十五味赛尔斗丸在制备治疗肝纤维化的药物中的用途的制作方法

1.本发明涉及十五味赛尔斗丸在制备治疗肝纤维化的药物中的用途。


背景技术：

2.十五味赛尔斗丸是藏医用于肝胆热症，胆囊炎，胆石症，胆总管结石的常用药，其主要成份为印度獐牙菜、火硝、洪连、小檗皮、金腰草、角茴香、诃子、金精石、唐古特乌头、五灵脂、黑冰片、川木香等15味。主治功能清肝热，舒胆排石退黄。
3.肝纤维化是一个病理生理过程，是指由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生。任何肝脏损伤在肝脏修复愈合的过程中都有肝纤维化的过程，如果损伤因素长期不能去除，纤维化的过程长期持续就会发展成肝硬化。抗肝纤维化的治疗主要包括：针对原发病去除致病因素，如抗乙型肝炎、丙型肝炎病毒治疗，抗血吸虫治疗，戒酒等。针对肝纤维化本身的治疗，如通过抑制炎症或脂质过氧化，或者抑制肝星状细胞的增生活化，以及促进胶原降解等。
4.目前，还没有关于十五味赛尔斗丸对肝星状细胞影响的研究，更没有其治疗肝纤维化的报道。


技术实现要素：

5.为解决上述问题，本发明提供了十五味赛尔斗丸在制备治疗肝纤维化的药物中的用途。
6.进一步地，所述药物是抑制肝星状细胞增值的药物。
7.进一步地，所述药物是促进活化的肝星状细胞凋亡的药物。
8.进一步地，所述药物是以十五味赛尔斗丸为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
9.更进一步地，所述制剂为口服制剂。
10.更进一步地，所述口服制剂是膏剂、丸剂、口服液、散剂、片剂、颗粒剂或胶囊剂。
11.进一步地，所述十五味赛尔斗丸是由印度獐牙菜、火硝、洪连、小檗皮、金腰草、角茴香、诃子、金精石、唐古特乌头、五灵脂、黑冰片、川木香、石榴子、波棱瓜子、矮丛凤毛菊制成。
12.本发明十五味赛尔斗丸在制备治疗肝纤维化的药物中的用途，通过细胞试验证明：十五味赛尔斗丸提取物能够抑制hsc-t6细胞的活化增殖以及促进hsc-t6活化细胞的凋亡，具有抗肝纤维化作用，为肝脏疾病治疗提供了一种新的药物选择。
13.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
14.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
15.图1十五味赛尔斗丸的说明书。
16.图2流式细胞仪检测结果(a.空白；b.十五味赛尔斗丸提取物；c.十五味赛尔斗丸提取物+sb203580)
具体实施方式
17.实施例1十五味赛尔斗丸对大鼠肝星状细胞hsc-t6的增殖和凋亡影响研究
18.肝纤维化是指肝脏内弥漫性细胞外基质(特别是胶原物质)过度沉积，是机体对各种病因引起的慢性肝损伤后的一种损伤修复反应，是肝硬化的早期可逆阶段。hsc是肝纤维化的主要效应细胞，肝损伤的任何病因都能使hsc活化，转化成肌成纤维细胞，最终导致肝纤维化。p38信号通路是mark通路的重要组成之一，参与细胞应激、生长和凋亡等。因此，采取有效抑制hsc细胞增殖的措施，可能对肝纤维化的防治起到至关重要的作用。本发明以十五味赛尔斗丸提取物对大鼠肝星状细胞hsc-t6增殖和凋亡的影响进行研究，以期为十五味赛尔斗丸在肝脏疾病的应用，及其作用机制提供参考。
19.1实验材料
20.1.1实验仪器
21.表1实验仪器
[0022][0023]
1.2实验试剂及耗材
[0024]
表2实验试剂及耗材
[0025][0026][0027]
1.3试验药物
[0028]
十五味赛尔斗丸，规格为0.5g/丸，由青海久美藏药药业有限公司提供，其说明书见图1。
[0029]
2实验方法与结果
[0030]
2.1十五味赛尔斗丸对肝星状细胞hsc-t6增殖的影响
[0031]
2.1.1细胞培养液的配制
[0032]
采用含有10％的胎牛血清、1％的青霉素-链霉素的dmem培养液。
[0033]
2.1.2贮存液的配制及处理
[0034]
2.1.2.1十五味赛尔斗丸提取物贮存液的配制
[0035]
取十五味赛尔斗丸粉末，用10倍量70％乙醇回流提取1小时，过滤，滤液挥干，减压干燥得到干浸膏，加入dmem配制成相当于原制剂0.9g/ml的贮存液，0.22μm微孔滤器过滤除菌，分装，避光-20℃保存。使用时用含2％血清的dmem培养液稀释至所需浓度。
[0036]
2.1.2.2sb203580(p38mark抑制剂)贮存液的配制
[0037]
十五味赛尔斗丸提取物贮存液基础上加上sb203580，使sb最终浓度分别为16μmol/l。
[0038]
2.1.3分组
[0039]
十五味赛尔斗丸提取物组：相当于原制剂0.05625、0.1125、0.225g/ml；十五味赛尔斗丸+sb203580组：相当于原制剂0.05625、0.1125、0.225g/ml；其中，每组各浓度均设置阴性对照组，即药物浓度为0g/ml的对照组。
[0040]
2.1.4细胞复苏
[0041]
将hsc-6细胞从液氮中取出，快速放入37℃水浴锅中，轻摇冻存管使冻存液溶解；溶解后把细胞转移到15ml离心管中，缓慢滴加5ml预热的完全培养基，离心收集细胞，室温1000rpm离心5min，弃上清；用含10％胎牛血清的完全培养基悬浮细胞，接种到培养皿中，轻轻吹打混匀，37℃5％co2饱和湿度条件下培养。
