一株流产布鲁氏菌、布鲁氏菌弱毒疫苗、构建方法及应用与流程

1.本发明属于生物技术领域，特别涉及一株流产布鲁氏菌、布鲁氏菌弱毒疫苗、构建方法及应用。


背景技术：

2.布鲁氏菌病是一种由布鲁氏菌感染引起的呈世界性分布的人畜共患病，该病的临床症状与病原体对感染宿主生殖器官的偏嗜性有关，导致病畜睾丸炎、附睾炎、流产和不孕等。布鲁氏菌作为一种兼性细胞内寄生的病原体，没有典型的毒力因子，其毒力取决于在宿主细胞内生存和复制的能力。细菌能有效利用宿主体内代谢底物进行生长繁殖，是其能与宿主共生和致病的主要原因之一。然而，目前，人们对布鲁氏菌偏嗜代谢底物的认识还不充分，对细胞内环境中的营养物质也不十分清楚。
3.葡萄糖、乳酸、磷酸甘油、赤藓糖、木糖、核糖、未知碳水化合物、氨基酸和脂肪酸可作为不同类型宿主细胞中布鲁氏菌的代谢物。目前，人们普遍认为布鲁氏菌偏嗜利用赤藓糖醇作为碳源，因为，这种四碳多元醇在宿主动物的生殖器官中浓度很高，并且布鲁氏菌在宿主动物的生殖器官中大量增殖。研究表明，布鲁氏菌的赤藓糖醇激酶的活性比葡萄糖激酶的活性高8倍，为细菌在体外偏嗜赤藓糖醇而非葡萄糖提供了可能的解释。进一步的研究表明，赤藓糖醇虽然是布鲁氏菌的优选碳源，能被布鲁氏菌高效利用，但赤藓糖醇代谢缺陷的b19疫苗株，仍然能导致孕畜流产，且人工突变的赤藓糖醇代谢缺失株毒力与亲本株相比并无明显差异。表明赤藓糖醇不是布鲁氏菌在宿主细胞中唯一偏嗜的碳源，还存在新的未知的代谢物可以作为布鲁氏菌在宿主中利用的碳源。


技术实现要素：

4.发明目的：为了降低布鲁氏菌的毒力，本发明提供了一株流产布鲁氏菌、布鲁氏菌弱毒疫苗、构建方法及应用。本发明的流产布鲁氏菌通过沉默与流产布鲁氏菌碳源代谢通路相关的基因，实现布鲁氏菌毒力的减弱，并且进一步制备了布鲁氏菌弱毒疫苗。
5.技术方案：本发明第一方面提供了一株流产布鲁氏菌，该菌株醛缩酶-duf1537代谢通路被阻断；或者该菌株中erya基因和/或otnk基因沉默。
6.作为本发明的一种实施方式，本发明通过以下方式阻断醛缩酶-duf1537代谢通路：mfs基因、otnc基因、dend基因、vdtr基因、otni基因、otnk基因和ltnd基因中的任何一个或多个基因处于沉默状态。
7.前期研究中，我们发现deor家族调控子vdtr负调控bab_rs27025-rs27055基因簇表达，通过对该基因簇开展共转录分析及同源性分析，本发明发现了一条新的布鲁氏菌利用的四碳酸糖代谢通路醛缩酶-duf1537通路。
8.具体地，醛缩酶-duf1537代谢通路包含以下7个基因，分别如下：mfs(bab_rs27025)、otnc(bab_rs27030)、dend(bab_rs27035)、vdtr(bab_rs27040)、otni(bab_rs27045)、otnk(bab_rs27050)、ltnd(bab_rs27055)，通过沉默一个或者多个基因即可阻断
醛缩酶-duf1537代谢通路。
9.本发明第二方面提供了一株流产布鲁氏菌，该菌株无法利用赤藓糖醇和/或d-赤藓酸糖作为碳源。本发明发现了流产布鲁氏菌利用赤藓糖醇和d-赤藓酸糖作为碳源进行代谢，为其快速生长提供能量，本发明通过阻断其中任意一条代谢通路，实现布鲁氏菌毒力的减弱。
10.本发明发现了流产布鲁氏菌的醛缩酶-duf1537代谢通路以及erya基因与该菌株的d-赤藓酸糖和赤藓糖醇的代谢途径有关，发现了流产布鲁氏菌同时利用d-赤藓酸糖和赤藓糖醇作为碳源的双通路，d-赤藓酸糖和赤藓糖醇为布鲁氏菌快速生长提供能量。本发明发现的代谢通路和基因以及联合布鲁氏菌赤藓糖醇代谢通路，通过同时阻断d-赤藓酸糖及赤藓糖醇的代谢通路，可以用于制备布鲁氏菌弱毒疫苗。
11.本发明第三方面提供一种布鲁氏菌弱毒疫苗，所述的布鲁氏菌无法利用赤藓糖醇和/或d-赤藓酸糖作为碳源；或者所述的布鲁氏菌以下一个或者多个基因沉默：mfs基因、otnc基因、dend基因、vdtr基因、otni基因、otnk基因、ltnd基因和erya基因。
12.作为本发明的一种实施方式，所述的布鲁氏菌的otnk基因和/或erya基因沉默。
13.具体地，本发明通过发现的布鲁氏菌四碳酸糖的代谢通路，提供了阻断这条代谢通路的otnk缺失株2308δotnk以及同时阻断四碳酸糖及赤藓糖醇的代谢通路的双基因缺失株2308δeryaδotnk，为布鲁氏菌弱毒疫苗的制备提供了理论基础。
