一种生产虾青素的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法与流程

1.本发明属于基因工程领域，具体地说，是关于一种生产虾青素的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法。


背景技术：

2.虾青素(astaxanthin，3,3
′‑
二羟基-4,4
′‑
二酮基-β,β
′‑
胡萝卜素)，又名虾黄素、虾黄质，为一种类胡萝卜素，其结晶为深紫棕色粉末，熔点大约为216℃。它广泛存在于生物界中，特别是水生动物如虾、蟹、鱼和鸟类的羽毛中，起显色的作用。虾青素具有很强的抗氧化特性，被认为是世界上最强的天然抗氧化剂，因此被广泛用于食品、保健品和制药行业。
3.虾青素等类胡萝卜素的生产方法主要包括化学合成法、天然提取法和微生物的异源生产。首先，它们可以用化学方法合成，但技术路线复杂，成本昂贵，生物活性差，因此化学合成的含氧类胡萝卜素只能作为饲料使用。其次也可从虾壳及藻类、海洋细菌等微生物中提取。然而，提取率低，污染环境等问题限制了它们的规模。为提高其合成的安全性与经济型，人们开始利用代谢工程构建异源生产这些含氧类胡萝卜素的微生物，通过异源合成途径的引入，在细菌、酵母和微藻中非天然生产具有高安全性和高生物活性的含氧类胡萝卜素。随着生物技术的快速发展，利用微生物异源生产含氧类胡萝卜素成为目前研究的热点之一。
4.解脂耶氏酵母作为一种油脂酵母可以为类胡萝卜素提供必要的前体代谢物以及储存空间，该菌株具有广泛的底物利用能力，也是公认的安全性菌株。但迄今为止，利用解脂耶氏酵母生产这类胡萝卜素的报道有限，并且普遍产量较低。因此亟需开发类胡萝卜素合成的解脂耶氏酵母基因工程菌。


技术实现要素：

5.针对现有技术中鲜有报道利用解脂耶氏酵母生产这类胡萝卜素、且普遍产较低的实际情况，本发明致力于提供一种能够高产生产虾青素的解脂耶氏酵母基因工程菌，以解决现有技术中的不足。
6.为实现上述目的，本发明的第一个方面，提供了一种生产虾青素的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，所述方法包括将不同来源的crtz和crtw基因的组合转入产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌xk17的染色体中，获得生产虾青素的解脂耶氏酵母基因工程菌，其中，所述不同来源的crtz和crtw基因的组合选自：
7.(1)来自paracoccus sp.n81106来源的pspcrtw基因和haematococcus pluvialis来源的hpcrtz
#
基因的组合；
8.(2)chlamydomonas reinhardtii来源的crcrtw基因和pantoea agglomerans来源的pagcrtz基因的组合；以及
9.(3)chlamydomonas reinhardtii来源的trcrcrtw基因和haematococcus pluvialis来源的hpcrtz
#
基因的组合；
10.其中，所述pspcrtw基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述crcrtw基因的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述pagcrtz基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
11.根据本发明的优选实施例，所述hpcrtz
#
基因采用含有一个点突变的hpcrtz基因的优化序列，其核苷酸序列如seq id no.1所示；所述的trcrcrtw基因采用截短的crcrtw基因的优化序列，其核苷酸序列如seq id no.5所示。
12.根据本发明的优选实施例，所述不同来源的crtz和crtw基因的组合中，所述crtz基因的拷贝数为1～5。
13.根据本发明的另一个优选实施例，所述方法还包括将hpcrtz
#
基因和yarrowia lipolytica内源的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶基因hmg1的序列以及yarrowia lipolytica内源的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶gnd1基因一起转入产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌xk17的染色体中，其中：
