基于沉淀明场图像处理的多重核酸定量方法、装置及介质

1.本发明涉及核酸定量技术领域，特别涉及基于沉淀明场图像处理的多重核酸定量方法、装置及介质。


背景技术：

2.核酸检测在病原体感染的鉴定、重大疾病诊断、食品安全检测、水环境检测等应用中起着重要作用。例如，通过核酸检测可以及时发现病毒携带者，为病毒的传播链追踪、防控措施的制定提供科学的依据。在癌症的诊断中，基因检测可以发现突变的基因位点，从而提供个性化的精准治疗方案。
3.目前核酸检测方法大多基于核酸扩增反应。通过设计与靶标序列匹配的引物，靶标序列在扩增反应中被复制出来，通过检测反应是否发生，判定样本中有无关注的靶标序列。实时荧光聚合酶链式反应(qpcr)是最常用的核酸检测方法，可以实现核酸浓度的半定量。例如，大规模核酸筛查使用的检测技术便是qpcr。尽管qpcr在学术界和医疗保健领域得到广泛的应用，但qpcr结果的量化需要参考标准品的浓度，因此仅能提供核酸浓度的相对定量，灵敏度较低，并且使测试复杂化。
4.数字pcr(dpcr)是一种无需标准曲线、可实现绝对定量的核酸检测技术，其中数字液滴pcr(ddpcr)最为常见。该技术主要由三个环节组成：核酸分散、pcr扩增和信号读取，每个环节需要一个专门的设备。在ddpcr中，通常利用微流控技术产生数以万计、大小均一且确定的油包水液滴，核酸被多倍稀释并分散至这些液滴中，以至于每个液滴中包含0或1个核酸。随后，每个液滴同时参与pcr反应，可在常规的pcr仪器上完成，含有核酸的液滴将会发出荧光。扩增结束后，通常采用流式的策略读取每个液滴的荧光信号，并统计阴阳性液滴数量。由于每个液滴中包裹的核酸分子数量服从泊松分布，可估算出样本中目标核酸数量。在ddpcr领域，相关产品大都包括一台液滴生成仪和一台液滴读取仪，分别用于实现核酸分散与信号读取环节，但由于造价昂贵，限制了其推广。
5.多靶标核酸检测可以同时检测多个基因片段，提高检测效率。例如，在传染病检测中，多靶标检测可以比较快速地确定病原体，指导制定更科学的治疗方案；同一病原体的多基因片段同时检测，还可以提高病原体检测的准确性。许多研究致力于基于数字液滴pcr技术实现多重核酸检测。目前数字pcr中的多重靶标通常通过两种方式实现：调节荧光波长和调节荧光强度。然而这些策略均依赖于荧光信号的产生与读取，需要与之相匹配的荧光染料或荧光探针、光源、光路、相机等模块，使得设备成本较高，体积较大，极大地限制了便携式检测仪的实现。因此，如何实现无需荧光标记的多靶标数字核酸检测技术，从而实现低成本、高灵敏度核酸检测是本领域技术人员需要解决的问题。


技术实现要素：

6.本发明实施例提供了一种基于沉淀明场图像处理的多重核酸定量方法、装置、计算机设备及存储介质，旨在实现在明场条件下进行多重数字核酸定量分析，降低核酸检测
成本。
7.第一方面，本发明实施例提供了一种基于沉淀明场图像处理的多重核酸定量方法，包括：
8.配置检测试剂；其中，所述检测试剂包含均匀混合的lamp扩增试剂、核酸样本以及多种不同浓度的引物；
9.利用微流控芯片将所述检测试剂生成均一的油包水液滴；
10.采用热循环仪对所述油包水液滴进行扩增，以使所述油包水液滴生成沉淀产物；
11.在明场下获取所述油包水液滴的液滴图像，并通过掩膜区域卷积神经网络模型对所述液滴图像进行分类预测；
12.基于分类预测的结果对所述检测试剂计算核酸浓度，以此构建多重核酸定量模型；
13.利用所述多重核酸定量模型对指定的核酸试剂进行定量检测分析。
14.第二方面，本发明实施例提供了一种基于沉淀明场图像处理的多重核酸定量装置，包括：
15.第一配置单元，用于配置检测试剂；其中，所述检测试剂包含均匀混合的lamp扩增试剂、核酸样本以及多种不同浓度的引物；
16.液滴生成单元，用于利用微流控芯片将所述检测试剂生成均一的油包水液滴；
17.第一扩增单元，用于采用热循环仪对所述油包水液滴进行扩增，以使所述油包水液滴生成沉淀产物；
18.图像预测单元，用于在明场下获取所述油包水液滴的液滴图像，并通过掩膜区域卷积神经网络模型对所述液滴图像进行分类预测；
19.模型构建单元，用于基于分类预测的结果对所述检测试剂计算核酸浓度，以此构建多重核酸定量模型；
20.定量检测单元，用于利用所述多重核酸定量模型对指定的核酸试剂进行定量检测分析。
21.第三方面，本发明实施例提供了一种计算机设备，包括存储器、处理器及存储在所述存储器上并可在所述处理器上运行的计算机程序，所述处理器执行所述计算机程序时实现如第一方面所述的基于沉淀明场图像处理的多重核酸定量方法。