14.本发明第四方面提供了一株流产布鲁氏菌或者布鲁氏菌弱毒疫苗，所述的布鲁氏菌中erya基因(seq id no.43)和/或otnk基因(seq id no.44)缺失。
15.具体地，为了阻断布鲁氏菌利用醛缩酶-duf1537途径代谢四碳酸糖，本发明构建了一株流产布鲁氏菌otnk基因缺失的缺失株2308δotnk。
16.具体地，为了阻断布鲁氏菌利用赤藓糖醇，本发明构建了一株流产布鲁氏菌erya基因缺失的缺失株2308δerya。
17.具体地，为了阻断布鲁氏菌利用四碳酸糖和赤藓糖醇，本发明构建了一株流产布鲁氏菌erya基因和otnk基因缺失的缺失株2308δeryaδotnk。
18.本发明通过对构建的缺失株的毒力分析，本发明揭示了布鲁氏菌如何通过代谢的调控孕畜的流产和炎性反应，为制备潜在的有效的布鲁氏菌弱毒疫苗株提供了理论支持。
19.本发明第五方面提供了上述的流产布鲁氏菌的构建方法或者上述的布鲁氏菌弱毒疫苗的制备方法，包括以下步骤：通过敲除、插入或者替换mfs基因、otnc基因、dend基因、vdtr基因、otni基因、otnk基因、ltnd基因和erya基因中的任意一个或者多个基因的核苷酸片段中的全部或者部分和核苷酸实现对应基因的沉默。
20.作为本发明的一种实施方式，上述的方法包括以下步骤：通过构建otnk基因和/或erya基因的自杀性质粒pkbδotnk和/或自杀性质粒pkbδerya，将自杀性质粒pkbδotnk和/或自杀性质粒pkbδerya导入流产布鲁氏菌。
21.在具体应用中，本发明所述的流产布鲁氏菌为布鲁氏菌病活疫苗a19株。
22.作为一种具体实施方式，本发明的2308δotnk基因缺失菌株通过以下方法构建：
23.(1)以流产布鲁氏菌2308株基因组为模板，otnk-uf/ur为引物，pcr扩增otnk基因的上游片段otnk-u；以otnk-df/dr为引物，pcr扩增otnk基因的下游片段otnk-d。1％核酸琼脂凝胶电泳后，分别回收otnk的上下游片段，再以otnk-uf/dr为引物，上游片段otnk-u及下
duf1357通路与赤藓糖醇代谢通路协同作用，促进布鲁氏菌在胎盘中增殖，进而诱发胎盘炎，最终导致孕鼠流产或死胎，本发明构建的流产布鲁氏菌otnk缺失株成功阻断了流产布鲁氏菌对d-赤藓酸糖的利用，构建的流产布鲁氏菌erya缺失株成功阻断了流产布鲁氏菌对赤藓糖醇的利用，构建的流产布鲁氏菌erya和otnk双基因缺失株成功阻断了流产布鲁氏菌利用d-赤藓酸糖及赤藓糖醇。(2)本发明构建的流产布鲁氏菌双基因缺失株2308δeryaδotnk对妊娠小鼠的致病性显著降低，呈现流产率下降和胎盘炎性反应减弱的特点，理论上阻断两条代谢通路，可以解决布鲁氏菌疫苗株诱导孕畜流产的缺点，为流产布鲁氏菌弱毒疫苗的制备提供技术支撑。
附图说明
34.图1为片段f1-f6以cdna、rna(阴性对照，无逆转录)和dna(阳性对照)为模版进行琼脂糖凝胶电泳。
35.图2为不同碳源培养基中，赤藓酸糖代谢基因簇的表达水平。
36.图3为otnk缺失株的构建。
37.图4为野生株2308和缺失株2308δotnk在d-赤藓酸糖为碳源的培养基中的生长曲线。
38.图5为erya缺失株及erya和otnk双基因缺失株的构建。
39.图6为流产布鲁氏菌2308在10mm d-葡萄糖/d-赤藓酸糖/赤藓糖醇培养基中体外培养的生长曲线。
40.图7为2308、2308δotnk、2308δerya和2308δeryaδotnk在tsb以及含有10mm d-葡萄糖/d-赤藓酸糖/赤藓糖醇的基础培养基mm中的生长曲线。
41.图8为维持生长培养基中含有1％葡萄糖或赤藓酸糖或赤藓糖醇条件下，流产布鲁氏菌感染巨噬细胞的胞内和胞外存活，其中，a图为维持生长培养基中添加庆大霉素时，流产布鲁氏菌感染巨噬细胞的胞内存活能力，c图为维持生长培养基中不添加庆大霉素，允许布鲁氏菌胞外复制时，流产布鲁氏菌感染巨噬细胞的胞内存活能力，，b图为胞外存活能力，d图为胞外/胞内的cfu比值。
42.图9为2308、2308δotnk、2308δerya和2308δeryaδotnk对妊娠小鼠模型的致病性，其中，a图为不同处理组对脾脏中的感染结果，b图为不同处理组对胎盘中的感染结果，c图为感染妊娠小鼠胎盘中醛缩酶-duf1537基因簇的表达水平，d图-h图为不同处理组中胎盘中的炎性结果，i图为不同处理组胎儿存活率，(黄色箭头，钙化。黑色箭头，坏死。红色箭头，中性粒细胞浸润)。
