明的保护范围；
18.所述菌剂或微生物菌肥具有如下功能：
19.1)促进植物生长；
20.2)抑制植物病原菌；
21.3)防治植物病害。
22.所述植物病原菌为葡萄溃疡病菌(lasiodiplodia citricola)、葡萄炭疽病菌(colletotrichum viniferum)、葡萄黑根病菌(dactylonectria macrodidyma)、葡萄蔓枯病菌(diaporthe eres)、番茄早疫病菌(alternaria solani)、玉米大斑病菌(exserohilum turcicum(pass.)leonay et suggs)、辣椒疫霉菌(phytophora capsicileonia)、辣椒镰刀菌(fusarium oxysporum f.sp.capsicum)、番茄灰霉病菌(botrytis cinerea)、草莓疫霉菌(pytophthora cactorum)、草莓立枯丝核菌(rhizoctonia solani)、葡萄白粉病菌(erysiphe necator)中的一种或多种。
23.所述促进植物生长体现在植物株高、鲜重、干重增长；所述植物包括黄瓜和/或葡萄。
24.本发明还提供一种菌剂，所述菌剂的活性成分为上述的解淀粉芽孢杆菌；所述菌剂为以下任一种菌剂：
25.1)促进植物生长的菌剂；
26.2)抑制植物病原菌的菌剂；
27.3)防治植物病害的菌剂。
28.本发明还提供一种微生物菌肥，所述微生物菌肥的活性成分为权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌；
29.所述微生物菌肥具有如下功能：
30.1)促进植物生长；
31.2)抑制植物病原菌；
32.3)防治植物病害。
33.上述解淀粉芽孢杆菌为活性成分的菌剂的制备方法，其特征在于包括：
34.a：菌株活化：将菌株bj-10用接种针以平板划线法于lb培养基平板上划线接种，放
置于培养箱中28℃恒温培养2d，得到活化菌株；
35.b：种子液培养：用灭菌牙签挑取单菌落接种于lb液体培养基中，放置于全温震荡培养箱中28℃、180rpm摇培12h，得到种子液；
36.c：发酵：将种子液倒入装液量100ml/500ml的发酵培养基的三角瓶中，28℃、180rpm震荡培养72h，得到发酵液。
37.8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述的a步骤中lb培养基平板为琼脂培养基；所述的b步骤中液体培养基为酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，超纯水1l，ph值为6.5～8.0。
38.9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的发酵培养基为麦芽糖20g，蛋白胨10g，caco
3 10g，nahpo
3 2g，kh2po
3 1g，超纯水1l。
39.10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌bj-10的发酵液中解淀粉芽孢杆菌bj-10活菌数含量为3.0
×
108～2.0
×
109cfu/ml。
40.所述的解淀粉芽孢杆菌经发酵培养获得的发酵液。所述发酵液如下方法制备：
41.(1)将解淀粉芽孢杆菌接种于lb培养基，于28℃下培养24h，获得活化菌株；lb培养基组成：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂20g。
42.(2)将步骤(1)活化菌株接入lb液体培养基中，于28℃、180r/min震荡培养12h，获得种子液；所述液体培养基组成：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，溶剂为水；
43.(3)将步骤(2)所得种子液体积浓度10％接种量接种于麸皮液体发酵培养基中，180r/min震荡培养72h，获得发酵液；
44.所述麸皮液体培养基组成：麦芽糖20g、蛋白胨10g、麸皮10g、caco
3 10g、nahpo
3 2g、khpo
3 1g，溶剂为水，ph7.0-7.4。
45.进一步，所述微生物菌剂中解淀粉芽孢杆菌菌体含量为2