14.所述yarrowia lipolytica内源的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶基因hmg1的序列的ncbi登录号为gb:xm_503558.1；
15.所述yarrowia lipolytica内源的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶gnd1基因的ncbi登录号为xm_500938.1。
16.进一步的，所述方法还包括回补筛选标记ura3及leu2的步骤，其中：
17.所述筛选标记ura3的核苷酸序列如seq id no.7所示；所述筛选标记leu2的核苷酸序列如seq id no.8所示。
18.本发明的第二个方面，提供了根据上述的方法构建得到的解脂耶氏酵母基因工程菌。
19.本发明的第三个方面，提供了根据上述方法构建得到的解脂耶氏酵母基因工程菌用于生产虾青素的应用。
20.本发明具有以下有益效果：
21.1、本发明的方法构建得到的产虾青素的解脂耶氏酵母基因工程菌的虾青素的产量高，在摇瓶水平最高产量可达到99mg/l。
22.2、本发明的方法构建得到的产虾青素的解脂耶氏酵母基因工程菌，经过连续传代培养后稳定性良好，能够用于大规模的商业化生产，所得的类胡萝卜素能够被安全的利用，产业化应用前景良好。
附图说明
23.图1为解脂耶氏酵母异源生物合成虾青素的代谢途径。
24.图2显示了不同来源的β-胡萝卜素酮化酶基因(crtw)和β-胡萝卜素羟化酶基因(crtz)的组合转入解脂耶氏酵母菌株xk17后得到的菌株dn1、dn2和dn3的虾青素产量。
25.图3显示了pspcrtw基因和不同拷贝数的hpcrtz
#
基因的组合转入解脂耶氏酵母菌株xk17后得到的菌株dn1、dn16、dn19、dn20和dn21的虾青素产量。
26.图4显示了最终得到的虾青素高产工程菌株dn30的四天摇瓶发酵结果图，其中横坐标表示时间变化，纵坐标表示虾青素产量。
27.图5显示了经过6轮传代后，工程菌株dn30生产虾青素的稳定性实验结果。
具体实施方式
28.下面通过具体实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
29.本技术的发明人在充分研究解脂耶氏酵母的异源生物合成虾青素的代谢途径(图1)的基础上，从13种不同来源的crtz和crtw基因中，筛选得到最优的异源crtz和crtw基因的组合，分别为(1)来自paracoccus sp.n81106来源的pspcrtw基因和haematococcus pluvialis来源的hpcrtz
#
基因的组合；(2)chlamydomonas reinhardtii来源的crcrtw基因和pantoea agglomerans来源的pagcrtz基因的组合；以及(3)chlamydomonas reinhardtii来源的trcrcrtw基因和haematococcus pluvialis来源的hpcrtz
#
基因的组合，通过优化异源crtz基因的拷贝数，并调整前体途径通量以及辅因子含量，构建得到了高产虾青素的基因工程菌株。
30.以下实施例中的解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)采用xk17作为出发菌株，菌株xk17的获得参见申请号为cn202010107322.1的发明专利申请。
31.以下实施例中所使用的质粒：phr_e1-3_hrgfp,pcrispryl_e1-3,phr_a-3_hrgfp,pcrispryl_a-3,phr_f-1_hrgfp,pcrispryl_f-1,phr_f1-3_hrgfp,pcrispryl_f1-3,phr_pox6_hrgfp,pcrispryl_pox6,phr_a1-2_hrgfp和pcrispryl_a1-2，参照schwartz,c.,shabbir-hussain,m.,frogue,k.,blenner,m.,wheeldon,i.2017.standardized markerless gene integration for pathway engineering in yarrowia lipolytica.acs synth biol,6(3),402-409所记载的方法制备得到。
32.实施例1：构建菌株dn1
33.步骤1：将paracoccus sp.n81106来源的pspcrtw基因的优化序列(核苷酸序列如seq id no.2所示)分别通过酶切位点nhei和bsshii构建到质粒phr_a-3_hrgfp中，得到质粒phr_a-3_pspcrtw；