43.图10为2308、2308δotnk、2308δerya和2308δeryaδotnk感染的妊娠小鼠的子宫及胎儿，黑色箭头处胎儿重吸收，图中d表示死胎或弱胎。
具体实施方式
44.以下结合附图来说明本发明的具体实施方式。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
45.实施例1：流产布鲁氏菌赤藓酸糖代谢基因簇的发现
46.前期研究发现了一个与布鲁氏菌毒力相关的deor家族转录调控子vdtr，比较转录组学揭示vdtr负调控基因簇bab_rs27025-rs27055表达。本发明针对该基因簇bab_rs27025-rs27055展开下述研究。
47.1、bab_rs27025-rs27055基因簇共转录分析
48.为了检测bab_rs27025-rs27055基因是否共转录，设计了bab_rs27025-rs27055基因之间的衔接片段f1、f2、f3、f4、f5的引物。引物序列具体如下：
49.f1-f：ccgataaagaacagccctgc(seq id no.1)
50.f1-r：gttgtttccggcaattccct(seq id no.2)
51.f2-f：cagcccttgtccaatttgct(seq id no.3)
52.f2-r：gttcacgcaatcactgtcga(seq id no.4)
53.f3-f：gtgatgactgaacgggcaaa(seq id no.5)
54.f3-r：attcaatgcaatcccgctcg(seq id no.6)
55.f4-f：gatcgccgctttctcattgt(seq id no.7)
56.f4-r：cccgcctgatcgagaaaatg(seq id no.8)
57.f5-f：gacccgaaatagctgccatg(seq id no.9)
58.f5-r：agatttgttcgggcagcttg(seq id no.10)
59.f6-f：cgttgccaaccagaaatcct(seq id no.11)
60.f6-r：cgcatgaaacatgtggtgga(seq id no.12)
61.体外培养流产布鲁氏菌2308株，分别用tianamp bacteria dna试剂盒(天根生物，北京，中国)和ribopure
tm-bacteria试剂盒(ambion)提取细菌dna和rna。通过rt-pcr将rna逆转录为cdna，并进行核酸凝胶电泳，检测相邻基因的衔接片段完整性，以及检测rna是否存在dna的污染。基因组dna作为阳性对照。
62.图1为以cdna、rna和dna为模版进行pcr后，产物进行琼脂糖凝胶电泳。如图1所示，以基因组dna为模板，pcr扩增得到预期大小f1-f6片段。以rna为模板，pcr扩增f1-f6片段，电泳无特异条带，说明提取的rna中无dna污染。以rna反转录cdna为模板，pcr可以显著扩增到预期大小的f1-f6片段，该试验结果表明，bab_rs27025-rs27055基因簇是共转录的，形成一个多顺反子mrna。
63.2、bab_rs27025-rs27055基因簇同源性分析
64.从genbank数据库中下载了流产布鲁氏菌的bab_rs27025-rs27055的氨基酸序列。使用了protein blast进行了数据比对分析。结果发现，bab_rs27025编码mfs超家族转运蛋白；bab_rs27030是一种醛缩酶，与otnc蛋白同源；bab_rs27035编码一种nad依赖性差向异构酶/脱水酶家族蛋白，与d-苏糖酸脱氢酶(dend)同源；bab_rs27040编码一个deor家族转录调控子，我们将其命名为vdtr；bab_rs27045编码产物属于羟基丙酮酸异构酶家族蛋白，与otni具有同源性；bab_rs27050编码一种四碳酸糖激酶家族蛋白，该蛋白被发现与otnk同源；bab_rs27055编码l-苏糖酸脱氢酶ltnd，但该酶在流产布鲁氏菌中有移码突变。根据文献报道，该基因基因簇命名为醛缩酶-duf1537基因簇，参与四碳酸糖l-苏糖酸和d-赤藓酸糖的代谢。l-苏糖酸和d-赤藓酸糖分别被ltnd和dend氧化为2-oxo-tetronate；进一步被otni异构化为3-oxo-tetronate，被otnk磷酸化为3-oxo-tetronate 4-phosphate，然后被