×
108～2
×
109cfu/ml。
46.与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
47.(1)上述菌剂为下述任一一种菌剂：
48.1)产生淀粉酶的菌剂；
49.2)产生蛋白酶的菌剂；
50.3)产生纤维素酶的菌剂；
51.4)产生淀粉酶的菌剂；
52.5)抑制植物病原真菌的菌剂；
53.6)防治植物病原真菌病害的菌剂；
54.7)促进植物生长的菌剂；
55.所述植物病原菌为植物病原真菌葡萄白粉病菌、葡萄溃疡病菌、葡萄炭疽病菌、葡萄黑根病菌、葡萄蔓枯病菌、番茄早疫病菌、番茄灰霉病菌、辣椒疫霉病菌、辣椒枯萎病菌、草莓立枯丝核菌、草莓疫霉菌等所述防治植物真菌病害为葡萄白粉病、葡萄灰霉病。
56.所述植物促进植物生长体现在植物株高、鲜重、干重增长；所述植物包括但不限于黄瓜、葡萄。
57.室内盆栽试验表明浓度为1
×
107cfu/ml bj-10发酵液3次施药后对葡萄白粉病防治效果达78.06％。田间试验表明3次施药后对葡萄白粉病防治效果最高达72.81％。田间试验表明2次施药后对葡萄灰霉病防治效果最高达73.06％
58.本发明的解淀粉芽孢杆菌bj-10兼具防病促生功能，对葡萄白粉病菌、葡萄溃疡病菌、葡萄炭疽病菌、葡萄黑根病菌、葡萄蔓枯病菌、番茄早疫病菌、番茄灰霉病菌、辣椒疫霉病菌、辣椒枯萎病菌、草莓立枯丝核菌、草莓疫霉菌等具有明显的拮抗作用，其发酵液能显著促进葡萄、黄瓜等的幼苗生长并提高产量。此外，本发明的解淀粉芽孢杆菌bj-10对葡萄白粉病有较好的防治效果，大田实际防效为69.34％～72.81％，与市面上4％嘧啶核苷类抗菌素的防效无显著性差异；同时解淀粉芽孢杆菌bj-10对葡萄灰霉病有较好的防病效果，大田实际防效为71.65％～73.06％，与对照药剂50％咯菌腈可湿性粉剂防治效果无极显著性差异，可开发为集防病促生为一体的菌肥与微生物农药制剂。
附图说明
59.图1解淀粉芽孢杆菌bj-10的菌落形态。
60.图2基于16s rdna序列构建的解淀粉芽孢杆菌bj-10系统发育树。
61.图3为bj-10淀粉酶检测结果。
62.图4为bj-10蛋白酶检测结果。
63.图5为bj-10纤维素酶检测结果。
64.图6为bj-10脂肪酶检测结果,左图为大肠杆菌，右图为bj-10。
65.图7为bj-10甲基红检测结果。
66.图8显示葡萄糖发酵检测结果。
67.图9显示蔗糖发酵检测结果。
68.图10显示乳糖发酵检测结果。
69.图11显示甘露醇发酵检测结果。
70.图12显示肌醇发酵检测结果。
71.图13解淀粉芽孢杆菌对温室盆栽葡萄白粉病防治效果图。
72.图14解淀粉芽孢杆菌对黄瓜促生效果图。
73.图15解淀粉芽孢杆菌对葡萄促生效果图。
74.本发明涉及的菌株保藏说明如下：
75.菌种名称：解淀粉芽孢杆菌
76.分类名：bacilus amyloliquefaciens
77.保藏机构：中国科学院微生物研究所
78.保藏机构简称：cgmcc
79.地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
80.保藏日期：2021年05月26日
81.保藏中心登记入册编号：cgmcc no.22613
具体实施方式
82.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但这些实施例仅作为说明，本发明的保护范围并不仅限于此。
83.下述实验中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
84.下述实验中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
85.本发明所述的芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌(bacilus amyloliquefaciens)bj-10，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏日：2021年05月26日，保藏编号：cgmcc no.22613。所述解淀粉芽孢杆菌属于细菌界，后壁菌门，杆菌纲，芽孢杆菌目，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属。
