羰基还原酶突变体及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种羰基还原酶突变体及其应用。


背景技术：

2.生物催化因其具有高的立体选择性、温和的反应条件、环境友好等特点，特别近年来酶分子改造技术(生物信息学、基因工程、蛋白质工程)的飞速发展，已经成为可持续发展过程中拓展传统化学合成的重要方法。
3.催化酮(或醛)还原成相应的醇的酶被称为羰基还原酶(kred)。因kred可以高度选择性地构建手性醇，其在有机合成中的应用得到了广泛的增长。
4.对于外消旋手性羰基化合物，kred对其中的一个绝对构型的催化反应速度显著快于另一个绝对构型的时候，就可以获得动力学拆分消旋体手性羰基化合物的作用。owen w.gooding等人通过来源于lactobacillus kefir酶进化后选择性地将外消旋2-甲基戊醛中的(r)构型对映体还原成目标产品(development of a practical biocatalytic process for(r)-2-methylpentanol)。但是该研究只局限于醛类化合物，并且底物范围较窄，应用价值不高。反应如下：
[0005][0006]
而kred用于拆分外消旋手性酮的报道很少，特别是获得ee值不低于99％的酮，并同时获得ee不低于99％的醇的应用案例尚未见诸报道。


技术实现要素：

[0007]
本发明旨在提供一种羰基还原酶突变体及其应用，以提高羰基还原酶催化活性以及拆分选择性。
[0008]
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种羰基还原酶突变体。该羰基还原酶突变体的氨基酸序列是seq id no：1所示序列发生突变的氨基酸序列，突变的氨基酸位点包括：s65；或者羰基还原酶突变体的氨基酸序列具有突变的氨基酸位点，且与seq idno：1所示序列具有90％以上同源性、具有羰基还原酶催化活性的氨基酸序列。
[0009]
进一步地，s65突变为s65a、s65g或s65d。
[0010]
进一步地，突变为如下突变位点组合之一：s65a+i78v、s65g+i78q、s65d+i78v、s65a+a201q、s65a+i78v+m154i、s65a+i78v+a201d、s65a+i78v+a201q、s65a+p153s+v198i、s65a+i78v+m154i+a201q、s65a+i78v+p153s+v198i、s65a+i78v+m154i+a202l、s65a+i78v+d182a+a201q、s65a+i78v+d194a+v198i、s65a+p153s+v198i+a202l、s65a+i78v+m154i+
a201q+a202l、s65a+i78v+p153s+v198i+a201d、s65a+i78v+s145e+p153s+d194a、s65a+i78v+m154i+a155d+a201d、s65a+i78v+m154i+v198i+a201q+a202l、s65a+i78v+m154i+v198i+a201d+a202l、s65a+i78v+m154i+a155d+v198i+a201d+a202l、s65a+i78v+m154i+a155d+v198i+a201q+a202l或s65a+i78v+g94t+m154i+a155d+v198i+a201q+a202l。
[0011]
根据本发明的另一方面，提供了一种dna分子。该dna分子编码上述任一种羰基还原酶突变体。
[0012]
根据本发明的再一方面，提供了一种重组质粒。该重组质粒连接有上述任一种dna分子。
[0013]
进一步地，重组质粒为pet-21b(+)、pet-22b(+)、pet-3a(+)、pet-3d(+)、pet-11a(+)、pet-12a(+)、pet-14b、pet-15b(+)、pet-16b(+)、pet-17b(+)、pet-19b(+)、pet-20b(+)、pet-21a(+)、pet-23a(+)、pet-23b(+)、pet-24a(+)、pet-25b(+)、pet-26b(+)、pet-27b(+)、pet-28a(+)、pet-29a(+)、pet-30a(+)、pet-31b(+)、pet-32a(+)、pet-35b(+)、pet-38b(+)、pet-39b(+)、pet-40b(+)、pet-41a(+)、pet-41b(+)、pet-42a(+)、pet-43a(+)、pet-43b(+)、pet-44a(+)、pet-49b(+)、pqe2、pqe9、pqe30、pqe31、pqe32、pqe40、pqe70、pqe80、prset-a、prset-b、prset-c、pgex-5x-1、pgex-6p-1、pbv220、pbv221、pbv222、ptrc99a、ptwin1、pezz18、pkk232-8、ppic9k、pgapzαa、puc-18或puc-19。
[0014]
根据本发明的另一方面，提供了一种宿主细胞。该宿主细胞含有上述任一种重组质粒。