otnc脱羧转化为磷酸二羟丙酮(dhap)和co2，dhap最终加入到糖酵解和tca循环的途径(zhang x.et al.assignment of function to a domain of unknown function:duf1537 is a new kinase family in catabolic pathways for acid sugars.proc natl acad sci u s a.2016,113,e4161-4169)。
65.3、d-赤藓酸糖激活赤藓酸糖代谢基因簇表达
66.布鲁氏菌在以葡萄糖、l-苏糖酸、d-赤藓酸糖作为不同碳源的体外环境中培养6h，检测赤藓酸糖代谢基因簇的转录水平，qpcr引物序列如下：
67.rt-mfs-f：cctgaggtggtggagaacat(seq id no.13)
68.rt-mfs-r：ccgataaagaacagccctgc(seq id no.14)
69.rt-otnc-f：agcaaattggacaagggctg(seq id no.15)
70.rt-otnc-r：aatggtgggaaggtgtttgc(seq id no.16)
71.rt-dend-f：ctggttggcgattattcccg(seq id no.17)
72.rt-dend-r：tcgacagtgattgcgtgaac(seq id no.18)
73.rt-vdtr-f：acagacagcagcaaatacgg(seq id no.19)
74.rt-vdtr-r：caaccagatgcaactcgacg(seq id no.20)
75.rt-otni-f：ccggctatttcatcgtgcat(seq id no.21)
76.rt-otni-r：cattttctcgatcaggcggg(seq id no.22)
77.rt-otnk-f：gaattcaccgtcatctgccc(seq id no.23)
78.rt-otnk-r：aatatttcctgcacgtccgc(seq id no.24)
79.rt-ltnd-f：ttttgtcaaggatctgcgcc(seq id no.25)
80.rt-ltnd-r：ctgtcgggaagtttgatgcc(seq id no.26)
81.图2结果表明，与葡萄糖作为唯一碳源相比，流产布鲁氏菌2308在d-赤藓酸糖作为唯一碳源时，赤藓酸糖代谢基因簇的转录水平明显上调。
82.本实施例验证了受vdtr调控的共转录的基因簇与一条四碳酸糖代谢通路相关，发现了流产布鲁氏菌可以利用赤藓酸糖进行增殖。
83.实施例2：流产布鲁氏菌利用赤藓酸糖代谢基因簇途径代谢赤藓酸糖
84.为进一步验证赤藓酸糖代谢基因簇途径是实施例1中发现的流产布鲁氏菌代谢赤藓酸糖的代谢通路，构建了otnk缺失株，并对其在赤藓酸糖培养基中的生长进行了测定，具体步骤如下：
85.1、otnk自杀性质粒的构建
86.以2308为模板，otnk-uf/ur为引物(seq id no.27、seq id no.28)，pcr扩增otnk基因的上游片段otnk-u；以2308为模板，otnk-df/dr为引物(seq id no.29、seq id no.30)，pcr扩增otnk基因的下游片段otnk-d；pcr扩增体系如下：prime star max premix(2
×
)25μl，上、下游引物各2μl，2308基因组dna模板1μl，dd h2o补足至50μl。pcr反应程序如下：98℃2min；98℃10s，55℃15s，72℃1min，35个循环；72℃10min；16℃10min；1％核酸琼脂凝胶电泳后，分别回收otnk的上下游片段，再以otnk-uf/dr为引物，上游片段otnk-u及下游片段otnk-d各1μl为模板，进行融合pcr，pcr反应程序同上，1％核酸琼脂凝胶电泳后，回收otnk的上下游融合片段。
87.同源重组试剂盒(非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒，诺唯赞，南京，中国，货