86.本发明所述以芽孢杆菌为活性成分的菌剂的制备方法包括：
87.(1)将解淀粉芽孢杆菌接种于lb培养基，于28℃下培养24h，获得活化菌株；lb培养基组成：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂20g。
88.(2)将步骤(1)活化菌株接入lb液体培养基中，于28℃、180r/min震荡培养12h，获得种子液；所述液体培养基组成：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，溶剂为水；
89.(3)将步骤(2)所得种子液体积浓度10％接种量接种于麸皮液体发酵培养基中，180r/min震荡培养72h，获得发酵液。
90.所述麸皮液体培养基组成：麦芽糖20g、蛋白胨10g、麸皮10g、caco
3 10g、nahpo
3 2g、khpo
3 1g，溶剂为水，ph7.0-7.4。
91.供试植物病原菌：葡萄白粉病菌；葡萄溃疡病菌；葡萄炭疽病菌；葡萄黑根病菌；葡萄蔓枯病菌；番茄灰霉病菌；番茄早疫病菌；玉米大斑病菌；辣椒疫霉病菌；辣椒镰刀菌；草莓疫霉菌；草莓立枯丝核菌。
92.实施例1解淀粉芽孢杆菌(bacilus amyloliquefaciens)bj-10的分离与鉴定
93.(一)菌株bj-10的分离
94.将来自北京昌平地区的土壤样品室温晾干后研磨过筛，称取10g研磨过筛的土壤样品，加入90ml无菌水充分震荡获得土壤悬浮液，即为土壤样品10-1
的稀释液，而后摇匀后梯度稀释至10-5
、10-6
和10-7
。取100μl不同梯度的稀释液均匀涂布于na平板上，每个浓度梯度重复3皿，在28℃恒温下培养48h。从平板上挑取不同培养性状的单菌落，继续在na平板上划线纯化，获得细菌纯培养，编号并保存。
95.(二)菌株bj-10的鉴定
96.1、形态学特征：bj-10的形态如图1所示，菌落呈淡黄色，不透明，表面隆起有褶皱，边缘不规则。
97.2、生理生化特征：
98.2.1淀粉酶的检测
99.检测培养基：淀粉酶选择培养基(lb培养基+1.0％可溶性淀粉)：蛋白胨10g，酵母膏5g，nacl 5g，可溶性淀粉10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，ph7.8。
100.检测方法：取10μl摇培的待测菌株bj-10和大肠杆菌对照菌株(不具有淀粉水解酶活性)滴加到检测平板上，晾干后28℃恒温培养24-28h，然后用稀碘液覆盖染色，清水冲洗，观察透明圈大小。
101.检测结果：如图3所示，可以看出菌株bj-10周围有透明圈产生，说明其能够产生淀粉酶，淀粉水解阳性。大肠杆菌周围无透明圈产生，不具有淀粉水解酶活性。
102.2.2蛋白酶检测
103.检测平板：含10％的脱脂牛奶水琼脂培养基(琼脂粉，1g/100ml水)，选用脱脂牛奶，先微波炉加热，如果有脂肪膜则去掉，再用移液枪吸取10ml加到100ml已灭菌冷凉的水琼脂培养基内。
104.检测方法：将待测菌株bj-10在lb培养基中摇培过夜，取10μl滴加到检测平板上，晾干后28℃恒温培养，12h观察蛋白降解圈。
105.检测结果：如图4所示，可以看出，菌株bj-10周围有较明显的透明圈产生，说明其能够产生蛋白酶，蛋白酶水解阳性。大肠杆菌周围也有较明显的透明圈产生，也具有一定的蛋白酶水解活性。
106.2.3纤维素酶检测
107.检测平板：半lb培养基(碳源、氮源的量减半)，加0.2％的羧甲基纤维素钠。
108.检测方法：将待测菌株bj-10在lb培养基中摇培过夜，取10μl滴加到检测平板上，晾干后于28℃恒温培养24h，洗掉菌落，加入1g/l刚果红溶液染色1h，然后用1m nacl溶液浸泡洗涤2次进行脱色，每次浸泡30min，观察菌落周围有无纤维素水解圈。
109.检测结果：如图5所示，可以看出，菌株bj-10周围能够产生白色透明圈，说明它们都能产生纤维素酶，纤维素酶水解阳性。大肠杆菌的周围也能产生透明圈，也具有纤维素水解酶活性。
110.2.4脂肪酶检测
111.检测培养基：油脂培养基：蛋白胨10g、牛肉膏5g、花生油或香油10g、1.6％中性红水溶液1ml、琼脂15g、蒸馏水1000ml、ph7.2。