34.将haematococcus pluvialis来源的hpcrtz
#
基因的优化序列(核苷酸序列如seq id no.1所示)分别通过酶切位点nhei和bsshii构建到质粒phr_e1-3_hrgfp中，得到质粒phr_e1-3_hpcrtz
#
。
35.步骤2：将步骤1中所得的质粒phr_a-3_pspcrtw和质粒pcrispryl_a-3转化入解脂耶氏酵母xk17中，获得重组菌株w5；
36.将步骤1中所得的质粒phr_e1-3_hpcrtz
#
和质粒pcrispryl_e1-3同时转入解脂耶氏酵母w5中，获得菌株dn1；
37.其中，转化使用试剂盒frozen ez yeast transformation iitm(购自zymo research)，按照该试剂盒说明书记载的方法进行操作。
38.得到的工程菌经细胞培养后，提取酵母基因组，并经pcr及测序的方法验证为正确。
39.实施例2：构建菌株dn2
40.步骤1：将chlamydomonas reinhardtii来源的crcrtw基因的优化序列(核苷酸序列如seq id no.4所示)分别通过酶切位点nhei和bsshii构建到质粒phr_a-3_hrgfp中，得到质粒phr_a-3_crcrtw；
41.将pantoea agglomerans来源的pagcrtz基因的优化序列(核苷酸序列如seq id no.3所示)分别通过酶切位点nhei和bsshii构建到质粒phr_e1-3_hrgfp中，得到质粒phr_e1-3_pagcrtz。
42.步骤2：将步骤1中所得的质粒phr_a-3_crcrtw和质粒pcrispryl_a-3转化入解脂耶氏酵母xk17中，获得重组菌株w6；
43.将步骤1中所得的质粒phr_e1-3_pagcrtz和质粒pcrispryl_e1-3同时转入解脂耶氏酵母w6中，获得菌株dn2。
44.其中，转化使用试剂盒frozen ez yeast transformation iitm(购自zymo research)，按照该试剂盒说明书记载的方法进行操作。
45.得到的工程菌经细胞培养后，提取酵母基因组，并经pcr及测序的方法验证为正确。
46.实施例3：构建菌株dn3
47.步骤1：将chlamydomonas reinhardtii来源的截短的crcrtw基因(trcrcrtw基因)的优化序列(核苷酸序列如seq id no.5所示)分别通过酶切位点nhei和bsshii构建到质粒phr_a-3_hrgfp中，得到质粒phr_a-3_trcrcrtw；
48.将haematococcus pluvialis来源的hpcrtz
#
基因的优化序列(核苷酸序列如seq id no.1所示)分别通过酶切位点nhei和bsshii构建到质粒phr_e1-3_hrgfp中，得到质粒phr_e1-3_hpcrtz
#
。
49.步骤2：将步骤1中所得的质粒phr_a-3_trcrcrtw和质粒pcrispryl_a-3转化入解脂耶氏酵母xk17中，获得重组菌株w8；
50.将步骤1中所得的质粒phr_e1-3_hpcrtz
#
和质粒pcrispryl_e1-3同时转入解脂耶氏酵母w8中，获得菌株dn3；
51.其中，转化使用试剂盒frozen ez yeast transformation iitm(购自zymo research)，按照该试剂盒说明书记载的方法进行操作。
52.得到的工程菌经细胞培养后，提取酵母基因组，并经pcr及测序的方法验证为正确。
53.实施例4：构建菌株dn21
54.步骤1：将haematococcus pluvialis来源的hpcrtz
#
基因的优化序列(核苷酸序列如seq id no.1所示)分别通过酶切位点nhei和bsshii构建到质粒phr_f-1_hrgfp、phr_f1-3_hrgfp、phr_pox6_hrgfp、phr_a1-2_hrgfp中，得到质粒phr_f-1_hpcrtz
#
、phr_f1-3_hpcrtz
#
、phr_pox6_hpcrtz
#
、phr_a1-2_hpcrtz
#
；
55.步骤2：将步骤1中所得的质粒phr_f-1_hpcrtz
#
和质粒pcrispryl_f-1转化入解脂耶氏酵母dn1中，获得重组菌株dn16；
56.将步骤1中所得的质粒phr_f1-3_hpcrtz
#
和质粒pcrispryl_f1-3同时转入解脂耶氏酵母dn16中，获得菌株dn19；
57.将步骤1中所得的质粒phr_pox6_hpcrtz
#
和质粒pcrispryl_pox6同时转入解脂耶氏酵母dn19中，获得菌株dn20；