[0042]
2.1.5细胞传代
[0043]
细胞的密度达到80％时，对细胞进行传代：弃去培养基，用pbs洗一遍；加1ml 0.25％胰蛋白酶消化细胞，显微镜下观察，消化1-2min，可看到细胞相互分离变圆，即消化完成；快速弃去胰酶，加入完全培养基，吹打细胞，制成单细胞悬液，按1:3的比例传代，37℃、5％co2饱和湿度条件下扩大培养。
[0044]
2.1.6细胞cck8检测
[0045]
取处于对数生长期，生长状态良好的细胞，接种于96孔板中，共10组60孔，每孔100μl体系，接种密度60％，置37℃5％co2培养箱中培养；按照实验方案给药，在对应时间点用cck8法检测细胞活力。每孔加入10μl cck8，37℃培养4h；酶标仪测定各孔吸光值od 450。
[0046]
2.1.7结果
[0047]
结果见表3与表4。在给药4h后，三个浓度的十五味赛尔斗丸提取物对hsc-t6细胞的增殖具有抑制作用，同浓度时，十五味赛尔斗丸提取物+sb203580的细胞活性与单独十五味赛尔斗丸提取物对hsc-t6的细胞活性没有显著性差异，表明十五味赛尔斗丸提取物可能不是通过p38mark通道来抑制hsc-t6细胞的增殖。
[0048]
表3十五味赛尔斗丸提取物对hsc-t6细胞活性的影响(n＝5)
[0049][0050]
表4十五味赛尔斗丸提取物+sb203580对hsc-t6细胞活性的影响(n＝5)
[0051][0052]
注：sb203580的终浓度为16μmol/l
[0053]
2.2流式细胞术检测细胞凋亡率
[0054]
2.2.1确定浓度
[0055]
根据十五味赛尔斗丸提取物对细胞增殖影响的结果，选取细胞活性最低的浓度作为细胞凋亡实验的浓度，确定为0.05625g/ml。
[0056]
2.2.2 pbs溶液的配制
[0057]
按照表5所示，以双蒸水配制1000ml的溶液，配好后分装，再进行高压灭菌，4℃条件下贮存。
[0058]
表5 pbs的制备
[0059][0060][0061]
2.2.3常规培养细胞
[0062]
首先取出细胞，立刻于37℃水浴下溶解，之后转移至离心管内。分次添加完全培养基，第一次1ml，第二次8ml。之后离心(300g/3min)，保留下层细胞沉淀，轻拍离心管底将细胞拍散。之后的培养、传代以及消化流程同“2.1”项下步骤。
[0063]
2.2.4流式检测
[0064]
2.2.4.1细胞铺板
[0065]
将细胞铺到12孔板中，每孔数目为5
×
104。
[0066]
2.2.4.2细胞给药
[0067]
用培养基将药品逐步稀释成10
×
溶液，然后分别取100μl药液到对应的细胞中，最后将细胞放回培养箱。
[0068]
2.2.4.3 annexin v-fitc/pi染色
[0069]
取出细胞进行消化，之后放入ep管中等待染色。首先轻轻移取培养液，然后先以pbs冲洗再进行消化，最后以预先准备的培养液结束。离心300g，3min，除去上清，收集沉淀，再次溶解细胞，准备计数。
[0070]
移取适量细胞离心(1000g/5min)，保留下层细胞沉淀。分为两次添加annexin v-fitc染色液，第一次195μl，第二次补加5μl。继续加入10μl的pi。每次加入溶液应保证混匀。先后于室温、冰浴中孵育，其中第一阶段时间控制为10～20min。孵育阶段可重悬细胞2～3次，整个过程在避光条件下进行。
[0071]
在染色的过程中，红、绿色荧光依次为annexin v-fitc、pi的作用。
[0072]
2.2.4.4荧光显微镜检测
[0073]
按照细胞染色的步骤重新收集细胞，添加适量的annexin v-fitc染色液后，于荧光显微镜下观察。
[0074]
2.2.5结果
[0075]
结果见表6和图2。十五味赛尔斗丸提取物组与十五味赛尔斗丸提取物+sb203580均能引起hsc-t6细胞的凋亡，十五味赛尔斗丸提取物组能显著诱导hsc-t6细胞的早期和晚期凋亡，且该作用不受p38mark抑制剂sb203580的影响。
[0076]
表6流式细胞仪检测结果(n＝3)
[0077]
[0078]
3小结与讨论
[0079]
肝纤维化是许多慢性肝脏疾病，包括持久感染、自身免疫反应、过敏反应、药物治疗、辐射等共同的病理改变，是损伤修复过程异常调节的结果。肝纤维化伴随着细胞外基质(ecm)合成增多、降解减少以致ecm大量聚集。在生理状态下，ecm主要是由hsc合成，在肝组织受到损伤时，hsc活化变为肌成样纤维细胞(mfb)分泌合成ecm，在肝细胞胞间质中ecm过度沉积，最终引起肝纤维化。在受到外界因子的刺激后，hsc被激活，转化为成纤维细胞和肌成纤维细胞，并进行分化、增殖，进而分泌大量的ⅰ、ⅲ、ⅳ型胶原及纤维连接蛋白等多种ecm成分。因此，抑制hsc的活化增殖或促进活化的hsc凋亡是防治肝纤维化的重要手段。
[0080]
通过实验结果表明，十五味赛尔斗丸提取物能够抑制hsc-t6细胞的活化增殖以及促进hsc-t6活化细胞的凋亡，具有一定的抗肝纤维化作用。但加入p38mark信号通路抑制剂，对十五味赛尔斗丸作用几乎无影响，说明十五味赛尔斗丸对hsc-t6细胞的作用不是通过p38mark信号通路来调节的。

