一种黑木耳新菌种及其选育方法与流程

1.本发明涉及食用菌技术领域。


背景技术：

2.黑木耳是著名山珍，具有重要健康价值。黑木耳是全世界第一个人工栽培的食用菌品种，中国是黑木耳的主产国，年产量占世界黑木耳总产量的96％，黑木耳是我国在世界市场上最具竞争力的农产品之一。中国黑木耳文化及技术源远流长，我国幅员辽阔，黑木耳菌种资源丰富，栽培者众多，全国大部分地区都适合发展黑木耳产业。
3.而且，目前黑木耳栽培中使用的菌种绝大多数是由野生黑木耳组织直接分离纯化得到的，没有新技术支持菌种品质提升、支持生物主权获取。无法溯源的菌种遍布生产前线，导致菌种市场混滥，同名异种、同种异名现象泛滥，育种者积极性锐减，菌种品质多年不进反退。目前前线使用的菌种都靠小分子速效营养催肥，卖相好，品质差，前线生产出问题大多由菌种引起，因菌种退化等问题导致大面积减产、绝产，种植者却无法对菌种追根溯源，相关部门没有科学鉴定菌种的标准，相关法律法规难以执行，种植者有法难依。


技术实现要素：

4.为了解决目前黑木耳栽培中所使用菌种品质差、退化快、产量低、抗逆性差、稳定性差、无生物主权等问题，本发明提供了一种品质优、产量高、抗逆性强、稳定性高、口味自然、木香浓郁、市场前景好、有生物主权的黑木耳新菌种。
5.本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：一种黑木耳新菌种卓兴1号，所述黑木耳新菌种由内蒙古自治区扎兰屯市卧牛河镇地区野生黑木耳样本组织分离、驯化、选育得到，经鉴定为黑木耳(auriculariaauricula)，属于担子菌亚门，担子菌纲，木耳目，木耳科，木耳属，黑木耳种。识别所述黑木耳新菌种的分子标记为：
6.atcattaaagattctaaggcttcggtcttaatttcggctgtgcgctcaggctgcacgcc
7.gataacctctcacacctgtgcaccttttcggttgcggtttcggccgcttccgcttttac
8.atgcaaccacgaaaagtctagaatgtgacgagaactataaagtaacaactttcaaca
9.acggatctcttggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtg
10.aattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcaccttgcgctccttggtattc
11.catggagcatgcctgtttgagtgtcacgtaaaccctcacccctgcgatgtaacagtcg
12.cctgcggtggacttggaccgtgccggtaatcggctcgtcttgaaatgcattagctggc
13.gcttttagagtgctgggcgaacggtgtgataattatctgcgccgactgccctgggcct
14.cttcagcggcgctgcttacagccgtcccttgtggacaactattttaaagctttggcctc
15.aaatcaggtaggactacccgctgaacttaag
16.该分子标记已在世界基因库genbank备案，并于2022年11月12日公布，备案号为：op787948。
17.一种黑木耳菌种创新培养基，培养基配方(1l)：
18.去皮马铃薯180～220g，葡萄糖18～22g，木质素5～10g，纤维素5～10g，蜂花粉3～6g，琼脂粉18～22g。
19.一种黑木耳新菌种选育方法：
20.(1)将培养基中的去皮马铃薯180～220g切成薄片煮沸0.5～1h，过滤，定容至1l，加入葡萄糖18～22g，木质素5～10g，纤维素5～10g，蜂花粉3～6g，琼脂粉18～22g，分装于容器中，ph自然，120～122℃高温高压灭菌40～50min，将液态培养基倒入无菌培养皿，冷却凝固后制成固体培养基；
21.(2)采用体积百分数为75％的乙醇溶液对黑木耳子实体表面进行消毒10～30s，揪取5mm
×
5mm的组织块，继续用体积百分数为75％的乙醇溶液消毒5～15s，再采用无菌水冲洗2～3次，自然晾干后接入培养基中，于25～28℃下恒温培养直至菌丝长满1/2培养皿；挑取前端菌丝体，转移至新的培养基培养，依照此方法反复挑选移植培养2～3次得到纯化菌种；