112.检测方法：配制油脂培养基，灭菌后备用。倒平板前，将油脂培养基充分震荡使油脂均匀分布，再倒入培养皿中。平板凝固后将待测菌bj-10滴加到平板上，晾干后28℃恒温培养24h。观察平板底层的菌落，如果出现红色斑点，即说明脂肪酸被水解，为阳性反应。
113.检测结果：如图所示6，可以看出，大肠杆菌和菌株bj-10的平板底层的菌落周围未出现红色斑点，不能水解脂肪酸，不能产生脂肪酸酶，脂肪酶水解阴性。
114.2.5甲基红检测
115.检测培养基：葡萄糖蛋白胨液体培养基：蛋白胨5.0g，葡萄糖5.0g，k2hpo45.0g，蒸馏水1000ml，调节ph至7.0～7.2。每管4～5ml，115℃灭菌20min。
116.甲基红指示剂：0.1g甲基红溶于300ml95％乙醇中，再加入蒸馏水200ml。
117.检测方法：将活化好的菌种接于葡萄糖蛋白胨液体培养基中，每个菌接种6管，6管作为不接菌对照，置于37℃培养4～7d。取葡萄糖蛋白胨液体培养基各3管(重复)，于管中滴加甲基红指示剂2～3滴，充分摇匀，观察颜色变化。若培养液呈红色，为m.r.阳性反应；如呈黄色，即阴性反应。
118.检测结果：如图所示7，接种解淀粉芽孢杆菌bj-10的试管中溶液变为黄色，为阴性反应。
119.2.6糖醇发酵实验
120.检测培养基：糖醇发酵基础培养基：蛋白胨10g、nacl 5g、蒸馏水1000ml，调ph7.6，加入1.6％溴甲酚紫乙醇溶液。
121.检测方法：糖醇发酵培养基按照分别加入葡萄糖(1％)、乳糖(0.75％)、蔗糖(0.75％)、甘露醇(0.75％)、肌醇(0.75％)，分装试管后，每管放入一杜氏发酵管，将待测菌株bj-10接入含糖培养液中，以不接种的培养液作为对照，30℃培养7d，观察各试管颜色的变化及杜氏发酵管中有无气泡产生。指示剂溴甲酚紫的指示范围为ph5.3(黄色)～6.8(紫色)。
122.检测结果：
123.葡萄糖发酵实验结果如图8所示，从图中可以看出，bj-10的试管培养基颜色由紫色变为黄色，杜氏管中无气泡产生，说明bj-10能分解葡萄糖，产酸不产气。
124.蔗糖发酵实验结果如图9所示，从图中可以看出，bj-10试管培养基颜色由紫色变为黄色，杜氏管中无气泡产生，说明bj-10能够分解蔗糖，产酸不产气。
125.乳糖发酵实验结果如图10所示，从图中可以看出，bj-10试管培养基颜色没有变化，杜氏管中无气泡产生，说明bj-10不能分解乳糖。
126.甘露醇发酵实验结果如图11所示，从图中可以看出，bj-10的试管培养基颜色由紫色变为黄色，杜氏管中无气泡产生，说明bj-10能够分解甘露醇，产酸不产气。
127.肌醇发酵实验结果如图12所示，从图中可以看出，bj-10试管培养基颜色由紫色变为黄色，杜氏管中无气泡产生，说明bj-10不能分解肌醇。
128.(三)、菌株bj-10分子鉴定：
129.1.1 16s rdna扩增
130.以菌株bj-10总dna作为模版，采用细菌16s rdna区通用引物27f和1492r进行pcr扩增，引物序列为：
131.27f：5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’132.1492r：5
’‑
taccttgttacgactt-3’133.pcr反应体系为(50μl)：25μl 2
×
taq pcr master mix，21μlddh2o，1μl27f，1μl 1492r，2μl dna模版。
134.pcr扩增反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，54℃退火30s72℃延伸90s，34个循环；72℃延伸8min；12℃终止反应。
135.1.2pcr产物检测
136.将扩增的菌株bj-10的16s rdna序列用1％的琼脂糖凝胶电泳法进行电泳检测，然后用凝胶成像系统拍照保存并分析结果。
137.1.316s rdna的序列分析
138.将菌株bj-10的16s rdna基因pcr扩增产物送到北京擎科生物科技有限公司进行测序，拼接输出全序列，将菌株bj-10的16s rdna经blast同源序列比对，然后采取邻接法构建系统发育树。解淀粉芽孢杆菌bj-10的16srdna序列见序列表中序列1。