[0015]
进一步地，宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
[0016]
进一步地，原核细胞为大肠杆菌dh5α、top10、bl21-de3或大肠杆菌rosetta-de3细胞；真核细胞为酵母细胞。
[0017]
根据本发明的再一方面，提供了一种生产手性酮的方法。该方法包括采用羰基还原酶对酮类外消旋体化合物还原拆分的步骤，羰基还原酶为上述任一种羰基还原酶突变体。
[0018]
进一步地，酮类外消旋体化合物为其中，r1和r2各自独立地代表c1～c8烷基、c5～c10环烷基、c6～c10芳基或c5～c10杂芳基，或者r1和r2与羰基上的碳共同形成c5～c10杂环基或c5～c10碳环基，c5～c10杂环基和c5～c10杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种，c6～c10芳基中的芳基、c5～c10杂芳基中的杂芳基、c5～c10碳环基中的碳环基或c5～c10杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基或烷基中的至少一个基团所取代，并且具有至少一个手性中心的外消旋体。
[0019]
进一步地，酮类外消旋体化合物为
[0020]
进一步地，采用羰基还原酶对酮类消旋体还原拆分的反应体系中还包括辅酶或辅酶再生体系，辅酶为选自由nadp、nad、nadph或nadh组成的组中的一种或多种。
[0021]
本发明利用组合饱和突变的方法对来源于短乳杆菌(lactobacillus brevis，lbcr)羰基还原酶进行改进，获得了高催化效率，高选择性的羰基还原酶突变体。本技术所获得的部分羰基还原酶突变体，在合成中，酶的用量降低为0.01wt～0.03wt，反应体积降为10v～15v(反应溶剂的体积倍数(1kg指定物料对应1l溶剂，则为1v)，使化合物的工业生产
成本得到大幅度降低，使得该酶在工业生产中具有更好的应用价值。
具体实施方式
[0022]
需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
[0023]
本发明通过筛选来源于短乳杆菌(lactobacillus brevis)、光滑假丝酵母(candida glabrata)、节杆菌(arthrobacter)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、厌氧杆菌(thermoanaerobacter brockii)、乳酸菌(lentilactobacillus kefiri)的羰基还原酶，发现来源于短乳杆菌(lactobacillus brevis)的羰基还原酶拆分效果相对较好，但是其催化效率和选择性还有待进一步提高。因此，本发明以短乳杆菌(lactobacillus brevis，具有seq id no:1所示的氨基酸序列)为本发明的出发基因进行了进一步的基因工程改造，获得了一系列具有较高催化效率和选择性的羰基还原酶突变体。
[0024]
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种羰基还原酶突变体。该羰基还原酶突变体的氨基酸序列是seq id no：1所示序列发生突变的氨基酸序列，突变的氨基酸位点包括：s65；或者羰基还原酶突变体的氨基酸序列具有突变的氨基酸位点，且与seq id no：1所示序列具有90％、95％或99％以上同源性、具有羰基还原酶催化活性的氨基酸序列。本发明提供的羰基还原酶突变体能很好拆分消旋体酮且获得特定构型酮的选择性和产率均较高，适合工业化生产。
[0025]
本文使用的术语“同源性”具有本领域通常已知的含义，本领域技术人员也熟知测定不同序列间同源性的规则、标准。本发明用不同程度同源性限定的序列还必须要同时具有改进的转氨酶对有机溶剂的耐受性。在上述实施方式中，优选转氨酶突变体的氨基酸序列具有以上的同源性并具有或编码具有改进的有机溶剂的耐受性的氨基酸序列。本领域技术人员可以在本技术公开内容的教导下获得这样的变体序列。
[0026]
优选的，s65突变为s65a、s65g或s65d。更优选的，突变为如下突变位点组合之一：s65a+i78v、s65g+i78q、s65d+i78v、s65a+a201q、s65a+i78v+m154i、s65a+i78v+a201d、s65a+i78v+a201q、s65a+p153s+v198i、s65a+i78v+m154i+a201q、s65a+i78v+p153s+v198i、s65a+i78v+m154i+a202l、s65a+i78v+d182a+a201q、s65a+i78v+d194a+v198i、s65a+p153s+v198i+a202l、s65a+i78v+m154i+a201q+a202l、s65a+i78v+p153s+v198i+a201d、s65a+i78v+s145e+p153s+d194a、s65a+i78v+m154i+a155d+a201d、s65a+i78v+m154i+v198i+a201q+a202l、s65a+i78v+m154i+v198i+a201d+a202l、s65a+i78v+m154i+a155d+v198i+a201d+a202l、s65a+i78v+m154i+a155d+v198i+a201q+a202l或s65a+i78v+g94t+m154i+a155d+v198i+a201q+a202l。