58.将步骤1中所得的质粒phr_a1-2_hpcrtz
#
和质粒pcrispryl_a1-2同时转入解脂耶氏酵母dn20中，获得菌株dn21；
59.其中，转化使用试剂盒frozen ez yeast transformation ii
tm
(购自zymo research)，按照该试剂盒说明书记载的方法进行操作。
60.得到的工程菌经细胞培养后，提取酵母基因组，并经pcr及测序的方法验证为正确。
61.实施例5：构建虾青素高产菌株dn30
62.步骤1：将haematococcus pluvialis来源的hpcrtz
#
基因的优化序列(核苷酸序列如seq id no.1所示)与筛选标记ura3(核苷酸序列如seq id no.7所示)分别通过酶切位点ecori和hindiii构建到质粒puc19(核苷酸序列如seq id no.6所示)中，得到质粒puc19-hpcrtz
#-ura3；
63.将yarrowia lipolytica内源的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶基因hmg1的序列(ncbi中登录号为gb:xm_503558.1)与yarrowia lipolytica内源的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶gnd1基因(ncbi中登录号为xm_500938.1)与筛选标记leu2(核苷酸序列如seq id no.8所示)通过酶切位点ecori和hindiii构建到质粒puc19中，得到质粒puc19-hmg1-gnd1-leu2。
64.步骤2：将步骤1中所得的质粒puc19-hpcrtz
#-ura3和质粒puc19-hmg1-gnd1-leu2分别线性化后转化入解脂耶氏酵母dn21中，获得虾青素高产菌株dn30。
65.实施例6：测定菌株产虾青素的产量
66.将实施例1～3得到的虾青素生产菌株dn1、dn2和dn3分别接种于2ml ypd培养基中培养24小时，然后以初始od
600
为0.01的接种量接种于新的50ml ypd培养基中继续培养。
67.其中，所述ypd培养基由2％葡萄糖、2％蛋白胨和1％酵母提取物组成，余量为水，所述百分比为质量百分比。
68.发酵培养4天后，使用dmso和丙酮进行虾青素的提取，之后利用高效液相色谱仪c
18
反相色谱柱对提取的虾青素进行定性和定量分析，检测的结果见图2。
69.由图2的结果可知，同样拷贝数的三种不同来源的crtw基因和crtz基因的优化组合，转入解脂耶氏酵母菌株xk17后，构建得到的菌株dn1、dn2和dn3的产虾青素的能力基本相同。
70.实施例7：测定菌株产虾青素的产量
71.将实施例1和4得到的虾青素生产菌株dn1、dn16、dn19、dn20和dn21分别接种于2ml ypd培养基中培养，培养条件与实施例6相同。
72.发酵培养4天后，使用dmso和丙酮进行虾青素的提取，之后利用高效液相色谱仪c
18
反相色谱柱对提取的虾青素进行定性和定量分析，检测的结果见图3。
73.由图3的结果可知，将crtw基因和crtz基因的组合转入解脂耶氏酵母菌株xk17后，随着crtz基因拷贝数的增加，构建得到的菌株的产虾青素能力也随之增加，并且产量与拷贝数成正比。
74.实施例8：测定菌株产虾青素的产量
75.将实施例5得到的虾青素高产菌株dn30接种于2ml ypd培养基中培养，培养条件与实施例6相同。
76.发酵培养4天后，使用dmso和丙酮进行虾青素的提取，之后利用高效液相色谱仪c
18
反相色谱柱对提取的虾青素进行定性和定量分析，结果如图4所示，显示其产量达到了99mg/l，约为dn21的5倍。
77.实施例9：构建的工程菌株dn30的稳定性实验
78.菌株传代的方法为：将实施例5得到的虾青素高产菌株dn30接种于2ml ypd培养基中培养，24h后在ypd固体培养基中划线，48h后重新挑取工程菌株dn30的单菌落接种于2ml ypd培养基中培养。
79.将如上方法得到传代6轮的dn30菌株以及实施例5得到的菌株dn30均接种于2ml ypd培养基中培养，培养条件与实施例6相同。
80.发酵培养4天后，使用dmso和丙酮进行虾青素的提取，之后利用高效液相色谱仪c
18
反相色谱柱对提取的虾青素进行定性和定量分析，结果如图5所示，可知本发明得到的工程菌株dn30传代后表现稳定，虾青素产量维持在100mg/l左右。
81.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
82.83.84.85.86.87.