139.1.4系统发育树方法构建
140.从genbank中下载相关菌株的序列，使用mega 5.2软件对菌株bj-10的序列与下载的相关菌株16s rdna序列进行同源性比对，然后采取邻接法构建系统树。基于16s rdna序列结果blast结果构建的解淀粉芽孢杆菌bj-10系统发育树见图2。
141.实施例2抑菌活性测定
142.(一)解淀粉芽孢杆菌bj-10对葡萄白粉病菌的室内生物活性测定1、将田间采集的病叶用去离子水洗脱白粉病菌孢子、过滤，离心(1000r/min)5min，倒去上清液，加入去离子水，再离心。最后用去离子水将孢子重悬浮至每毫升1
×
106个孢子，并加入0.5％葡萄糖溶液。
143.2、在无菌操作条件下，根据试验处理将预先融化的灭菌培养基取50ml加入无菌锥形瓶中，从低浓度到高浓度依次吸取500μl药液，分别加入上述锥形瓶中，充分摇匀。等量倒
入3个直径为9cm的培养皿中，制成相应浓度的含药平板。各药剂相应浓度梯度及抑制率见附表。
144.3、试验设不含药剂的处理做空白对照，每处理3个重复。
145.4、每处理各重复随机观察3个以上视野，调查孢子总数不少于200个，分别记录萌发数和孢子总数。孢子芽管长度大于孢子短半径视为萌发。试验结果见表1。
146.表1解淀粉芽孢杆菌bj-10对葡萄白粉病菌的室内生物活性测定结果
147.药剂毒力回归方程相关系数ec
50
bj-10发酵液y＝0.7492x-0.88060.99437.07
×
107cfu/ml42.4％唑醚
·
氟酰胺悬浮剂y＝1.047x+4.89640.97251.26μg/ml80％硫磺水分散粒剂y＝2.114x+7.48880.90090.07μg/ml20％吡噻菌胺悬浮剂y＝0.6716x+4.64670.98323.36μg/ml
148.(二)bj-10菌悬液与病原菌的拮抗作用
149.采用对峙培养法：以11种植物病原真菌(玉米大斑病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、葡萄炭疽病菌、葡萄溃疡病菌、葡萄黑根病菌、葡萄蔓枯病菌、草莓立枯丝核菌菌、草莓疫霉病菌、辣椒枯萎病菌、辣椒疫霉病菌)为靶标，25℃、黑暗培养3-7d沿pda平板边缘打取直径为4mm的菌饼，放置在新的pda平板中央，在距离中央3cm处等距离接入直径为4mm的灭菌滤纸片，吸取5μl培养好的bj-10菌悬液润湿滤纸片，以滴加5μl无菌水的滤纸片为对照，重复3次，25℃、黑暗培养。待对照组中的病原菌菌丝长到滤纸片处时，测量菌落直径和抑菌带宽度，计算抑菌率。结果见表2。
150.抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径
×
100％
151.表2对植物病原真菌的抑菌活性的测定结果
[0152][0153][0154]
通过对峙培养法，测定bj-10对11种植物病原真菌的抑菌活性，测定结果如表2所示，bj-10对11种病原真菌菌丝的生长具有不同程度的抑制作用，其对玉米大斑病菌菌丝生长的抑制作用最强，抑菌率达77.27％，抑菌圈宽度为19.32mm，对番茄灰霉病菌、葡萄蔓枯病菌、葡萄炭疽病菌、辣椒枯萎病菌也具有较好的抑菌效果，抑菌率为46.45％-58.29％，抑
菌圈宽度为10.20-14.57mm，对番茄早疫病菌、草莓立枯丝核菌以及辣椒疫霉病菌、草莓疫霉病菌的抑制作用一般，抑菌率在35％以下。
[0155]
实施例3解淀粉芽孢杆菌bj-10发酵液对葡萄白粉病的防治效果(温室盆栽法)
[0156]
试验共设置解淀粉芽孢杆菌bj-10发酵液1
×
105cfu/ml、1
×
106cfu/ml、1
×
107cfu/ml 3个浓度梯度，清水作为空白对照；每处理6盆葡萄苗(马瑟兰)，对葡萄苗进行叶面喷雾处理，每7天进行一次叶面喷雾，共进行3次，末次处理后7天调查防病效果。试验结果见表3。
[0157]
病害分级标准：0级无病斑；1级病斑面积占整个叶面积的5％以下；3级病斑面积占整个叶面积的6％～10％；5级病斑面积占整个叶面积的11％～20％；7级病斑面积占整个叶面积的21％～40％；9级病斑面积占整个叶面积的40％以上。
[0158]
病情指数计算方法：