号：c112)连接融合基因片段和线性化pkb质粒(构建方法：tian,m.,lian,z.,bao,y.,bao,s.,yin,y.,li,p.,ding,c.,wang,s.,li,t.,qi,j.,wang,x.,yu,s.,2019.identification of a novel,small,conserved hypothetical protein involved in brucella abortus virulence by modifying the expression of multiple genes.transbound emerg dis 66,349-362.)，连接产物化转至大肠杆菌dh5α感受态细胞，经含卡那霉素-lb平板筛选，pcr菌液鉴定，无内毒素质粒小提中量试剂盒提取自杀性质粒pkb-δotnk，测序正确的质粒保存备用。
88.扩增引物序列具体如下：
89.otnk-uf：ggtacccggggatccgtcttcgcacctatggcatc(seq id no.27)
90.otnk-ur：gaacaaatctcaatgacgccaaggcgcatg(seq id no.28)
91.otnk-df：ggcgtcattgagatttgttcgggcagcttg(seq id no.29)
92.otnk-dr：tgcctgcaggtcgaccattttctcgatcaggcggg(seq id no.30)
93.2、缺失株构建
94.复苏流产布鲁氏菌2308，37℃，200r/min培养至对数生长前期，od
600
在0.6～0.8范围内为宜，冰浴15min后，4℃，8000r/min离心5min收集菌体沉淀，预冷的无菌去离子水洗涤菌体两遍，加入预冷的无菌的10％甘油水重悬菌体沉淀并分装为90μl/支，即为布鲁氏菌2308制备的感受态细胞。2μg pkb-δotnk质粒加入感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴10～15min，将混合的感受态布鲁氏菌和质粒加入预冷的一次性电击杯中，在2400v，400ω条件下，将质粒pkb-δotnk电转至2308菌株，再将菌液转至预热37℃的tsb中培养，涂布卡那霉素tsa进行第一次筛选，挑取单克隆在含有卡那霉素的tsb中培养至对数生长期，用无菌pbs稀释1000倍后涂布5％的蔗糖板进行第二次筛选，挑取单克隆在不含抗生素的tsb中培养至对数生长期，分别使用扩增缺失基因外侧片段的引物和扩增缺失基因内侧片段的引物进行pcr鉴定。
95.otnk基因内侧鉴定引物序列如下：
96.in-otnk-f：gaattcaccgtcatctgccc；(seq id no.31)
97.in-otnk-r：cgtcgtttatggccttctcg。(seq id no.32)
98.otnk基因外侧鉴定引物序列如下：
99.out-otnk-f：cgacaggagtgcatgacatg；(seq id no.33)
100.out-otnk-r：cgtgagattgtgctgcttca。(seq id no.34)
101.图3为otnk缺失株的构建，a图为pcr扩增otnk基因的上游片段otnk-u及otnk基因的下游片段otnk-d；b图为otnk的上下游融合pcr；c图和d图为扩增缺失基因外侧(c图)片段和内侧(d图)片段对缺失株进行pcr鉴定，1和2泳道分别为缺失株的两个单克隆，选择外检扩增出条带而内检无扩增条带的2号单克隆为缺失成功的otnk缺失株，e图为pcr鉴定otnk缺失株是否构建成功的示意图。
102.试验1：布鲁氏菌利用赤藓酸糖的分析
103.本试验验证实施例2中人为缺失otnk基因对流产布鲁氏菌利用赤藓酸糖的影响具体如下：
104.分别将野生株2308、缺失株2308δotnk在tsb培养基中培养至对数生长期，离心收集菌体，用不含任何碳源的基础培养基mm洗涤一次后，调整至od
600
＝1.0，按照1:10的比例
转接至含有10mm d-赤藓酸糖/l-苏糖酸的基础培养基mm中，测定流产布鲁氏菌的生长曲线。
105.图4为野生株2308和缺失株2308δotnk分别在l-苏糖酸和d-赤藓酸糖为碳源的培养基中的生长曲线。结果表明，流产布鲁氏菌可以利用d-赤藓酸糖，但不能利用l-苏糖酸，otnk基因缺失后影响了流产布鲁氏菌利用d-赤藓酸糖。流产布鲁氏菌不能利用l-苏糖酸可能是因为ltnd在牛种布鲁氏菌中的移码突变造成的。本实施例构建了流产布鲁氏菌otnk基因缺失株2308δotnk，该缺失株成功阻断了流产布鲁氏菌对d-赤藓酸糖的利用。