22.(3)将得到的纯化菌丝置于-10～-20℃冷处理1～3天，挑取前端菌丝体，转移至新的培养基，于25～28℃下恒温培养直至菌丝即将长满培养皿；
23.(4)于距培养皿边缘1～2cm处分别挑取多块菌丝体，转移至新的培养基，于25～28℃下恒温培养直至菌丝即将长满培养皿；
24.(5)挑选菌丝最为浓密、粗壮、洁白且生长速度最快的培养皿，重复步骤(4)～(5)方法2～3次筛选优势菌种。
25.还包括步骤(6)，制作菌包，接种上述优势菌种进行出耳实验，挑选耳形好、颜色深、耳片厚的高品质子实体，重复步骤(2)～(6)方法2～3次筛选优质菌种。
26.采用本发明提供的选育方法得到的卓兴1号黑木耳新菌种在pda固体培养基上菌丝体呈绒毛状、匍匐状，菌落为圆形，边缘整齐，分支明显，菌丝洁白、粗壮、浓密，气生菌丝发达，色素为黄褐色。卓兴1号菌种子实体为多单片聚生，耳片大，无根，能分成单片，干耳色泽正，耳片背面灰至灰褐色，腹面黑色、有光泽，正反面颜色差别大，耳片边缘圆整，背面筋脉明显。入口弹嫩顺滑，口感极佳。
27.采用本发明提供的选育方法得到的卓兴1号黑木耳新菌种，在菌包培养阶段，菌丝生长速度快，抗逆性强，抗杂菌能力强，且在低营养条件下依然具有优势。出耳阶段，原基形成快，出耳齐，抗逆性强，耳片厚实，颜色深，产量高，品质佳，味道浓郁，口感劲道、顺滑。
附图说明
28.图1为本发明卓兴1号黑木耳新菌种与对照1黑木耳菌种的出耳图，图中左边为卓兴1号黑木耳新菌种出耳图，右边为对照1黑木耳菌种出耳图；
29.图2为本发明卓兴1号新菌种进化树分析结果。
具体实施方式
30.实施例1
31.本发明的卓兴1号黑木耳新菌种野生样本采集地点为内蒙古自治区扎兰屯市卧牛河镇地区，采用以传统经典技术为基础的创新改良方法分离、驯化、选育得到，具体方法如下：(1)创新培养基配方(1l)：去皮马铃薯200g，切成薄片煮沸0.5h，纱布过滤，定容至1l，加
入葡萄糖20g，木质素8g，纤维素7g，蜂花粉5g，琼脂粉20g，分装于三角瓶中，ph自然，120℃高温高压灭菌40min。在超净工作台中将液态培养基倒入无菌培养皿(适量)，冷却凝固后制成固体培养基。
32.(2)采用体积百分数为75％的乙醇溶液对黑木耳子实体表面进行消毒20s，用镊子在耳片中心揪取5mm
×
5mm的组织块，继续用体积百分数为75％的乙醇溶液消毒10s，再采用无菌水冲洗2次，自然晾干后接入培养基中，于25℃下恒温培养直至菌丝长满1/2培养皿；挑取前端菌丝体，转移至新的培养基培养，依照此方法反复挑选移植培养2次得到纯化菌种。
33.(3)将得到的纯化菌丝置于-18℃冷处理3天，挑取前端菌丝体，转移至新的培养基，于26℃下恒温培养直至菌丝即将长满培养皿。
34.(4)于距培养皿边缘1cm处分别挑取多块菌丝体，转移至新的培养基，于26℃下恒温培养直至菌丝即将长满培养皿。
35.(5)挑选菌丝最为浓密、粗壮、洁白且生长速度最快的培养皿，重复步骤(4)～(5)方法2次筛选优势菌种。
36.(6)制作菌包，接种上述优势菌种进行出耳实验，挑选耳形好、颜色深、耳片厚的高品质子实体，重复步骤(2)～(6)方法2次筛选优质菌种。
37.菌丝生长速度比较：采用规格为直径90mm的培养皿，采用标准pda培养基，培养皿中心接种，同样条件同时培养，对比包含本发明卓兴1号新菌种在内的共5个黑木耳品种菌丝长满培养皿的用时。
38.表1菌丝长满培养皿用时结果
39.样品10份平行样品菌丝长满培养皿的平均用时(小时)卓兴1号169对照1186对照2233对照3198对照4241
40.由表可知，本发明的卓兴1号黑木耳新菌种在菌丝生长速度方面具有优势。
41.产耳量比较，采用规格为17
×
33mm标准规格聚丙烯菌包袋制作菌包，培养基拌料配方为常规配方：锯末86％、麦麸10％、豆粕粉2％、石灰1％、石膏1％，水分60～65％，菌包重量1.5
±
0.1公斤，灭菌后接种包含本发明卓兴1号在内的共5个黑木耳菌种，同样条件同时培养、出耳，对比产耳量。
42.表2产耳量结果