[0159][0160]
表3解淀粉芽孢杆菌bj-10对葡萄白粉病的防治效果(温室盆栽法)
[0161][0162]
表中不同大小写字母表示处理间差异显著及极显著(dmrt法，p＜0.05，p＜0.01)
[0163]
由温室盆栽法试验结果可知，解淀粉芽孢杆菌bj-10发酵液对盆栽葡萄白粉病防治效果较好，平均防治效果在51.09％～78.06％，田间自然条件与室内条件不同，发酵液是否能够在实际生产中应用需进一步田间试验验证。效果图见图13。
[0164]
实施例4解淀粉芽孢杆菌bj-10发酵液对葡萄白粉病的田间防治效果
[0165]
试验共设置5个处理，解淀粉芽孢杆菌bj-10发酵液浓度为1
×
105cfu/ml、1
×
106cfu/ml、1
×
107cfu/ml，4％嘧啶核苷素水剂作为对照药剂，清水作为空白对照，分别于2021年09月30日进行第一次喷雾施药，10月08日进行第二次喷雾施药，10月15日进行第三次喷雾施药，共施药3次。2021年10月22日(第3次药后7天)进行第一次调查防病效果，2021年10月29日(第3次药后14天)进行第二次调查，共进行两次调查。试验结果见表4。
[0166]
病害分级标准：0级无病斑；1级病斑面积占整个叶面积的5％以下；3级病斑面积占整个叶面积的6％～10％；5级病斑面积占整个叶面积的11％～20％；7级病斑面积占整个叶面积的21％～40％；9级病斑面积占整个叶面积的40％以上。
[0167]
病情指数计算方法：
[0168][0169]
表4解淀粉芽孢杆菌bj-10对葡萄白粉病的田间防治效果
[0170][0171]
注：表中不同大小写字母表示处理间差异显著及极显著(dmrt法，p＜0.05，p＜0.01)
[0172]
由末次施药后7天调查结果可知，解淀粉芽孢杆菌bj-10发酵液对葡萄白粉病有较好的防治效果，平均防治效果在69.34％～72.81％，4％嘧啶核苷类抗菌素水剂对葡萄白粉病防治效果为73.16％，解淀粉芽孢杆菌bj-10发酵液3个浓度梯度与对照药剂4％嘧啶核苷类抗菌素水剂无显著性差异；由末次施药后14天调查结果可知，解淀粉芽孢杆菌bj-10发酵液对葡萄白粉病平均防治效果在66.61％～70.23％，4％嘧啶核苷类抗菌素水剂对葡萄白粉病防治效果为70.83％，解淀粉芽孢杆菌bj-10发酵液3个浓度梯度与对照药剂4％嘧啶核苷类抗菌素水剂无显著性差异。
[0173]
实施例5解淀粉芽孢杆菌bj-10发酵液对葡萄灰霉病的防治效果
[0174]
试验共设置5个处理，解淀粉芽孢杆菌bj-10发酵液浓度为1
×
106cfu/ml、1
×
107cfu/ml，50％咯菌腈可湿性粉剂和2亿cfu/g哈茨木霉菌可湿性粉剂作为对照药剂，清水作为空白对照，分别于2022年06月08日进行第一次喷雾施药，06月18日进行第二次喷雾施药共施药2次。2022年09月16日进行防病效果调查。试验结果见表5。
[0175]
每小区调查全部果穗，记录果穗受害程度，计算病情指数和防治效果。
[0176]
果穗分级方法：0级无病斑；1级病斑面积占整个果穗面积的5％以下；3级病斑面积占整个果穗面积的6％～15％；5级病斑面积占整个果穗面积的16％～25％；7级病斑面积占整个果穗面积的26％～50％；9级病斑面积占整个果穗面积的51％以上。
[0177]
病情指数计算方法：
[0178][0179][0180]
表5bj-10防治葡萄灰霉病试验调查结果
[0181][0182]
注：表中不同大小写字母表示处理间差异显著及极显著(dmrt法，p＜0.05，p＜0.01)
[0183]
由调查结果可知，解淀粉芽孢杆菌bj-10发酵液对葡萄灰霉病有较好的防治效果，平均防治效果在71.65％～73.06％，对照药剂2亿cfu/g哈茨木霉菌可湿性粉剂对葡萄灰霉病防治效果为78.41％，50％咯菌腈可湿性粉剂对葡萄灰霉病防治效果为74.82％。0.05水平上，2亿cfu/g哈茨木霉菌可湿性粉剂对葡萄灰霉病防治效果显著高于解淀粉芽孢杆菌bj-10发酵液2个浓度梯度；0.01水平上，2亿cfu/g哈茨木霉菌可湿性粉剂对葡萄灰霉病防治效果显著高于有效活菌数107cfu/ml解淀粉芽孢杆菌bj-10发酵液，有效活菌数106cfu/ml解淀粉芽孢杆菌bj-10发酵液与对照药剂50％咯菌腈可湿性粉剂无极显著性差异。
