一株耐铅锌铜细菌L1及其制备方法和应用

一株耐铅锌铜细菌l1及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物和环境污染治理技术领域，涉及一种耐铅锌铜细菌l1，还涉及该耐铅锌铜细菌l1的制备方法和应用。


背景技术：

2.我国土壤环境状况严峻，无机污染物是土壤污染的主要形式，主要是重金属污染，包括镉、汞、砷、铜、铅、铬、锌和镍8种典型重金属。重金属在土壤中的特性，决定采用何种治理方法。根据土壤中不同的污染成因、种类、程度选择相应的修复技术。不同的修复方法其所带来的修复结果和成本也同。当前，针对于不同污染源导致的重金属污染土壤，当前土壤修复技术有物理修复、化学修复、生物修复。物理和化学修复方法具有一定的局限性，其投资昂贵、成本高、设备复杂且易导致土壤结构受到破坏；生物方法中的微生物修复技术原理是利用某些微生物具有重金属高耐性和高去除能力，减少重金属的迁移，防止重金属进入细胞，降低重金属的生物利用度。微生物修复技术比物理化学方法更具优势，如成本更低，对环境和消费者更安全。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种耐铅锌铜细菌l1，还涉及该耐铅锌铜细菌l1的制备方法和应用，为土壤重金属污染土壤问题提供了菌种资源。
4.本发明所采用的技术方案是，一株耐铅锌铜细菌l1，该菌株命名为不动杆菌(acinetobacter sp.)l1，已于2021年10月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为cgmcc no：23539。
5.耐铅锌铜细菌l1的菌液制备方法，具体为：
6.采用发酵法，将耐铅锌铜细菌l1接种于lb液体培养基中，于30℃条件下，140rpm震荡培养8～10h，并测定其od600值在0.5～1。
7.进一步地，lb液体培养基采用：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15-20g，蒸馏水1000ml，并控制ph为7.2～7.4。
8.耐铅锌铜细菌l1在修复重金属污染土壤中的应用。
9.进一步地，重金属包括铅、铜、锌中的一种或多种。
10.本发明的有益效果是：
11.本发明所提供的耐铅锌铜细菌l1对重金属具有高耐性，铅、锌和铜耐受的最高浓度分别达到2000mg
·
l-1
，2000mg
·
l-1
和750mg
·
l-1
。耐铅锌铜细菌l1在30℃下对复合铅锌铜的去除效果分别能够达到83.31％、57.99％和60.48％。耐铅锌铜细菌l1在不同重金属离子的最佳ph下对复合铅锌铜的去除效果分别能够达到80.06％(ph 8.0)、54.94％(ph 8.0)和63.98％(ph 7.5)。l1在不同重金属离子的最佳去除时间下对复合铅锌铜的去除效果分别能够达到76.14％(36h)、74.07％(48h)和63.83％(48h)。耐铅锌铜细菌l1的菌液极易培
养获得。
附图说明
12.图1是本发明的重金属耐性细菌l1在固体培养基上的菌株图；
13.图2是本发明重金属耐性细菌l1基于16srrna基因序列构建的系统发育树；
14.图3是本发明温度对重金属耐性细菌l1生长的影响的折线图；
15.图4是本发明ph对重金属耐性细菌l1生长的影响的折线图；
16.图5是本发明中不同浓度铅离子对重金属耐性细菌l1生长影响的折线图；
17.图6是本发明中不同浓度锌离子对重金属耐性细菌l1生长影响的折线图；
18.图7是本发明中不同浓度铜离子对重金属耐性细菌l1生长影响的折线图；
19.图8是本发明中不同ph对重金属耐性细菌l1去除重金属铅锌铜的影响图；
20.图9是本发明中不同温度对重金属耐性细菌l1去除重金属铅锌铜的影响图；
21.图10是本发明中不同时间对重金属耐性细菌l1去除重金属铅锌铜的影响图。
22.保藏信息：重金属耐性细菌l1已于2021年10月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为cgmcc no：23539。命名为：不动杆菌(acinetobacter sp.)l1。
具体实施方式
23.下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
24.一株耐铅锌铜细菌l1，该菌株命名为不动杆菌(acinetobacter sp.)l1，已于2021年10月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为cgmcc no：23539。
25.该菌株是从甘肃省陇南市成县毕家山铅锌矿区非根际土壤中分离所得；
26.耐铅锌铜细菌l1的筛选：
27.取5g土壤加入45ml浓度为0.9％的无菌生理盐水中，置于摇床震荡1h，静置后取5ml上清液，转接到pb2+(化合物为pb(no3)2)、zn2+(化合物zncl2)和cu2+(cu2so4)浓度为50mg/l的45ml的培养基中，在温度为30℃下震荡培养48h；取0.1ml菌液梯度稀释为10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
的菌悬液，取10-4-10-6
浓度的菌悬液0.2ml分别涂布在含重金属的固体培养基，置于30℃培养箱中培养，观察细菌的生长状况；若生长状况良好，取5ml重金属浓度50mg/l的菌液转接到100mg/l(pb2+、zn
2+
和cu
2+
)的45ml新鲜培养基中，培养48h。
28.按照上述步骤，重复加大重金属的浓度，依次转接到pb
2+
、zn
2+
浓度为500mg/l、750mg/l、1000mg/l、1500mg/l、2000mg/l，cu
2+
浓度为500mg/l、750mg/l的培养基中，培养48h。取0.1ml菌液(pb
2+
、zn
2+
浓度为2000mg/l，cu
2+
浓度为750mg/l)，用无菌水10-4-10-6
浓度的菌悬液0.2ml分别涂布pb
2+
、zn
2+
和cu
2+
(重金属浓度2000mg/l、2000mg/l和750mg/l)的平板上，重复涂布3个平板划线法进行分离纯化，反复划线培养，直接获得单克隆菌落，观察所的菌落生长情况l1，斜面保存于4℃冰箱中，待用。
29.菌株形态观察和生理生化
30.如图1所示，主要生物学特性为：g-，菌体短杆状，无鞭毛。该菌的菌落形态为圆形、直径为0.5～1mm，不透明，白色，表面光滑，中部微微凹陷，较粘稠，易挑起。
31.耐铅锌铜细菌l1的菌液制备方法，具体为：采用发酵法，将耐铅锌铜细菌l1接种于lb液体培养基中，于30℃条件下，140rpm震荡培养8～10h，并测定其od600值在0.5～1。