106.实施例3：布鲁氏菌偏嗜利用赤藓酸糖和赤藓糖醇促进体外或胞外生长
107.为评估流产布鲁氏菌对赤藓酸糖的利用特性，我们将其与布鲁氏菌可利用的其他碳源如葡萄糖和赤藓糖醇进行比较，首先我们比较了体外布鲁氏菌在不同碳源培养基中的生长速率，然后为了评估赤藓酸糖对布鲁氏菌在胞内复制的影响，我们构建了不能利用赤藓糖醇的缺失株(barbier t.et al.erythritol feeds the pentose phosphate pathway viathree new isomerases leading to d-erythrose-4-phosphate in brucella.proc natl acad sci u sa.2014,111,17815-17820.)，以及不能利用赤藓糖醇和赤藓酸糖的双基因缺失株，具体步骤如下：
108.1、erya自杀性质粒构建
109.按照实施例2中构建otnk自杀性质粒的方法，构建erya自杀性质粒pkb-δerya。扩增引物序列具体如下：
110.erya-uf：ggtacccggggatccttggccgggtggtgggcttg(seq id no.35)
111.erya-ur：cctcgcgggccgaaacgcgcttcacgcatggctgacacag(seq id no.36)
112.erya-df：ctgtgtcagccatgcgtgaagcgcgtttcggcccgcgagg(seq id no.37)
113.erya-dr：tgcctgcaggtcgaccgcggcgtgcggagacgacc(seq id no.38)
114.2、erya和otnk双基因缺失株构建
115.按照实施例2中构建otnk缺失株的方法，构建erya缺失株，命名为2308δerya。将自杀性质粒pkb-δotnk电转至2308δerya缺失株制备的感受态细胞中，经过卡那霉素和蔗糖双重筛选后，挑取单克隆进行pcr鉴定，获得双基因缺失突变株2308δeryaδotnk。
116.erya基因内侧鉴定引物序列如下：
117.in-erya-f：agctgccgggccttgcccaa；(seq id no.39)
118.in-erya-r：agcgcctcgatgaccacatc。(seq id no.40)
119.erya基因外侧鉴定引物序列如下：
120.out-erya-f：cggacacatgatgccggttc；(seq id no.41)
121.out-erya-r：cagcgcttcgcgcacaaggc。(seq id no.42)
122.图5为erya缺失株的构建，a图为pcr扩增erya基因的上游片段erya-u及erya基因的下游片段erya-d，b图为erya的上下游融合pcr。c图和d图为扩增缺失基因内侧(c图)片段和外侧(d图)片段对缺失株进行pcr鉴定，内侧扩增大小为400bp，外侧扩增大小为697bp。1-10泳道分别为缺失株的10个单克隆，11泳道为野生株2308，选择外检扩增出条带而内检无扩增条带的2号单克隆为缺失成功的erya缺失株；e图和f图为使用erya内侧鉴定引物(e图)和otnk内侧鉴定引物(f图)对构建的双基因缺失株2308δeryaδotnk进行pcr鉴定，泳道1为野生株2308，泳道2为2308δotnk，泳道3为2308δotnk，泳道4为2308δeryaδotnk。
123.试验1：2308在不同碳源培养基中体外生长
124.本试验验证了流产布鲁氏菌对赤藓酸糖的利用，首先是在体外培养条件下，对流产布鲁氏菌2308在不同碳源培养基中的生长情况进行了测定，具体如下：
125.将野生株2308在tsb培养基中培养至对数生长期，离心收集菌体，用不含任何碳源的基础培养基mm洗涤一次后，调整至od
600
＝1.0，按照1:10的比例转接至含有10mm d-葡萄糖/d-赤藓酸糖/meso-赤藓糖醇的基础培养基mm中，测定流产布鲁氏菌的生长曲线。
126.图6为流产布鲁氏菌2308在10mm d-葡萄糖/d-赤藓酸糖/meso-赤藓糖醇培养基中体外培养的生长曲线。结果显示，布鲁氏菌在体外培养条件下，d-赤藓酸糖作为唯一碳源时，布鲁氏菌生长速率明显快于以d-葡萄糖作为唯一碳源。