[0027]
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种dna分子。该dna分子编码上述任一种羰基还原酶突变体。该dna分子编码的上述羰基还原酶突变体具有较高的催化活力及选择性。
[0028]
本发明的上述dna分子还可以以“表达盒”的形式存在。“表达盒”是指线性或环状的核酸分子，涵盖了能够指导特定核苷酸序列在恰当宿主细胞中表达的dna和rna序列。一般而言，包括与目标核苷酸有效连接的启动子，其任选的是与终止信号和/或其他调控元件有效连接的。表达盒还可以包括核苷酸序列正确翻译所需的序列。编码区通常编码目标蛋
白，但在正义或反义方向也编码目标功能rna，例如反义rna或非翻译的rna。包含目标多核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指至少一个其组分与其至少一个其他组分是异源的。表达盒还可以是天然存在的，但以用于异源表达的有效重组形成获得的。
[0029]
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种重组质粒。该重组质粒含有上述任一种dna分子。上述重组质粒中的dna分子置于重组质粒的适当位置，使得上述dna分子能够正确地、顺利地复制、转录或表达。
[0030]
虽然本发明在限定上述dna分子时所用限定语为“含有”，但其并不意味着可以在dna序列的两端任意加入与其功能不相关的其他序列。本领域技术人员知晓，为了满足重组操作的要求，需要在dna序列的两端添加合适的限制性内切酶的酶切位点，或者额外增加启动密码子、终止密码子等，因此，如果用封闭式的表述来限定将不能真实地覆盖这些情形。
[0031]
本发明中所使用的术语“质粒”包括双链或单链线状或环状形式的任何质粒、粘粒、噬菌体或农杆菌二元核酸分子，优选为重组表达质粒，可以是原核表达质粒也可以是真核表达质粒，但优选原核表达质粒，在某些实施方案中，重组质粒为pet-21b(+)、pet-22b(+)、pet-3a(+)、pet-3d(+)、pet-11a(+)、pet-12a(+)、pet-14b、pet-15b(+)、pet-16b(+)、pet-17b(+)、pet-19b(+)、pet-20b(+)、pet-21a(+)、pet-23a(+)、pet-23b(+)、pet-24a(+)、pet-25b(+)、pet-26b(+)、pet-27b(+)、pet-28a(+)、pet-29a(+)、pet-30a(+)、pet-31b(+)、pet-32a(+)、pet-35b(+)、pet-38b(+)、pet-39b(+)、pet-40b(+)、pet-41a(+)、pet-41b(+)、pet-42a(+)、pet-43a(+)、pet-43b(+)、pet-44a(+)、pet-49b(+)、pqe2、pqe9、pqe30、pqe31、pqe32、pqe40、pqe70、pqe80、prset-a、prset-b、prset-c、pgex-5x-1、pgex-6p-1、pbv220、pbv221、pbv222、ptrc99a、ptwin1、pezz18、pkk232-8、ppic9k、pgapzαa、puc-18或puc-19。
[0032]
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种宿主细胞，宿主细胞含有上述任一种重组质粒。适用于本发明的宿主细胞包括但不仅限于原核细胞或真核细胞。优选的，原核细胞为大肠杆菌dh5α、top10、bl21-de3或大肠杆菌rosetta-de3细胞；真核细胞为酵母细胞。
[0033]
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种生产手性酮的方法。该方法包括采用羰基还原酶对酮类外消旋体还原拆分的步骤，羰基还原酶为本技术的上述任一种羰基还原酶突变体。
[0034]
进一步地，酮类外消旋体化合物为其中，r1和r2各自独立地代表c1～c8烷基、c5～c10环烷基、c6～c10芳基或c5～c10杂芳基，或者r1和r2与羰基上的碳共同形成c5～c10杂环基或c5～c10碳环基，c5～c10杂环基的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种，c6～c10芳基中的芳基、c5～c10杂芳基中的杂芳基、c5～c10碳环基中的碳环基或c5～c10杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基或烷基中的至少一个基团所取代，并且具有至少一个手性中心的外消旋体。优选的，酮类外消旋体化合物为