43.样品100个菌包的平均鲜耳产量(斤)卓兴1号1.42对照11.02对照21.15对照30.96对照40.89
44.由表可知，本发明的卓兴1号黑木耳新菌种在产耳量方面具有优势。
45.由图1中左边的卓兴1号黑木耳新菌种出耳图与右边的对照1黑木耳菌种出耳图对
比可知：本发明的卓兴1号黑木耳新菌种子实体出耳齐，耳片厚实，颜色深，产量高，品质佳。
46.本发明的卓兴1号黑木耳新菌种分子标记获取方法如下：
47.1.取卓兴1号黑木耳新菌种菌丝体，采用dna提取试剂盒方法提取菌种总dna。
48.2.以菌种总dna为模板，使用基因引物：
49.f1：5
’‑
ccgtaggtgaacctgcgg-3’50.r1：5
’‑
cctccgcttattgatatgc-3’51.进行特定位点的pcr扩增，包含但不限于此对基因引物可扩增出卓兴1号黑木耳新菌种分子标记序列。
52.pcr反应体系：2.5μl10
×
pcrbuffer、2μldntp、引物(f1和r1)各1μl、1μltaqdna聚合酶、1μl模板dna，用去离子水补至25μl。
53.pcr反应条件：94℃预变性4min，94℃变性30s，52℃复性30s，72℃延伸30s，共30个循环，72℃再延伸5min，10℃保存待用。
54.3.测序：将pcr产物使用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，合格样品委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果包含所述卓兴1号黑木耳新菌种分子标记：atcattaaagattctaaggcttcggtcttaatttcggctgtgcgctcaggctgcacgccgataacctctcacacctgtgcaccttttcggttgcggtttcggccgcttccgcttttacatgcaaccacgaaaagtctagaatgtgacgagaactataaagtaacaactttcaacaacggatctcttggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcaccttgcgctccttggtattccatggagcatgcctgtttgagtgtcacgtaaaccctcacccctgcgatgtaacagtcgcctgcggtggacttggaccgtgccggtaatcggctcgtcttgaaatgcattagctggcgcttttagagtgctgggcgaacggtgtgataattatctgcgccgactgccctgggcctcttcagcggcgctgcttacagccgtcccttgtggacaactattttaaagctttggcctcaaatcaggtaggactacccgctgaacttaag
55.采集多种黑木耳样品(包含菌丝体和子实体)，使用上述技术路线、基因引物、反应条件进行基因测序，而后进行进化树分析，结果如图2所示。由图可知，卓兴1号菌种与其他菌种所处不同分支，证明卓兴1号菌种为一种黑木耳新菌种。
56.实施例2
57.本发明的卓兴1号黑木耳新菌种野生样本采集地点为内蒙古自治区扎兰屯市卧牛河镇地区，采用以传统经典技术为基础的创新改良方法分离、驯化、选育得到，具体方法如下：(1)创新培养基配方(1l)：去皮马铃薯180g，切成薄片煮沸1h，纱布过滤，定容至1l，加入葡萄糖18g，木质素5g，纤维素5g，蜂花粉3g，琼脂粉19g，分装于三角瓶中，ph自然，122℃高温高压灭菌45min。在超净工作台中将液态培养基倒入无菌培养皿(适量)，冷却凝固后制成固体培养基。
58.(2)采用体积百分数为75％的乙醇溶液对黑木耳子实体表面进行消毒25s，用镊子在耳片中心揪取5mm
×
5mm的组织块，继续用体积百分数为75％的乙醇溶液消毒15s，再采用无菌水冲洗3次，自然晾干后接入培养基中，于28℃下恒温培养直至菌丝长满1/2培养皿；挑取前端菌丝体，转移至新的培养基培养，依照此方法反复挑选移植培养3次得到纯化菌种。
59.(3)将得到的纯化菌丝置于-20℃冷处理1天，挑取前端菌丝体，转移至新的培养基，于25℃下恒温培养直至菌丝即将长满培养皿。