[0184]
实施例6解淀粉芽孢杆菌bj-10发酵液对黄瓜、葡萄的促生效果
[0185]
1、菌液制备：用接种环挑取-80℃保存的bj-10的甘油菌，在lb培养基上进行划线培养。用牙签挑取lb培养基划线得到的单菌落，置于1ml的lb液体培养基中，28℃、180rpm/min的条件下震荡培养8～10h获得种子液，再以10:100的比例转接到150ml发酵培养基中(麦芽糖20g/l、蛋白胨10g/l、麸皮10g/l、caco3 10g/l g、nahpo
3 2g/l、khpo
3 1g/l，ph7.0-7.4)，28℃、180rpm/min震荡培养72h，获得发酵液，浓度为8
×
108cfu/ml。将发酵液4℃、12,000rpm离心10min，取上清，过0.22μm细菌滤膜，获得无菌体的发酵滤液。
[0186]
2、解淀粉芽孢杆菌对黄瓜促生试验
[0187]
分别用清水、发酵滤液100倍稀释液、浓度为8
×
106cfu/ml解淀粉芽孢杆菌发酵液、麸皮培养基100倍稀释液对苗期黄瓜每7天进行灌根处理，共进行3次处理，末次处理后14天对不同条件处理下黄瓜苗叶绿素含量、株高、干重、鲜重等生理指标进行检测，结果见表6。
[0188]
壮苗指数＝(茎粗/株高)
×
全株干质量
[0189]
表6解淀粉芽孢杆菌对黄瓜的促生作用结果
[0190][0191]
注：表中不同大小写字母表示处理间差异显著及极显著(dmrt法，p＜0.05，p＜0.01)
[0192]
结果表明：在稀释100倍时，清水对照、发酵滤液、麸皮培养基与发酵液几个处理之间的生理指标存在显著性差异。几个处理组对黄瓜生长均有明显的促生作用。经不同浓度处理的黄瓜幼苗，株高、鲜重、干重均有明显的提高，其中经浓度为8
×
106cfu/ml解淀粉芽孢杆菌发酵液灌根处理后的黄瓜苗壮苗指数显著高于其他处理，见图14。
[0193]
3、解淀粉芽孢杆菌对葡萄促生试验
[0194]
分别设置浓度为1
×
106cfu/ml、1
×
107cfu/ml解淀粉芽孢杆菌bj-10发酵液、清水作为对照，共3个处理，每处理6盆葡萄苗(马瑟兰)，对葡萄苗进行叶面喷雾处理，每7天进行一次叶面喷雾，共进行3次，末次处理后14天对葡萄苗株高、干重、鲜重等生理指标进行检测，结果见表7。
[0195]
表7解淀粉芽孢杆菌发酵液对葡萄的促生作用结果
[0196]
处理株高(cm)鲜重(g)干重(g)ck14.68
±
0.78c5.01
±
0.16b0.68
±
0.03
b1×
106cfu/ml28.26
±
2.08b8.54
±
2.00a1.28
±
0.09
a1×
107cfu/ml40.63
±
4.30a10.59
±
0.38a1.60
±
0.51a[0197]
注：表中不同大小写字母表示处理间差异显著及极显著差异(dmrt法，p＜0.05，p＜0.01)
[0198]
结果表明：3个处理之间的生理指标存在显著性差异。几个处理组对黄瓜生长均有明显的促生作用。经不同浓度处理的葡萄幼苗，株高、鲜重、干重均有明显的提高，见图15。
[0199]
以上所述实施例仅展示了本发明的几种实施方式，其描述较为具体，但对本发明而言只是说明性的，而非限制性的。对于本领域普通技术人员来说，在不脱离所附权利要求所限定的精神和范围的情况下，可做出许多修改、变化和改进，这些都属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一株解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌名称为解淀粉芽孢杆菌bj-10，已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为为cgmcc no.22613。2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在制备菌剂或微生物菌肥中的应用；所述菌剂或微生物菌肥具有如下功能：1)促进植物生长；2)抑制植物病原菌；3)防治植物病害。