22.第四方面，本发明实施例提供了一种计算机可读存储介质，所述计算机可读存储介质上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现如第一方面所述的基于沉淀明场图像处理的多重核酸定量方法。
23.本发明实施例将液滴微流控、数字核酸定量与深度学习结合起来，从而实现多重数字核酸检测的绝对定量技术。具体的，本发明实施例根据ddlamp(数字液滴环介导等温扩增)原理，含有核酸分子的液滴在扩增过程中脱落的焦磷酸根会与体系中镁离子结合产生沉淀，形成明场下可见的絮状沉淀，且扩增循环数越多，生成的dna分子数量越多，脱落的焦磷酸根越多，生成的沉淀越大；通过调节反应体系中的引物浓度，可以调节扩增循环数，从而改变生成的沉淀大小。本发明实施例利用基于深度学习的图像处理方法进行液滴分型，从而实现在仅需明场成像的前提下进行两种核酸靶标的绝对定量。本发明实施例对不同核酸靶标的引物设置不同的浓度，使不同种核酸的扩增循环数不同，从而得到不同的沉淀产
物量，然后在明场下对液滴成像，通过深度学习图像处理分割每个液滴，并根据液滴内的沉淀产物多少判定液滴内的靶标，最后利用泊松分布计算样本中每种靶标的浓度，如此便可以实现在明场条件下进行多重数字核酸定量分析，从而降低核酸检测成本。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
25.图1为本发明实施例提供的一种基于沉淀明场图像处理的多重核酸定量方法的流程示意图；
26.图2为本发明实施例提供的一种基于沉淀明场图像处理的多重核酸定量装置的示意性框图；
27.图3为本发明实施例中底物浓度与沉淀大小的关系示意图；
28.图4为本发明实施例中扩增时间与沉淀大小的关系示意图；
29.图5为本发明实施例中引物浓度与沉淀量的关系示意图；
30.图6为本发明实施例中包含不同沉淀量的液滴示意图；
31.图7为本发明实施例中样本试剂的生成流程示意图；
32.图8为本发明实施例中荧光图的标记示意图；
33.图9为本发明实施例中掩膜区域卷积神经网络模型的网络架构图；
34.图10为本发明实施例中引物浓度与沉淀大小的关系示意图。
具体实施方式
35.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
36.应当理解，当在本说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”和“包含”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。
37.还应当理解，在此本发明说明书中所使用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的而并不意在限制本发明。如在本发明说明书和所附权利要求书中所使用的那样，除非上下文清楚地指明其它情况，否则单数形式的“一”、“一个”及“该”意在包括复数形式。
38.还应当进一步理解，在本发明说明书和所附权利要求书中使用的术语“和/或”是指相关联列出的项中的一个或多个的任何组合以及所有可能组合，并且包括这些组合。
39.下面请参见图1，图1为本发明实施例提供的一种基于沉淀明场图像处理的多重核酸定量方法的流程示意图，具体包括：步骤s101～s106。
40.s101、配置检测试剂；其中，所述检测试剂包含均匀混合的lamp扩增试剂、核酸样本以及多种不同浓度的引物；
41.s102、利用微流控芯片将所述检测试剂生成均一的油包水液滴；
42.s103、采用热循环仪对所述油包水液滴进行扩增，以使所述油包水液滴生成沉淀产物；
43.s104、在明场下获取所述油包水液滴的液滴图像，并通过掩膜区域卷积神经网络模型对所述液滴图像进行分类预测；
44.s105、基于分类预测的结果对所述检测试剂计算核酸浓度，以此构建多重核酸定量模型；
45.s106、利用所述多重核酸定量模型对指定的核酸试剂进行定量检测分析。
46.本发明实施例将液滴微流控、数字核酸定量与深度学习结合起来，从而实现多重数字核酸检测的绝对定量技术。具体的，本发明实施例根据ddlamp(数字液滴环介导等温扩增)原理，含有核酸分子的液滴在扩增过程中脱落的焦磷酸根会与体系中镁离子结合产生沉淀，形成明场下可见的絮状沉淀，且扩增循环数越多，生成的dna分子数量越多，脱落的焦磷酸根越多，生成的沉淀越大；通过调节反应体系中的引物浓度，可以调节扩增循环数，从而改变生成的沉淀大小。本发明实施例利用基于深度学习的图像处理方法进行液滴分型，从而实现在仅需明场成像的前提下进行两种核酸靶标的绝对定量。本发明实施例对不同核酸靶标的引物设置不同的浓度，使不同种核酸的扩增循环数不同，从而得到不同的沉淀产物量，然后在明场下对液滴成像，通过深度学习图像处理分割每个液滴，并根据液滴内的沉淀产物多少判定液滴内的靶标，最后利用泊松分布计算样本中每种靶标的浓度，如此便可以实现在明场条件下进行多重数字核酸定量分析，从而降低核酸检测成本。