60.(4)于距培养皿边缘1.5cm处分别挑取多块菌丝体，转移至新的培养基，于25℃下
恒温培养直至菌丝即将长满培养皿。
61.(5)挑选菌丝最为浓密、粗壮、洁白且生长速度最快的培养皿，重复步骤(4)～(5)方法3次筛选优势菌种。
62.(6)制作菌包，接种上述优势菌种进行出耳实验，挑选耳形好、颜色深、耳片厚的高品质子实体，重复步骤(2)～(6)方法3次筛选优质菌种。
63.菌丝生长速度比较：采用规格为直径90mm的培养皿，采用标准pda培养基，培养皿中心接种，同样条件同时培养，对比包含本发明卓兴1号新菌种在内的共4个黑木耳品种菌丝长满培养皿的用时。
64.表1菌丝长满培养皿用时结果
65.样品10份平行样品菌丝长满培养皿的平均用时(小时)卓兴1号171对照1190对照2231对照3195
66.由表可知，本发明的卓兴1号黑木耳新菌种在菌丝生长速度方面具有优势。
67.产耳量比较，采用规格为17
×
33mm标准规格聚丙烯菌包袋制作菌包，培养基拌料配方为常规配方：锯末86％、麦麸10％、豆粕粉2％、石灰1％、石膏1％，水分60～65％，菌包重量1.5
±
0.1公斤，灭菌后接种包含本发明卓兴1号在内的共4个黑木耳菌种，同样条件同时培养、出耳，对比产耳量。
68.表2产耳量结果
69.样品100个菌包的平均鲜耳产量(斤)卓兴1号1.37对照11.08对照21.11对照30.90
70.由表可知，本发明的卓兴1号黑木耳新菌种在产耳量方面具有优势。
71.本发明的卓兴1号黑木耳新菌种分子标记获取方法如下：
72.1.取卓兴1号黑木耳新菌种菌丝体，采用dna提取试剂盒方法提取菌种总dna。
73.2.以菌种总dna为模板，使用基因引物：
74.f2：5
’‑
ttagggggcctgcggaagg-3’75.r2：5
’‑
cctccggcttttgatatg-3’76.进行特定位点的pcr扩增，包含但不限于此对基因引物可扩增出卓兴1号黑木耳新菌种分子标记序列。
77.pcr反应体系：2.5μl10
×
pcrbuffer、2μldntp、引物(f2和r2)各0.8μl、0.8μltaqdna聚合酶、0.5μl模板dna，用去离子水补至25μl。
78.pcr反应条件：94℃预变性5min，94℃变性40s，53℃复性40s，72℃延伸40s，共35个循环，72℃再延伸4min，4℃保存待用。
79.3.测序：将pcr产物使用2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，合格样品委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果包含卓兴1号黑木耳新菌种分子标记：atcat
taaagattctaaggcttcggtcttaatttcggctgtgcgctcaggctgcacgccgataacctctcacacctgtgcaccttttcggttgcggtttcggccgcttccgcttttacatgcaaccacgaaaagtctagaatgtgacgagaactataaagtaacaactttcaacaacggatctcttggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcaccttgcgctccttggtattccatggagcatgcctgtttgagtgtcacgtaaaccctcacccctgcgatgtaacagtcgcctgcggtggacttggaccgtgccggtaatcggctcgtcttgaaatgcattagctggcgcttttagagtgctgggcgaacggtgtgataattatctgcgccgactgccctgggcctcttcagcggcgctgcttacagccgtcccttgtggacaactattttaaagctttggcctcaaatcaggtaggactacccgctgaacttaag