32.进一步地，lb液体培养基采用：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15-20g，蒸馏水1000ml，并控制ph为7.2～7.4。
33.如图2所示，耐铅锌铜细菌l1基于16s rrna基因序列构建的系统发育树，获得步骤：
34.用pcr的方法，以总dna为模板，16srrna分子序列为目标序列，对菌种进行鉴定。在pcr反应体系中加入dna模板1.0ul，上游引物27f1ul，下游引物1492r 1ul，taq酶12.5ul，加双蒸水补充至25ul，混匀后置于pcr仪中进行扩增反应。反应程序为94℃变性3min；94℃变性40s，52℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃总延伸10min。
35.pcr产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测，pcr产物送至上海生工公司进行测序；得到的16srrna序列，通过ncbi获取登录号，进行序列相似性比对，确定菌种的物种分类，并用mega7.0构建系统发育树，分析菌株与相似物种的进化关系。综合生理生化特征和分子生物学特性，确定耐铅锌铜细菌l1为不动杆菌(acinetobacter sp.)。
36.耐铅锌铜细菌l1在修复重金属污染土壤中的应用。进一步地，重金属包括铅、铜、锌中的一种或多种。
37.如图3所示，温度对耐铅锌铜细菌l1生长的影响
38.将耐铅锌铜细菌l1分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃的温度下进行培养，在不同时间内测定不同温度下的od600值，结果表明，耐铅锌铜细菌l1的最适生长温度为30℃。当温度低于30℃时，菌株生长情况良好；当培养温度为40℃时，菌株的生长显著受到了抑制。可以看出耐铅锌铜细菌l1的生长温度范围广，在20℃～35℃的环境中能很好的生长，但不能耐高温。
39.如图4所示，ph对耐铅锌铜细菌l1生长的影响
40.在最适温度30℃条件下，分别设置了ph值7.0、ph值7.5、ph值8.0、ph值8.5、ph值9.0；测定不同的ph值下耐铅锌铜细菌l1的od600值，结果为：在ph值为7.0时，耐铅锌铜细菌l1的生长最好；在7.0～9.0的ph范围中，发现耐铅锌铜细菌l1均能得到良好的生长。
41.如图5所示，耐铅锌铜细菌l1对重金属铅的耐受
42.将耐铅锌铜细菌l1以2％接种量接种于含有pb
2+
100mg/l、250mg/l、500mg/l、750mg/l、1000mg/l、1500mg/l和2000mg/l的液体培养基，置于30℃的摇床中以140r/min的转速进行培养，分别测定不同时间内的od600值，观察菌株生长状况。结果表明：pb
2+
浓度为100mg/l和250mg/l时，细胞生长高于对照组，菌株生长优良；在pb
2+
浓度2000mg/l下，耐铅锌铜细菌l1生长受到了严重抑制。
43.如图6所示，耐铅锌铜细菌l1对重金属锌的耐受
44.将耐铅锌铜细菌l1以2％接种量接种于含有zn
2+
100mg/l、250mg/l、500mg/l、750mg/l、1000mg/l、1500mg/l和2000mg/l的液体培养基，置于30℃的摇床中以140r/min的转速进行培养，分别测定不同时间内的od600值，观察菌株生长状况。结果表明：zn
2+
加入抑制了耐铅锌铜细菌l1的生长；zn
2+
浓度在2000mg/l下，耐铅锌铜细菌l1生长受到了严重抑制。
45.如图7所示，耐铅锌铜细菌l1对重金属铜的耐受
46.将耐铅锌铜细菌l1以2％接种量接种于含有cu
2+
100mg/l、250mg/l、500mg/l、750mg/l的液体培养基，置于30℃的摇床中以140r/min的转速进行培养，分别测定不同时间内的od600值，观察菌株生长状况。结果表明：cu
2+
的加入抑制了耐铅锌铜细菌l1的生长；在cu
2+
浓度750mg/l下，耐铅锌铜细菌l1生长受到了严重抑制。
47.重金属的测定方法及其去除率的计算
48.重金属的测定方法：电感耦合等离子光谱仪(icp-ms)
49.重金属的计算公式：
50.co是空白中重金属的浓度，mg/l；ci为实验组中重金属的浓度，mg/l。
51.如图8所示，ph对耐铅锌铜细菌l1去除重金属的影响
52.配制含有复合重金属铅锌铜(500mg/l-500mg/l-100mg/l)的液体培养基，调节ph分别为7.0、75、8.0、8.5、9.0，种子培养液培养时间为24h，菌悬液按照2％的比例加入含重金属的培养基中，在30℃和140r/min条件下培养48h后取样，离心取上清液过0.22um滤膜，测定重金属含量并计算去除率。结果表明，耐铅锌铜细菌l1在ph8.0条件下对重金属pb、zn的去除重金属率最高，分别能够达到80.06％和54.94％；在ph7.5时，对重金属cu的去除率最大，能够达到63.98％。
53.如图9所示，温度对耐铅锌铜细菌l1去除重金属的影响
54.配制含有复合重金属铅锌铜(500mg/l-500mg/l-100mg/l)的液体培养基，调节温度分别为20、25、30、35、40℃，ph为8.0、种子培养液时间为24h，菌悬液按照2％的比例加入含重金属的培养基中，在140r/min条件下培养48h后取样，离心取上清液过0.22um滤膜，测定重金属含量并计算去除率。结果表明，耐铅锌铜细菌l1在30℃下对重金属pb、zn、cu的去除重金属率最高，分别能够达到83.31％、57.99％和60.48％。当在20℃时，耐铅锌铜细菌l1对重金属pb、zn和cu的去除率最低，分别是55.28％、38.04％和43.36％。
55.如图10所示，培养时间对耐铅锌铜细菌l1去除重金属的影响
56.配制含有复合重金属铅锌铜(500mg/l-500mg/l-100mg/l)的液体培养基，调节ph为8.0、种子液时间为24h，菌悬液按照2％的比例加入含重金属的培养基中，在30℃、140r/min条件下培养，设置不同培养时间(6h、12h、24h、36h、48h)取样，离心取上清液过0.22um滤膜，测定重金属含量并计算去除率。结果表明，耐铅锌铜细菌l1培养48h后，对重金属zn和cu的去除重金属率最高，分别能够达到74.07％和63.83％；当培养时间为36h，对重金属pb的去除率最大，能够达到76.14％。此外，培养时间为12、24和36h时，耐铅锌铜细菌l1对重金属zn的去除率无显著变化。