[0035]
根据本发明一种典型的实施方式，采用羰基还原酶对酮类消旋体还原拆分的反应体系中还包括辅酶，辅酶或辅酶再生体系为选自由nadp、nad、nadph或nadh组成的组中的一种或多种。
[0036]
下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。
[0037]
实施例1
[0038]
羰基还原酶筛选
[0039]
本发明通过筛选来源于短乳杆菌(lactobacillus brevis)、光滑假丝酵母(candida glabrata)、节杆菌(arthrobacter)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、厌氧杆菌(thermoanaerobacter brockii)、乳酸菌(lentilactobacillus kefiri)的羰基还原酶，筛选步骤如下，筛选数据见表1。
[0040]
筛选底物与操作：
[0041][0042]
向4ml离心管中，依次加入水(2ml)，磷酸氢二钠(40mg)，磷酸二氢钠(12mg)，底物(0.1g)，搅拌均匀后，依次加入葡萄糖(0.2g)，nadp(1mg)，gdh(2mg)，最后加入干菌体(2mg)。控制温度35℃反应，过程中监测酮底物的ee和转化率。
[0043]
表1：不同菌株来源羰基还原酶筛选结果
[0044][0045]
从表1可以看出来自短乳杆菌(lactobacillus brevis)、光滑假丝酵母(candida glabrata)、节杆菌(arthrobacter)菌株对底物酮有一定的拆分效果，短乳杆菌(lactobacillus brevis)拆分效果相对较好，但e只有10.9，菌株的活性及拆分选择性均有较大的提高空间，因此，以短乳杆菌(lactobacillus brevis)(具有seq id no:1所示的氨基酸序列)为本发明的出发基因。
[0046]
实施例2
[0047]
短乳杆菌(lactobacillus brevis)突变体库的构建
[0048]
选取短乳杆菌(lactobacillus brevis)底物结合口袋附近非保守残基17个点进行组合饱和突变，采用简并密码子nnk设计突变引物，单点饱和突变结合迭代组合突变技术，进行半理性设计提高酶催化活性及选择性。通过全质粒pcr获得完整的线性片段，将上
述pcr产物经dpnⅰ消化除去出发基因的母本模版后，转化到大肠杆菌bl21(de3)中，涂布于含有50μg/ml卡那霉素的lb培养皿中，37℃培养过夜，96孔板诱导表达后酶标仪高通量筛选，挑选活性较母本提高的再基因测序确定突变位点。
[0049]
具体操作流程如下：以pet28a-lbcr作为模板，用高保真聚合酶primestar进行pcr。pcr反应条件如下：总体积为20μl的pcr反应体系中，加入模板0.5～20ng，10μl 2
×
primestar(premix)，一对突变引物各0.4μl(10μm)，加无菌蒸馏水至20μl。pcr反应程序：(1)98℃变性10sec，(2)55℃退火30sec，(3)72℃延伸6min，步骤(1)～(3)共进行30个循环，4℃保存产物。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后加入dpni在37℃消化1h。将消化产物转入e.coli bl21(de3)感受态细胞并涂布于含有卡那抗生素的平板中，置于37℃培养箱中静置培养约12h。将所得到的单克隆菌落挑取到96孔深孔板中进行培养，37℃振荡培养至od
600
＝0.6时，加入iptg至终浓度为0.2mm，在25℃下进行诱导表达过夜。96孔板离心去掉上清培养基，每孔加入200μl酶解溶液(溶菌酶2mg/ml，多黏菌素1mg/ml，ph＝7.0)，37℃保温破碎2h。酶解后的细胞破碎液4000rpm离心10min，取上清得到粗酶液。对表达的蛋白按照表2所示的体系进行酶标仪高通量活力筛选。
[0050][0051]
表2：酶标仪高通量活力筛选反应体系
[0052]
体系加入量酮基底物(5mg/ml)20μlnadp(1mg/ml)50μl0.1mph7.0pbs缓冲液80μl酶液50μl
[0053]
按如上表3所示体系将除酶液以外的其它组分在96浅孔板中混匀，最后用排枪快速向各孔中加入已经制备好的突变体酶液50μl，于酶标仪340nm进行检测，每10s记录吸光值，监测2min，观察斜率变化，通过与野生型羰基还原酶的酶活对比，筛选出活性较高的突变株，进行复筛和基因测序后进行下一轮组合突变。
[0054]
表3提供本发明公开的具有相关活性的特定序列的羰基还原酶lbcr突变体的列表。在下表中，序列标号分别指表3后面的一系列序列，在活性列表中，一个加号“+”表示突变体蛋白比由序列表中seq id no.1所示氨基酸序列组成的蛋白质的比活力提高了0.1～1倍；两个加号“++”表示突变体蛋白比seq id no.1所示氨基酸序列组成的蛋白质的比活力提高了1～2倍，三个加号“+++”表示突变体蛋白比seq id no.1所示氨基酸序列组成的蛋白质的比活力提高了2～3倍，四个加号“++++”表示突变体蛋白比seq id no.1所示氨基酸序列组成的蛋白质的比活力提高了3～4倍。