47.现有的多靶标数字核酸检测技术依赖多通道的荧光检测，成本高、设备体积大。因此如何在明场成像的基础上实现多重核酸靶标的绝对定量，研究出无标记、便携式、多靶标数字核酸检测技术，是本发明实施例拟解决的关键问题。而针对无标记、多靶标、便携式数字核酸定量的这一技术需求，本发明实施例提出了以等温扩增的沉淀产物为标志物，以明场成像代替荧光成像，通过深度学习分析液滴内的沉淀产物数量，判定每个液滴内每种靶标的阴阳性，从而在无荧光标记的前提下，实现多种靶标的绝对定量。为了实现这一技术，本实施例对多种(例如两种)核酸靶标的引物设置不同的浓度，使多种核酸的扩增循环数不同，从而得到不同大小的沉淀产物，然后在明场下对液滴成像，通过深度学习图像处理分割每个液滴，并根据液滴内的沉淀产物多少判定液滴内的靶标，最后利用泊松分布计算样本中每种靶标的浓度。
48.本发明实施例将液滴微流控、数字核酸定量与深度学习结合起来，充分发挥微流控和深度学习在小型、精准检测方面的优势，实现了一种低成本的多靶标数字核酸定量技术，对基础研究和临床检验中的核酸检测均有重要的应用价值。且与体外诊断仪器模块兼容性高，具有小型化潜力和较好的产业化前景。
49.现有技术中，对于基于荧光的多靶标数字核酸检测的研究现状以及基于明场图像分析的数字核酸检测的研究现状，具体如下：
50.基于荧光信号的多靶标数字核酸检测
51.(1)基于荧光波长；
52.基于荧光探针具有特异性这一优点，通过为每个靶标设计一个或多个定制的荧光探针，多靶标可与荧光探针特异性结合并发射出不同的荧光。这些荧光探针不仅需要与目标序列互补配对，而且还要修饰上不同的荧光报告基团，从而使得扩增结束后含不同的靶
标的液滴发射出不同波长的荧光，利用不同的荧光通道检测荧光信号，最后对每一种荧光信号的阳性液滴数量和总液滴数量进行统计，并代入基于泊松分布的核酸定量公式即可实现多靶标的定量。
53.现有技术为了在外囊泡中识别出罕见肿瘤突变，分别设计了含vic和fam的荧光探针去特异识别液滴中包裹的野生型与突变型基因序列，扩增结束后，每个液滴在微通道流动并激发其荧光，根据荧光波长可以在2d的液滴图中观察到四个不同的簇，分别代表四类液滴。现有技术还介绍了一种允许三色复用的数字pcr技术crystal digital pcr
tm
，在样品分配和扩增后，液滴阵列被转移至检测设备中采集蓝色、绿色、红色通道下的图像，通过设置阈值划分不同的液滴群体。
54.此外，为了在单试管中同时检测并量化多种导致脊髓性肌萎缩症相关的基因拷贝数，用不同的荧光团标记了五种荧光探针，随后进行了五色ddpcr检测。这些工作表明了多靶标数字核酸检测在病原体鉴定、疾病诊断和预测上具有极大的应用潜力。
55.然而，在这种“一色一靶标”策略中，荧光探针的设计大大增加了设计的复杂性和成本。同时，荧光报告基团之间的光谱重叠限制了基于荧光波长的多重性。在检测方面，多重性也受到仪器荧光通道的限制。
56.(2)基于荧光信号强度梯度；
57.除了taqman水解探针，扩增产物荧光检测的另一种策略是使用dna结合/嵌入染料。dna结合/嵌入染料所发射的荧光和dna质量呈正比，也就是说，更长、更多的扩增产物能产生更强烈的荧光响应。因此，基于荧光的多靶标检测的另一种思路是通过控制不同靶标扩增的量，当染料与双链dna结合后，含不同靶标的液滴呈现出荧光信号强度梯度，从而实现多重检测。现有技术构建了基于dna结合染料的ddpcr以实现单个反应中对多个目标基因的量化。其验证了通过改变反向引物序列的设计控制扩增子长度、改变不同靶标的引物浓度来影响每个目标序列的扩增产物质量，从而间接影响阳性液滴的荧光幅度使之具有清晰的划分，并且成功实现了2重检测。在前述内容基础上，在操纵扩增子长度导致evagreen荧光染料结合量差异，拓展实现了多重拷贝数变异的量化。