127.试验2：双基因缺失株在不同碳源培养基中体外生长
128.本试验通过实施例3中构建的流产布鲁氏菌基因缺失株，开展了流产布鲁氏菌在不同碳源培养基中生长曲线的测定，具体如下：
129.分别将野生株2308、otnk缺失株2308δotnk、erya缺失株2308δerya、双基因缺失株2308δeryaδotnk在tsb培养基中培养至对数生长期，离心收集菌体，用不含任何碳源的基础培养基mm洗涤一次后，调整至od
600
＝1.0，按照1:10的比例转接至tsb以及含有10mm d-葡萄糖/d-赤藓酸糖/赤藓糖醇的基础培养基mm中，测定流产布鲁氏菌的生长曲线。
130.图7为2308、2308δotnk、2308δerya和2308δeryaδotnk在tsb以及含有10mm d-葡萄糖/d-赤藓酸糖/赤藓糖醇的基础培养基mm中的生长曲线。结果表明，erya和otnk的单缺失或同时双缺失，不影响流产布鲁氏菌在tsb中的生长；erya的缺失会影响流产布鲁氏菌利用赤藓糖醇；otnk的缺失会影响流产布鲁氏菌利用d-赤藓酸糖；erya和otnk的双缺失会导致布鲁氏菌既不能利用赤藓糖醇，也不能利用d-赤藓酸糖。该结果说明，布鲁氏菌利用d-赤藓酸糖代谢缺陷的otnk缺失株构建成功，利用赤藓糖醇代谢缺陷的erya缺失株构建成功，利用d-赤藓酸糖和赤藓糖醇代谢缺陷的双基因缺失株2308δeryaδotnk构建成功。
131.试验3：erya和otnk基因对布鲁氏菌胞内和胞外生长的影响
132.在细胞培养条件下，通过人为添加d-葡萄糖/d-赤藓酸糖/赤藓糖醇，对布鲁氏菌胞内和胞外存活能力进行了测定，具体如下：
133.用流产布鲁氏菌2308感染raw 264.7巨噬细胞，moi为100：1。巨噬细胞的维持生长培养基由rpmi或rpmi+1％葡萄糖或rpmi+1％中赤藓糖醇或rpmi+1％d-赤藓酸糖组成。图8中a图显示，在赤藓糖醇存在条件下巨噬细胞内的细菌未能复制到野生株水平。感染后48小时，在d-赤藓酸糖存在条件下胞内的细菌未能复制到野生株水平。为评估布鲁氏菌胞外复制的能力，我们对感染后细胞做了以下处理：立即用庆大霉素杀死细胞外细菌，然后去除庆大霉素培养基，允许布鲁氏菌细胞外生长。检测细胞外细菌(图8中b图)和细胞内细菌(图8中c图)的cfu/孔。计算细胞外细菌与细胞内细菌的比率(图8中d图)。
134.图8中a图结果显示，加入葡萄糖并不影响布鲁氏菌的细胞内存活。然而，与添加葡萄糖的rpmi和rpmi相比，添加赤藓糖醇的rpmi在24小时和48小时后的细胞内存活率明显下降，这与以前的文献报道一致。与rpmi或补充了葡萄糖的rpmi相比，补充了d-赤藓酸糖的rpmi在感染后48h的细胞内存活率也有所下降，而感染后24h与在rpmi或补充了葡萄糖的rpmi中没有变化，这表明与赤藓糖醇相比，d-赤藓酸糖对布鲁氏菌在细胞内存活的抑制作用明显减弱。流产布鲁氏菌胞外增殖的结果显示，与rpmi和葡萄糖+rpmi相比，d-赤藓酸糖+
rpmi的胞外cfu在感染后24小时和48小时明显增加(图8中b图)；赤藓糖醇+rpmi的胞外cfu在感染后24小时至48小时迅速增殖，但是，在感染后24小时明显减少，其可能原因是由于赤藓糖醇抑制了细胞内布鲁氏菌的复制，细胞外细菌释放的初始数量少于rpmi、rpmi加d-葡萄糖或d-赤藓糖醇的组别。此外，为了同时统计细胞内细菌的数量，用庆大霉素处理细胞，在2小时、24小时和48小时后杀死细胞外细菌，其结果与上述庆大霉素处理的细胞内存活率一致。在rpmi中加上赤藓糖醇或d-赤藓酸糖，细胞内的存活率被明显抑制(图8中c图)。为了清楚地比较细胞外与细胞内细菌的增殖效率，用细胞外细菌的cfu/细胞内细菌的cfu来计算细胞外与细胞内的比率。如图8中d图所示，在rpmi—+赤藓糖醇的维持生长培养基中，细胞外的布鲁氏菌的增殖效率高于细胞内的，这一结果与已报道的结果一致。当赤藓酸糖加入rpmi培养基时，感染24小时和48小时后，细胞外细菌与细胞内细菌的比例明显增加，分别比rpmi组高出约2.8倍和30倍，表明d-赤藓酸糖促进细胞外布鲁氏菌的增殖，而不是细胞内增殖。
135.本实施例提供了流产布鲁氏菌erya基因缺失株2308δerya，该缺失株成功阻断了流产布鲁氏菌对d-赤藓糖醇的利用。提供了流产布鲁氏菌erya和otnk双基因缺失株2308δeryaδotnk，该缺失株成功阻断了流产布鲁氏菌对d-赤藓酸糖和赤藓糖醇的利用。此外，本实施例发现了相比于葡萄糖，当四碳酸糖作为碳源存在时，布鲁氏菌在体外和细胞外的增殖效率更高。