[0055]
表3：羰基还原酶lbcr突变体序列和相应的活性改进列表
[0056][0057]
实施例3
[0058]
lbcr突变体的选择性比较
[0059]
将突变体编号为m1、m12、m13、m18、m19、m21、m22和m23诱导表达的8个羰基还原酶用于n-(3-oxocyclohexyl)carbamate反应的筛选，采用如下反应体系：0.02g酮底物溶于0.1ml dmso中混匀，40mg葡萄糖，0.9ml 0.1m ph7.0pbs，0.4mg gdh，0.2mg nadp，菌体4mg，35℃，200rpm反应1h，测转化率以及ee值见表4，m23突变体显示出很好的活性与选择性，e达到46.9。
[0060][0061]
表4：lbcr不同突变体不对称还原反应的结果
[0062]
突变体编号投料量酶量反应体系反应时间转化率酮eeem10.02g0.2wt50v1h15％10％/
hydroxycyclohexyl)carbamate(化合物3)的公斤级生产。
[0073][0074]
5l发酵罐高密度发酵制备出突变体lbcr
m23 500g湿菌体备用。
[0075]
将2130g酮底物(化合物1)加入50l冷热一体玻璃釜，转数150rpm，加入32l 0.1mpbs(688.0g十二水合磷酸氢二钠与200.0g二水合磷酸二氢钠加入水配制成32l水溶液)，加入2378g葡萄糖，10.65g nadp与21.30g gdh，加入湿菌体，滴定仪滴加3m碳酸钾水溶液控制ph＝7.0，35℃反应，反应3h，取样gc检测转化56.20％，正相监测ee值100％，反应液中加入硅藻土400.0g，加入乙酸乙酯10l，升温至70℃搅拌1h让酶失活，降温至30℃后垫硅藻土过滤，滤液合并分液，水相用ea(5l*2)萃取，合并有机相；加入水5l，加入亚硫酸氢钠1040g，室温25℃搅拌3h，大量白色固体析出，过滤，滤饼用ea(10l*2)打浆，过滤，分别收集滤液(含化合物3)和滤饼；滤饼加入10l ea与10l水，加入碳酸钠1060g，室温25℃搅拌3h；溶清后分液，水相用ea(5l*2)萃取，合并有机相；有机相浓缩干得到淡黄色固体(化合物2)850.0g，收率40％，ee 100％，气相纯度97％。
[0076]
滤液(含化合物3)浓缩干得化合物3粗品1300g，含量90％，气相纯度97％。经进一步纯化处理，可以得到780g纯品化合物3，含量99％，气相纯度99％，ee 100％。
[0077]
实施例7～10
[0078]
lbcr
m23
拆分系列羰基化合物
[0079]
向四口烧瓶中，依次加入0.1m ph7.0缓冲液15ml，系列羰基化合物(1g)搅拌均匀后，依次加入葡萄糖(2g)，nadp(10mg)，gdh(10mg)，最后加入lbcr
m23
湿菌体，控制温度35℃，ph＝7.0反应，过程中监测转化率及酮底物的ee，数据见表5，实施例8和9化合物使用10％湿菌体能很好完成拆分。
[0080]
表5：lbcr
m23
拆分系列羰基化合物结果
[0081][0082]
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本发明提
供的羰基还原酶突变体能很好拆分消旋体酮且获得特定构型酮的选择性和产率均较高，适合工业化生产。
[0083]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种羰基还原酶突变体，其特征在于，所述羰基还原酶突变体的氨基酸序列是seq id no：1所示序列发生突变的氨基酸序列，所述突变的氨基酸位点包括：s65；或者所述羰基还原酶突变体的氨基酸序列具有所述突变的氨基酸位点，且与seq id no：1所示序列具有90％以上同源性、具有羰基还原酶催化活性的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的羰基还原酶突变体，其特征在于，所述s65突变为s65a、s65g或s65d。3.根据权利要求1所述的羰基还原酶突变体，其特征在于，所述突变为如下突变位点组合之一：s65a+i78v、s65g+i78q、s65d+i78v、s65a+a201q、s65a+i78v+m154i、s65a+i78v+a201d、s65a+i78v+a201q、s65a+p153s+v198i、s65a+i78v+m154i+a201q、s65a+i78v+p153s+v198i、s65a+i78v+m154i+a202l、s65a+i78v+d182a+a201q、s65a+i78v+d194a+v198i、s65a+p153s+v198i+a202l、s65a+i78v+m154i+a201q+a202l、s65a+i78v+p153s+v198i+a201d、s65a+i78v+s145e+p153s+d194a、s65a+i78v+m154i+a155d+a201d、s65a+i78v+m154i+v198i+a201q+a202l、s65a+i78v+m154i+v198i+a201d+a202l、s65a+i78v+m154i+a155d+v198i+a201d+a202l、s65a+i78v+m154i+a155d+v198i+a201q+a202l或s65a+i78v+g94t+m154i+a155d+v198i+a201q+a202l。