技术特征：
1.十五味赛尔斗丸在制备治疗肝纤维化的药物中的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物是抑制肝星状细胞增值的药物。3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物是促进活化的肝星状细胞凋亡的药物。4.根据权利要1所述的用途，其特征在于，所述药物是以十五味赛尔斗丸为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。5.根据权利要4所述的用途，其特征在于，所述制剂为口服制剂。6.根据权利要5所述的用途，其特征在于，所述口服制剂是膏剂、丸剂、口服液、散剂、片剂、颗粒剂或胶囊剂。7.根据权利要1所述的用途，其特征在于，所述十五味赛尔斗丸是由印度獐牙菜、火硝、洪连、小檗皮、金腰草、角茴香、诃子、金精石、唐古特乌头、五灵脂、黑冰片、川木香、石榴子、波棱瓜子、矮丛凤毛菊制成。

技术总结
本发明提供了一种十五味赛尔斗丸在制备治疗肝纤维化的药物中的用途。本发明通过细胞试验证明：十五味赛尔斗丸提取物能够抑制HSC-T6细胞的活化增殖以及促进HSC-T6活化细胞的凋亡，具有抗肝纤维化作用，为肝脏疾病治疗提供了一种新的药物选择。供了一种新的药物选择。供了一种新的药物选择。


技术研发人员：孟宪丽 赖先荣 久美彭措
受保护的技术使用者：青海久美藏药药业有限公司
技术研发日：2022.01.19
技术公布日：2023/7/31