58.荧光强度往往与荧光波长相结合以提供更高阶的多重复用能力，在有限的荧光通道中通过调整荧光探针的浓度和比例实现更多种类的荧光强度组合，克服了“一色一靶标”的限制。现有技术仅使用含vic和fam两种荧光团的taqman探针，通过改变相同颜色的不同荧光探针的浓度，实现了针对脊髓性肌萎缩的5重核苷酸多态性检测。进一步的，现有技术开发了一种基于滚环扩增(rca)的液滴数字比例荧光编码技术，首先在设计rca的引物时，他们对不同的靶标设计具有不同比例红/绿色荧光探针结合位点的padlock探针，这些线性探针与靶标特异结合后环化成为rca扩增的环形模板，导致荧光探针结合位点可被成百上千的复制，并且保持其红/绿比例不变。因此，仅使用红绿两个荧光团，通过检测红绿荧光通道的幅度并推断其对应的比例，他们成功实现对6种病原体的6重检测。另外，现有技术利用双荧光检测通道，通过调整4种目标序列的修饰有cy5/fam的taqman探针浓度，同时对乳腺癌患者血浆中sev衍生的pgr、esr1、erbb2和gapdh mrna进行绝对定量。四种目标基因根据双色荧光幅度的组合进行区分，他们随后结合机器学习模型辅助筛选出用于乳腺癌检测的最佳标志物。
59.然而，这些建立在荧光检测上的方法具有以下缺陷：试剂成本高、设备复杂难以便
携化、液滴读取时间长。光电倍增管可以完成液滴荧光信号的流式读取，但是成本高昂。研究无标记、便携式、多靶标数字核酸定量技术是亟待解决的问题。
60.基于明场图像的数字核酸检测
61.解决这个问题的一个思路是使用明场下可见的液滴特征作为检测的标志物。该方法虽然实现了基于明场图像的数字核酸检测，但是多靶标核酸定量技术尚未实现。
62.在上述工作中，基于荧光信号强度梯度实现的多重核酸检测证明了通过改变不同靶标的引物浓度来控制不同靶标的扩增循环数的可行性；使用环介导等温扩增代替pcr并结合图像处理方法实现的核酸检测证明了通过lamp实现基于明场图像观察沉淀实现数字核酸检测的可行性。然而，目前的多重核酸检测方法仍依赖荧光成像，难以实现检测设备的小型化，提高了检测成本及复杂度。同时，基于明场成像的多重核酸检测尚未实现。而本发明实施例所提供的基于沉淀明场图像处理的多重核酸定量则可以有效解决上述问题，从而实现无标记、便携式、多靶标的数字核酸定量技术。
63.在一实施例中，所述步骤s102包括：
64.按照流动聚焦方式，将所述检测试剂作为水相，并结合油相生成包裹情况不同的所述油包水液滴；所述油包水液滴的包裹情况至少包括无核酸、包裹第一种核酸、包裹第二种核酸以及混合包裹第一种核酸和第二种核酸。
65.本实施例利用微流控芯片，以流聚焦方式生成均一的油包水液滴，水相是已经混合均匀的检测试剂，油相为biorad evagreeni油。同时，设置多种液滴包裹情况，例如设置四种液滴包裹情况：无核酸、核酸1、核酸2、核酸1+2。
66.在一实施例中，所述扩增的时间为30min-60min，所述扩增的温度为55℃～70℃。
67.本实施例在采用热循环仪对所述油包水液滴进行扩增时，将扩增时间设置为30min-60min，将扩增温度设置为55℃～70℃。
68.在具体应用场景中，通过下列内容确定适用于本实施例的lamp反应体系。
69.(1)lamp反应体系中的底物浓度
70.lamp反应体系中除引物与待测样本外，还包括硫酸镁、甜菜碱等缓冲物和dntps组成的反应底物，以及bst dna聚合酶和荧光染料。当反应体系中底物不充足时，生成的沉淀量就会受限于底物量，在提高引物浓度时不能使沉淀量随之增大。如图3所示，将反应体系中的底物浓度提高至1.5倍，可以使较高引物浓度(55.8ng/μl)下生成的沉淀量显著提高。提高高引物浓度下生成的沉淀量有助于拉大低引物浓度和高引物浓度时生成沉淀的差距，从而有利于深度学习模型更加准确地通过沉淀量大小进行液滴分型。因此本实施例使用了包含较高浓度底物的反应体系。
71.(2)lamp反应扩增时间
72.lamp反应扩增时间一般在30min-60min之间，在检测不同样本时所需的扩增时间略有不同。扩增时间过短，会导致反应不充分，反应结果不明显(荧光亮度与背景噪声差距过小或沉淀量过少而不可见)，导致检测结果的假阴率偏高，检测结果较真实值偏低，也不利于产生有区分度的沉淀量。扩增时间过长，可能提高非特异性扩增概率，导致检测结果不准确。
73.本实施例探究了lamp扩增时间对于生成沉淀量的影响，从而确定最佳扩增时长。
74.本实施例使用了奇异变形杆菌引物和阳性质控进行实验。具体操作如下：分别使
用18.68ng/μl和62.28ng/μl的引物配制反应体系，拍摄不同扩增时间后两组液滴情况，并测量液滴中的沉淀光密度值。结果如图4所示，低浓度引物的反应体系产生的沉淀总体高浓度反应体系，且随着扩增时间增长，两组中的沉淀量均呈现先上升后趋于平稳趋势。实验结果表明：(1)在70min扩增时间内，没有明显的非特异扩增现象出现；(2)在反应45min后，两组沉淀量均趋于平缓，因此本实施例中扩增时间确定为45min；(3)再次证明了可以通过调整引物浓度调整扩增后生成的沉淀多少。