4.一种dna分子，其特征在于，所述dna分子编码权利要求1至3中任一项所述的羰基还原酶突变体。5.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒连接有权利要求4所述的dna分子。6.根据权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为pet-21b(+)、pet-22b(+)、pet-3a(+)、pet-3d(+)、pet-11a(+)、pet-12a(+)、pet-14b、pet-15b(+)、pet-16b(+)、pet-17b(+)、pet-19b(+)、pet-20b(+)、pet-21a(+)、pet-23a(+)、pet-23b(+)、pet-24a(+)、pet-25b(+)、pet-26b(+)、pet-27b(+)、pet-28a(+)、pet-29a(+)、pet-30a(+)、pet-31b(+)、pet-32a(+)、pet-35b(+)、pet-38b(+)、pet-39b(+)、pet-40b(+)、pet-41a(+)、pet-41b(+)、pet-42a(+)、pet-43a(+)、pet-43b(+)、pet-44a(+)、pet-49b(+)、pqe2、pqe9、pqe30、pqe31、pqe32、pqe40、pqe70、pqe80、prset-a、prset-b、prset-c、pgex-5x-1、pgex-6p-1、pbv220、pbv221、pbv222、ptrc99a、ptwin1、pezz18、pkk232-8、ppic9k、pgapzαa、puc-18或puc-19。7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求5或6所述的重组质粒。8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述原核细胞为大肠杆菌dh5α、top10、bl21-de3或大肠杆菌rosetta-de3细胞；所述真核细胞为酵母细胞。10.一种生产手性酮的方法，包括采用羰基还原酶对酮类外消旋体化合物还原拆分的步骤，其特征在于，所述羰基还原酶为权利要求1至3中任一项所述的羰基还原酶突变体。11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述酮类外消旋体化合物为其中，r1和r2各自独立地代表c1～c8烷基、c5～c10环烷基、c6～c10芳基或c5～c10杂芳基，或者r1和r2与羰基上的碳共同形成c5～c10杂环基或c5～c10碳环基，所述c5～c10杂环基和c5～c10杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种，所述c6～c10芳基中的芳基、c5～c10杂芳基中的杂芳基、c5～c10碳环基中的碳环基或c5～c10杂环基中的杂环基各
自独立地未被取代或被卤素、烷氧基或烷基中的至少一个基团所取代，并且具有至少一个手性中心的外消旋体。12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述酮类外消旋体化合物为所述酮类外消旋体化合物为13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述采用羰基还原酶对酮类消旋体还原拆分的反应体系中还包括辅酶或辅酶再生体系，所述辅酶为选自由nadp、nad、nadph或nadh组成的组中的一种或多种。

技术总结
本发明公开了一种羰基还原酶突变体及其应用。该羰基还原酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO：1所示序列发生突变的氨基酸序列，突变的氨基酸位点包括：S65；或者羰基还原酶突变体的氨基酸序列具有突变的氨基酸位点，且与SEQ ID NO：1所示序列具有90％以上同源性、具有羰基还原酶催化活性的氨基酸序列。本发明获得了高催化效率，高选择性的羰基还原酶突变体。本申请所获得的部分羰基还原酶突变体，在合成中，酶的用量降低为0.01wt～0.03wt，反应体积降为10V～15V，使化合物的工业生产成本得到大幅度降低，使得该酶在工业生产中具有更好的应用价值。用价值。


技术研发人员：徐尤勇 范乃贵 杜平 王苑先
受保护的技术使用者：南京药石科技股份有限公司
技术研发日：2022.01.19
技术公布日：2023/7/31