80.本发明是通过实施例进行描述的，本领域技术人员知悉，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本技术的权利要求范围内的实施例都属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种黑木耳新菌种，其特征在于：所述黑木耳新菌种由内蒙古自治区扎兰屯市卧牛河镇地区野生黑木耳样本组织分离、驯化、选育得到，经鉴定为黑木耳(auricularia auricula)，属于担子菌亚门，担子菌纲，木耳目，木耳科，木耳属，黑木耳种，识别所述黑木耳新菌种的分子标记为：atcattaaagattctaaggcttcggtcttaatttcggctgtgcgctcaggctgcacgccgataacctctcacacctgtgcaccttttcggttgcggtttcggccgcttccgcttttacatgcaaccacgaaaagtctagaatgtgacgagaactataaagtaacaactttcaacaacggatctcttggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcaccttgcgctccttggtattccatggagcatgcctgtttgagtgtcacgtaaaccctcacccctgcgatgtaacagtcgcctgcggtggacttggaccgtgccggtaatcggctcgtcttgaaatgcattagctggcgcttttagagtgctgggcgaacggtgtgataattatctgcgccgactgccctgggcctcttcagcggcgctgcttacagccgtcccttgtggacaactattttaaagctttggcctcaaatcaggtaggactacccgctgaacttaag该分子标记已在世界基因库genbank备案，并于2022年11月12日公布，备案号为：op787948。2.一种黑木耳菌种创新培养基，其特征在于：培养基配方(1l)：去皮马铃薯180～220g，葡萄糖18～22g，木质素5～10g，纤维素5～10g，蜂花粉3～6g，琼脂粉18～22g。3.一种黑木耳新菌种选育方法，其特征在于：(1)将培养基中的去皮马铃薯180～220g切成薄片煮沸0.5～1h，过滤，定容至1l，加入葡糖18～22g，木质素5～10g，纤维素5～10g，蜂花粉3～6g，琼脂粉18～22g，分装于容器中，ph自然，120～122℃高温高压灭菌40～50min，将液态培养基倒入无菌培养皿，冷却凝固后制成固体培养基；(2)采用体积百分数为75％的乙醇溶液对黑木耳子实体表面进行消毒10～30s，揪取5mm
×
5mm的组织块，继续用体积百分数为75％的乙醇溶液消毒5～15s，再采用无菌水冲洗2～3次，自然晾干后接入培养基中，于25～28℃下恒温培养直至菌丝长满1/2培养皿；挑取前端菌丝体，转移至新的培养基培养，依照此方法反复挑选移植培养2～3次得到纯化菌种；(3)将得到的纯化菌丝置于-10～-20℃冷处理1～3天，挑取前端菌丝体，转移至新的培养基，于25～28℃下恒温培养直至菌丝即将长满培养皿；(4)于距培养皿边缘1～2cm处分别挑取多块菌丝体，转移至新的培养基，于25～28℃下恒温培养直至菌丝即将长满培养皿；(5)挑选菌丝最为浓密、粗壮、洁白且生长速度最快的培养皿，重复步骤(4)～(5)方法2～3次筛选优势菌种。4.根据权利要求3所述的一种黑木耳新菌种选育方法，其特征在于：还包括步骤(6)，制作菌包，接种上述优势菌种进行出耳实验，挑选耳形好、颜色深、耳片厚的高品质子实体，重复步骤(2)～(6)方法2～3次筛选优质菌种。

技术总结
本发明涉及一种黑木耳(Auricularia auricula)新菌种卓兴1号，野生样本采集地点为内蒙古自治区扎兰屯市卧牛河镇地区，识别该菌种的分子标记GenBank备案号为OP787948。本发明的菌种菌丝生长速度快，抗逆性强，抗杂菌能力强，且在低营养条件下依然具有优势。出耳阶段，原基形成快，出耳齐，抗逆性强，耳片厚实，颜色深，产量高，品质佳，味道浓郁，口感劲道、顺滑，使得该品种在生产中及市场中具有竞争性。使得该品种在生产中及市场中具有竞争性。使得该品种在生产中及市场中具有竞争性。


技术研发人员：刘永昶 刘冠男 张晓萌 孙晓萌
受保护的技术使用者：大连卓兴科技发展有限公司
技术研发日：2022.11.15
技术公布日：2023/7/31