75.在一具体实施例中，构建基于调整引物浓度、通过区分生成沉淀量实现的两种核酸标记方法。
76.如图5所示，为实现两种核酸的绝对定量检测，本实施例将在反应体系中加入两种不同核酸对应的引物，两种引物的浓度不同，因此在生成液滴并进行等温扩增后，包含低浓度引物对应的dna的液滴生成的沉淀量最少，包含高浓度引物对应的dna的液滴生成的沉淀量较多，同时包含两种dna的液滴生成的沉淀量最多。
77.为了确定两种引物的浓度，本实施例分别采用奇异变形杆菌以及水牛源引物和其两种阳性质控进行如下实验：配制反应体系，在反应体系中同时加入两种引物，两种引物浓度不同；再将反应体系分为三份，三份中分别加入奇异变形杆菌阳性质控、水牛源阳性质控、两种阳性质控且均过量，第三份中两种阳性质控均过量是为了保证每个液滴中均同时包含两种dna。三组分别生成液滴后进行等温扩增，扩增后分别拍摄三组液滴，观察每组液滴中的沉淀情况。调整体系中两种引物的浓度，使三组液滴中的沉淀量区分度最大。实验结果表明，在奇异变形杆菌引物浓度为30.03ng/μl、水牛源引物浓度为65.89ng/μl时，三组沉淀量区分度较好，效果如图6所示。
78.在一实施例中，所述步骤s104包括：
79.在完成扩增后的油包水液滴中选取目标液滴；
80.采用微通道成像方法读取所述目标液滴的液滴直径，并基于所述液滴直径将所述目标液滴注入所述微流控芯片中；
81.通过明场显微镜对所述微流控芯片中的目标液滴进行拍摄，得到所述液滴图像。
82.本实施例在扩增结束后取少量液滴(即所述目标液滴)于玻片上，测量液滴直径。对于目标液滴的读取则采用在微通道内成像的方法。具体的，本实施例使用光刻和软刻蚀技术加工高度为约46.5μm，宽度约为800μm的微通道，通道设计有一个入口和一个出口。然后，将目标液滴从芯片入口注入，若芯片内液滴过于拥挤可以注入少量油相，并利用10x明场显微镜拍摄液滴图像。
83.在一实施例中，所述步骤s104还包括：
84.通过所述掩膜区域卷积神经网络模型中的区域提议网络对所述液滴图像进行扫描，并在所述液滴图像中的每一像素点生成不同大小和形状的锚框；
85.筛选包含有物体且位置精度和尺寸大小均达到预设阈值的锚框作为提议；
86.通过所述掩膜区域卷积神经网络模型中的卷积神经网络对所述液滴图像生成特征图，并将所述特征图与所述提议进行对齐；
87.采用全卷积层对对齐的提议进行分类输出。
88.本实施例中，如图7所示，mask r-cnn(掩膜区域卷积神经网络)在实例分割任务中具有良好的性能，其网络结构可以简单分为：卷积神经网络(cnn)、区域提议网络(rpn，
regionproposal network)、兴趣区域对齐层(roi align)、全卷积层(fcn，fully convolutional network)。该网络不仅可以预测出每个感兴趣区域(roi，region ofinterest)的类别和边界框，还可以在目标的像素级位置上生成掩膜(mask)。mask r-cnn框架分为两个阶段：第一阶段是扫描图像并生成提议(可能包含对象的区域)，由rpn完成，首先在每个像素点生成不同大小和形状的锚框，筛选出含有物体且位置和大小更为精准的锚框作为提议；第二阶段将提议与特征图对齐，对其进行分类并生成边界框和掩膜，主要由cnn完成。
89.在一实施例中，所述基于沉淀明场图像处理的多重核酸定量方法还包括：
90.配置多个样本试剂，并采用不同荧光染料分别与每一样本试剂混合为不同的样本液滴；
91.对所述样本液滴进行扩增，并在扩增完成后收集所述样本液滴的明场和荧光图；
92.在所述荧光图中对所述样本液滴的边界进行确认，并标记所述样本液滴的类别；
93.利用带有标记的荧光图对所述掩膜区域卷积神经网络模型进行学习。
94.本实施例在通过掩膜区域卷积神经网络模型对所述液滴图像进行分类预测之前，会预先构建训练所述掩膜区域卷积神经网络模型，以使所述掩膜区域卷积神经网络模型更加适用于本实施例所对应的场景。具体构建训练过程如下：
95.(1)产生训练集、验证集
96.为了得知每一类液滴内包含的内容物从而在下一步标注的时候赋予正确的标签信息，在产生训练集与验证集的时候，本实施例将荧光颜色作为每一类液滴的真实类别的指示。如图8所示，具体操作为：用不同的荧光染料分别与试剂混合，生成四组液滴，除去无荧光的无dna液滴，其他三组中每一组液滴中含一种荧光、一种dna靶标组合(dna 1、dna2、dna 1+dna2)、以及两种具有不同浓度的引物。扩增结束后将四种液滴混合起来收集明场和荧光图，通过荧光融合图，则可知道该液滴包裹的内容物。