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述植物病原菌为葡萄溃疡病菌(lasiodiplodia citricola)、葡萄炭疽病菌(colletotrichum viniferum)、葡萄黑根病菌(dactylonectria macrodidyma)、葡萄蔓枯病菌(diaporthe eres)、番茄早疫病菌(alternaria solani)、玉米大斑病菌(exserohilum turcicum(pass.)leonay et suggs)、辣椒疫霉菌(phytophora capsicileonia)、辣椒镰刀菌(fusarium oxysporum f.sp.capsicum)、番茄灰霉病菌(botrytis cinerea)、草莓疫霉菌(pytophthora cactorum)、草莓立枯丝核菌(rhizoctonia solani)、葡萄白粉病菌(erysiphe necator)中的一种或多种。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述促进植物生长体现在植物株高、鲜重、干重增长；所述植物包括黄瓜和/或葡萄。5.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分为权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌；所述菌剂为以下任一种菌剂：1)促进植物生长的菌剂；2)抑制植物病原菌的菌剂；3)防治植物病害的菌剂。6.一种微生物菌肥，其特征在于，所述微生物菌肥的活性成分为权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌；所述微生物菌肥具有如下功能：1)促进植物生长；2)抑制植物病原菌；3)防治植物病害。7.一种权利要求5所述的解淀粉芽孢杆菌为活性成分的菌剂的制备方法，其特征在于包括：a：菌株活化：将解淀粉芽孢杆菌bj-10用接种针以平板划线法于lb培养基平板上划线接种，放置于培养箱中28℃恒温培养2d，得到活化菌株；b：种子液培养：用灭菌牙签挑取单菌落接种于lb液体培养基中，放置于全温震荡培养箱中28℃、180rpm摇培12h，得到种子液；c：发酵：将种子液倒入装液量100ml/500ml的发酵培养基的三角瓶中，28℃、180rpm震荡培养72h，得到发酵液；解淀粉芽孢杆菌bj-10，已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为为cgmcc no.22613。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述的a步骤中lb培养基平板为琼脂培养基；所述的b步骤中液体培养基为酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，超纯水1l，ph值为6.5～8.0。9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的发酵培养基为麦芽糖20g，蛋白胨10g，caco
3 10g，nahpo
3 2g，kh2po
3 1g，超纯水1l。10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌bj-10的发酵液中解淀粉芽孢杆菌bj-10活菌数含量为3.0
×
108～2.0
×
109cfu/ml。

技术总结
本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌及其应用。本发明的解淀粉芽孢杆菌名称为BJ-10，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22613。该菌株兼具防病促生功能，对葡萄白粉病菌、葡萄溃疡病菌、葡萄炭疽病菌、葡萄黑根病菌、葡萄蔓枯病菌、番茄早疫病菌、番茄灰霉病菌、辣椒疫霉病菌、辣椒枯萎病菌、草莓立枯丝核菌、草莓疫霉菌等具有明显的拮抗作用，其发酵液能显著促进葡萄、黄瓜等的幼苗生长并提高产量。黄瓜等的幼苗生长并提高产量。


技术研发人员：刘梅 宗新颖 燕继晔 李兴红 张玮 周莹 彭军波 邢启凯
受保护的技术使用者：北京市农林科学院
技术研发日：2022.11.29
技术公布日：2023/7/31