技术特征：
1.一种生产虾青素的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括将不同来源的crtz和crtw基因的组合转入产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌xk17的染色体中，获得生产虾青素的解脂耶氏酵母基因工程菌，其中，所述不同来源的crtz和crtw基因的组合选自：(1)来自paracoccus sp.n81106来源的pspcrtw基因和haematococcus pluvialis来源的hpcrtz
#
基因的组合；(2)chlamydomonas reinhardtii来源的crcrtw基因和pantoea agglomerans来源的pagcrtz基因的组合；以及(3)chlamydomonas reinhardtii来源的trcrcrtw和haematococcus pluvialis来源的hpcrtz
#
基因的组合；其中，所述pspcrtw基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述crcrtw基因的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述pagcrtz基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述hpcrtz
#
基因采用含有一个点突变的hpcrtz基因的优化序列，其核苷酸序列如seq id no.1所示；所述的trcrcrtw基因采用截短的crcrtw基因的优化序列，其核苷酸序列如seq id no.5所示。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述不同来源的crtz和crtw基因的组合中，所述crtz基因的拷贝数为1～5。4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，还包括进一步将hpcrtz
#
基因和yarrowia lipolytica内源的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶基因hmg1的序列以及yarrowia lipolytica内源的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶gnd1基因一起转入产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌xk17的染色体中的步骤，其中：所述yarrowia lipolytica内源的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶基因hmg1的序列的ncbi登录号为gb:xm_503558.1；所述yarrowia lipolytica内源的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶gnd1基因的ncbi登录号为gb:xm_500938.1。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括回补筛选标记ura3及leu2的步骤，其中：所述筛选标记ura3的核苷酸序列如seq id no.7所示；所述筛选标记leu2的核苷酸序列如seq id no.8所示。6.根据权利要求1～3中任一项所述的方法构建得到的解脂耶氏酵母基因工程菌。7.根据权利要求4或5所述的方法构建得到的解脂耶氏酵母基因工程菌。8.根据权利要求6或7所述的解脂耶氏酵母基因工程菌的应用，其特征在于，用于生产虾青素。

技术总结
本发明公开了一种生产虾青素的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，包括将不同来源的CrtZ和CrtW基因的组合转入产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK17的染色体中，获得生产虾青素的解脂耶氏酵母基因工程菌。本发明还公开了根据上述的方法构建得到的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用。本发明的方法构建得到的基因工程菌的虾青素的产量高，在摇瓶水平最高产量可达到99mg/L，且经过连续传代培养后稳定性良好。定性良好。


技术研发人员：花强 汪丹妮 韦柳静 刘枫 陈骏
受保护的技术使用者：浙江赫凯生物科技有限公司
技术研发日：2022.01.19
技术公布日：2023/7/31