97.(2)标记训练集、验证集：
98.利用labelme圈出液滴边界并标注该液滴的类别，如图9所示。无荧光液滴，则赋予negative(代表阴性)标签；蓝色荧光液滴，则将其明场液滴赋予low_positive(代表小沉淀)标签；红色荧光液滴，则将其明场液滴赋予medium_positive(代表中等沉淀)标签；紫色荧光液滴，则将其明场液滴赋予high_positive(代表大沉淀)标签。
99.(3)模型训练
100.沉淀识别与液滴分类采用的是mask r-cnn网络。本实施例利用上述mask r-cnn作为图像分割模型，并将abdulla的mask r-cnn代码用于tensorflow2实现。首先，我们选择resnet-50为主干模型。为了加快模型训练速度，本实施例将原来为1608*1608像素的视频帧的尺寸缩小为768*768像素。除此之外，本实施例还将每一张训练图像的感兴趣区域(roi)数量设置为5000，以及将训练中金标准实例物体检测数量上限设置为1000。rpn中的非极大抑制阈值设为0.95，进行非极大抑制后的最大提议区域数设置为9000，以产生足够多的提议区域。锚框的尺寸设为32，64，128，256，512像素，步长为4，8，16，32，64像素，长宽比为0.5，1，2。根据实验的具体情况，检测中每张图像的物体检测数量上限设置与训练时一致，rpn中的非极大抑制阈值设为0.1。
101.在模型训练中，本实施例使用学习率为0.005的随机梯度下降优化算法。原始图像
和相关的标签和掩码信息形成了mask r-cnn模型的训练(80％)和测试(20％)数据。将标记好的数据放入深度学习网络中训练权重，大约训练1500个epoch就可以获得效果理想的权重文件。检测结束后，模型将会输出检测到液滴的类别以及每一类别的数量，从而通过上述核酸浓度计算公式可实现两种核酸的浓度定量。
102.在一实施例中，所述步骤s105包括：
103.按照下式计算核酸浓度c：
104.c＝-ln p-/v
105.式中，p表示阴性液滴所占比例，v为每个所述油包水液滴的体积。
106.本实施例中，环介导等温扩增(lamp)是一种类似于pcr的核酸扩增方法，具有可以在恒温下进行核酸扩增、扩增过程中产生可见沉淀等优点。在dna进行扩增时，游离的dntp与核酸单链结合，脱落下来的焦磷酸根离子与lamp试剂中的镁离子结合生成焦磷酸镁沉淀。在数字液滴核酸检测中，可以通过在明场下观察液滴中是否生成沉淀判断该液滴中是否包含dna分子。已有研究证明，每个液滴中包含k个核酸分子的概率服从泊松分布。对于体积均一液滴，假设每个液滴的体积为v，待求浓度为c，则c满足以下公式：
107.c＝-ln p-/v
108.其中，p-表示阴性液滴所占比例。通过以上公式，我们可以通过计数含有沉淀的液滴数占总液滴数的比例，来得到样品中核酸浓度c。
109.根据lamp原理，在扩增过程中扩增循环数越多，最终扩增出的dna分子数越多，脱落的焦磷酸根离子也会更多，从而导致生成的沉淀量越多。而在反应底物充足的情况上，理论上引物越多，扩增循环数越多，生成的沉淀量越大。因此，如果在反应体系中加入两种不同dna对应的引物，并使两种引物浓度不同，就可以通过沉淀量判断该液滴中包含的dna种类。
110.本实施例对此进行了验证实验，证明了可以通过调整引物浓度调节生成的沉淀大小。具体来说，首先分别使用从0ng/μl到62ng/μl的共11种浓度的奇异变形杆菌引物，在使用包含奇异变形杆菌阳性dna样本的反应试剂生成液滴后，进行环介导等温扩增反应。接着测量每个液滴中的沉淀的光密度值，结果如图10所示，在0ng/μl到55.8ng/μl的范围内，沉淀量随引物浓度的升高呈上升趋势；继续提高引物浓度，由于缺乏如dntp等反应原料，沉淀量趋于平稳，不再随引物浓度的提高而增加。这证明了生成沉淀量与引物浓度之间具有高度相关性，证明了本实施例通过调节引物浓度调节生成沉淀量来实现对dna种类标记的可行性。
111.图2为本发明实施例提供的一种基于沉淀明场图像处理的多重核酸定量装置200的示意性框图，该装置200包括：
112.第一配置单元201，用于配置检测试剂；其中，所述检测试剂包含均匀混合的lamp扩增试剂、核酸样本以及多种不同浓度的引物；
113.液滴生成单元202，用于利用微流控芯片将所述检测试剂生成均一的油包水液滴；
114.第一扩增单元203，用于采用热循环仪对所述油包水液滴进行扩增，以使所述油包水液滴生成沉淀产物；
115.图像预测单元204，用于在明场下获取所述油包水液滴的液滴图像，并通过掩膜区域卷积神经网络模型对所述液滴图像进行分类预测；