技术特征：
1.一株耐铅锌铜细菌l1，其特征在于，该菌株命名为不动杆菌(acinetobacter sp.)l1，已于2021年10月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no：23539。2.根据权利要求1所述的耐铅锌铜细菌l1的菌液制备方法，其特征在于，具体方法为：采用发酵法，将耐铅锌铜细菌l1接种于lb液体培养基中，于30℃条件下，140rpm震荡培养8～10h，并测定其od600值在0.5～1。3.根据权利要求2所述的耐铅锌铜细菌l1的菌液制备方法，其特征在于，所述lb液体培养基采用：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g
·
l-1
，氯化钠10g
·
l-1
，琼脂15-20g
·
l-1
，蒸馏水1000ml，并控制ph为7.2～7.4。4.根据权利要求1所述的耐铅锌铜细菌l1在修复重金属污染土壤中的应用。5.根据权利要求4所述的耐铅锌铜细菌l1在修复重金属污染土壤中的应用，其特征在于，重金属包括铅、铜、锌中的一种或多种。

技术总结
本发明公开了一株耐铅锌铜细菌L1，该菌株命名为不动杆菌(Acinetobacter sp.)L1，已于2021年10月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC NO：23539。本发明所提供的耐铅锌铜细菌L1对重金属具有高耐性，铅、锌和铜耐受的最高浓度分别达到2000mg


技术研发人员：高天鹏 刘圆 王雪莹 李海娟 丁群英 张九东 申圆圆 郭成园 杨建军 陈月丽 杨登
受保护的技术使用者：西安文理学院
技术研发日：2022.08.24
技术公布日：2023/7/31