116.模型构建单元205，用于基于分类预测的结果对所述检测试剂计算核酸浓度，以此构建多重核酸定量模型；
117.定量检测单元206，用于利用所述多重核酸定量模型对指定的核酸试剂进行定量检测分析。
118.在一实施例中，所述液滴生成单元202包括：
119.流动聚焦单元，用于按照流动聚焦方式，将所述检测试剂作为水相，并结合油相生成包裹情况不同的所述油包水液滴；所述油包水液滴的包裹情况至少包括无核酸、包裹第一种核酸、包裹第二种核酸以及混合包裹第一种核酸和第二种核酸。
120.在一实施例中，所述扩增的时间为30min-60min，所述扩增的温度为55℃～70℃。
121.在一实施例中，所述图像预测单元204包括：
122.目标选取单元，用于在完成扩增后的油包水液滴中选取目标液滴；
123.读取及注入单元，用于采用微通道成像方法读取所述目标液滴的液滴直径，并基于所述液滴直径将所述目标液滴注入所述微流控芯片中；
124.图像拍摄单元，用于通过明场显微镜对所述微流控芯片中的目标液滴进行拍摄，得到所述液滴图像。
125.在一实施例中，所述图像预测单元204还包括：
126.锚框生成单元，用于通过所述掩膜区域卷积神经网络模型中的区域提议网络对所述液滴图像进行扫描，并在所述液滴图像中的每一像素点生成不同大小和形状的锚框；
127.提议筛选单元，用于筛选包含有物体且位置精度和尺寸大小均达到预设阈值的锚框作为提议；
128.提议对齐单元，用于通过所述掩膜区域卷积神经网络模型中的卷积神经网络对所述液滴图像生成特征图，并将所述特征图与所述提议进行对齐；
129.分类输出单元，用于采用全卷积层对对齐的提议进行分类输出。
130.在一实施例中，所述模型构建单元205包括：
131.浓度计算单元，用于按照下式计算核酸浓度c：
132.c＝-ln p_/v
133.式中，p表示阴性液滴所占比例，v为每个所述油包水液滴的体积。
134.在一实施例中，所述基于沉淀明场图像处理的多重核酸定量装置200还包括：
135.第二配置单元，用于配置多个样本试剂，并采用不同荧光染料分别与每一样本试剂混合为不同的样本液滴；
136.荧光图收集单元，用于对所述样本液滴进行扩增，并在扩增完成后收集所述样本液滴的明场和荧光图；
137.类别标记单元，用于在所述荧光图中对所述样本液滴的边界进行确认，并标记所述样本液滴的类别；
138.模型学习单元，用于利用带有标记的荧光图对所述掩膜区域卷积神经网络模型进行学习。
139.由于装置部分的实施例与方法部分的实施例相互对应，因此装置部分的实施例请参见方法部分的实施例的描述，这里暂不赘述。
140.本发明实施例还提供了一种计算机可读存储介质，其上存有计算机程序，该计算
机程序被执行时可以实现上述实施例所提供的步骤。该存储介质可以包括：u盘、移动硬盘、只读存储器(read-only memory，rom)、随机存取存储器(random access memory，ram)、磁碟或者光盘等各种可以存储程序代码的介质。
141.本发明实施例还提供了一种计算机设备，可以包括存储器和处理器，存储器中存有计算机程序，处理器调用存储器中的计算机程序时，可以实现上述实施例所提供的步骤。当然计算机设备还可以包括各种网络接口，电源等组件。
142.说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的系统而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术原理的前提下，还可以对本技术进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本技术权利要求的保护范围内。
143.还需要说明的是，在本说明书中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的状况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

技术特征：
1.一种基于沉淀明场图像处理的多重核酸定量方法，其特征在于，包括：配置检测试剂；其中，所述检测试剂包含均匀混合的lamp扩增试剂、核酸样本以及多种不同浓度的引物；利用微流控芯片将所述检测试剂生成均一的油包水液滴；采用热循环仪对所述油包水液滴进行扩增，以使所述油包水液滴生成沉淀产物；在明场下获取所述油包水液滴的液滴图像，并通过掩膜区域卷积神经网络模型对所述液滴图像进行分类预测；基于分类预测的结果对所述检测试剂计算核酸浓度，以此构建多重核酸定量模型；利用所述多重核酸定量模型对指定的核酸试剂进行定量检测分析。2.根据权利要求1所述的基于沉淀明场图像处理的多重核酸定量方法，其特征在于，所述利用微流控芯片将所述检测试剂生成均一的油包水液滴，包括：按照流动聚焦方式，将所述检测试剂作为水相，并结合油相生成包裹情况不同的所述油包水液滴；所述油包水液滴的包裹情况至少包括无核酸、包裹第一种核酸、包裹第二种核酸以及混合包裹第一种核酸和第二种核酸。3.根据权利要求1所述的基于沉淀明场图像处理的多重核酸定量方法，其特征在于，所述扩增的时间为30min-60min，所述扩增的温度为55℃～70℃。4.根据权利要求1所述的基于沉淀明场图像处理的多重核酸定量方法，其特征在于，所述在明场下获取所述油包水液滴的液滴图像，并通过掩膜区域卷积神经网络模型对所述液滴图像进行分类预测，包括：在完成扩增后的油包水液滴中选取目标液滴；采用微通道成像方法读取所述目标液滴的液滴直径，并基于所述液滴直径将所述目标液滴注入所述微流控芯片中；通过明场显微镜对所述微流控芯片中的目标液滴进行拍摄，得到所述液滴图像。5.根据权利要求1所述的基于沉淀明场图像处理的多重核酸定量方法，其特征在于，所述在明场下获取所述油包水液滴的液滴图像，并通过掩膜区域卷积神经网络模型对所述液滴图像进行分类预测，还包括：通过所述掩膜区域卷积神经网络模型中的区域提议网络对所述液滴图像进行扫描，并在所述液滴图像中的每一像素点生成不同大小和形状的锚框；筛选包含有物体且位置精度和尺寸大小均达到预设阈值的锚框作为提议；通过所述掩膜区域卷积神经网络模型中的卷积神经网络对所述液滴图像生成特征图，并将所述特征图与所述提议进行对齐；采用全卷积层对对齐的提议进行分类输出。6.根据权利要求1所述的基于沉淀明场图像处理的多重核酸定量方法，其特征在于，所述基于分类预测的结果对所述检测试剂计算核酸浓度，以此构建多重核酸定量模型，包括：按照下式计算核酸浓度c：c＝-lnp-/v式中，p表示阴性液滴所占比例，v为每个所述油包水液滴的体积。7.根据权利要求1所述的基于沉淀明场图像处理的多重核酸定量方法，其特征在于，还包括：
配置多个样本试剂，并采用不同荧光染料分别与每一样本试剂混合为不同的样本液滴；对所述样本液滴进行扩增，并在扩增完成后收集所述样本液滴的明场和荧光图；在所述荧光图中对所述样本液滴的边界进行确认，并标记所述样本液滴的类别；利用带有标记的荧光图对所述掩膜区域卷积神经网络模型进行学习。8.一种基于沉淀明场图像处理的多重核酸定量装置，其特征在于，包括：第一配置单元，用于配置检测试剂；其中，所述检测试剂包含均匀混合的lamp扩增试剂、核酸样本以及多种不同浓度的引物；液滴生成单元，用于利用微流控芯片将所述检测试剂生成均一的油包水液滴；第一扩增单元，用于采用热循环仪对所述油包水液滴进行扩增，以使所述油包水液滴生成沉淀产物；图像预测单元，用于在明场下获取所述油包水液滴的液滴图像，并通过掩膜区域卷积神经网络模型对所述液滴图像进行分类预测；模型构建单元，用于基于分类预测的结果对所述检测试剂计算核酸浓度，以此构建多重核酸定量模型；定量检测单元，用于利用所述多重核酸定量模型对指定的核酸试剂进行定量检测分析。9.一种计算机设备，其特征在于，包括存储器、处理器及存储在所述存储器上并可在所述处理器上运行的计算机程序，所述处理器执行所述计算机程序时实现如权利要求1至7任一项所述的基于沉淀明场图像处理的多重核酸定量方法。10.一种计算机可读存储介质，其特征在于，所述计算机可读存储介质上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现如权利要求1至7任一项所述的基于沉淀明场图像处理的多重核酸定量方法。

技术总结
本发明公开了基于沉淀明场图像处理的多重核酸定量方法、装置及介质，该方法包括：配置检测试剂；其中，所述检测试剂包含均匀混合的LAMP扩增试剂、核酸样本以及多种不同浓度的引物；利用微流控芯片将所述检测试剂生成均一的油包水液滴；采用热循环仪对所述油包水液滴进行扩增，以使所述油包水液滴生成沉淀产物；在明场下获取所述油包水液滴的液滴图像，并通过掩膜区域卷积神经网络模型对所述液滴图像进行分类预测；基于分类预测的结果对所述检测试剂中的核酸样本计算核酸浓度，以此构建多重核酸定量模型；利用所述多重核酸定量模型对指定的核酸试剂进行定量检测分析。本发明能够实现在明场条件下进行多重数字核酸定量分析，从而降低核酸检测成本。降低核酸检测成本。降低核酸检测成本。


技术研发人员：李自达 金美池 丁婧怡 王毅 周钰
受保护的技术使用者：深圳大学
技术研发日：2023.01.09
技术公布日：2023/7/31