136.实施例4：四碳酸糖代谢与流产布鲁氏菌感染引起孕鼠流产和炎症反应相关
137.赤藓糖醇在流产胎盘中的高含量被认为与宿主的流产和炎症相关，上述研究中发现，新发现的赤藓酸糖与赤藓糖醇在体外和胞外有着相似的特性，为评估赤藓酸糖是否也与孕畜流产相关，本发明使用妊娠小鼠模型评估了布鲁氏菌四碳酸糖利用对致孕畜流产和胎盘炎性反应的影响，具体如下：
138.试验1：妊娠小鼠致病性评估
139.每个处理组取3-6只妊娠小鼠，在妊娠5天时用1
×
105cfu的流产布鲁氏菌2308或2308δotnk、2308δerya、2308δeryaδotnk进行腹腔感染。感染后13天(相当于妊娠第18天)，根据胎儿的存活、大小和皮肤颜色来评估胎儿的存活率。如果胎儿有明显的血管，皮肤呈亮粉色，并且在妊娠期有正常的大小，则被判定为存活胎儿。如果胎儿缺乏可见的血管，皮肤苍白或不透明，与同窝胎儿相比，其大小不足，或有胎儿重吸收的迹象，则被判定为不能存活。用[(每窝存活的胎儿数/每窝胎儿总数)
×
100]来计算胎儿存活率。此外，在尸检时无菌采集脾脏和胎盘进行细菌学分析、基因表达分析，同时采集胎盘样本，在10％福尔马林中固定，用苏木精和伊红对固定的胎盘切片进行染色。中性粒细胞浸润、滋养层细胞死亡或凝固性坏死以及血管病变是观察胎盘切片的一些主要指标。
[0140]
图9中a图结果显示，2308δotnk、2308δerya和2308δeryaδotnk感染的脾脏中cfu与2308感染相比有所减少，但没有明显差异(p》0.0500)。同时，感染2308δotnk和2308δerya的胎盘cfu与2308感染相比没有变化(图9中b图)。然而，与2308菌株相比，2308δeryaδotnk的胎盘定殖明显减少(图9中b图)。如上所述，赤藓酸糖是布鲁氏菌利用的首选碳源，可以促进细胞外布鲁氏菌的增殖，赤藓酸糖或苏糖酸激活了醛缩酶-duf1537代谢途径。为了探讨在胎盘中布鲁氏菌对赤藓酸糖的利用情况，采用qpcr评估醛缩酶-duf1537途径中7个基因的表达情况，结果显示6个基因(除ltnd基因外)在胎盘中的表达量明显增加
(图9中c图)，表明醛缩酶-duf1537途径代谢赤藓酸糖在孕鼠胎盘中被明显激活。为了评估布鲁氏菌感染胎盘的炎症反应，通过qpcr分析胎盘中tnfα、il-1β、ip-10和mip-1β的转录水平，图9中d图表明与pbs组相比，2308感染时细胞因子的转录明显增加，在2308δotnk和2308δerya感染中，细胞因子水平相对于2308略有下降，没有明显差异。有趣的是，与2308相比，2308δeryaδotnk感染的胎盘中细胞因子的转录明显减少，与pbs组相似(图9中d图)。同时，还测定了怀孕小鼠血清中il-6和tnfα的释放量，图9中e图和图9中f图结果显示，2308δeryaδotnk感染与2308感染相比，血清中il-6和tnfα的产生量明显下降，2308δotnk和2308δerya感染相对于2308也出现了il-6和tnfα的下降，但没有明显差异，这与感染胎盘的结果一致。此外，我们进一步评估了布鲁氏菌感染对胎盘的组织病理学变化。如图9中h图所示，2308感染者表现出明显的胎盘炎的病理变化，如中性粒细胞浸润、坏死和钙化；2308δotnk和2308δerya感染在胎盘中表现出的病理变化略为轻微，但仍与2308相似，而2308δeryaδotnk感染在胎盘中几乎没有表现出组织病理学变化。此外，对2308、2308δotnk、2308δerya和2308δeryaδotnk感染的怀孕小鼠的胎儿存活率进行了统计分析，结果显示，在2308感染的怀孕小鼠中，31.8％的幼崽可以存活，个别胎儿表现出明显的钙化，被子宫重新吸收(图9中i图和图10)。在2308δotnk和2308δerya感染中，胎儿的存活率相对于2308明显增加，分别为64.8％和64.7％。2308δeryaδotnk感染的怀孕小鼠显示84.4％的胎儿存活率，大大高于2308，接近pbs组的92.1％的存活率(图9中i图)。这些数据表明，赤藓酸糖和赤藓糖醇代谢途径协同工作，在诱导怀孕小鼠的胎盘炎症和流产中起着关键作用。
[0141]
本实施例发现双基因缺失株2308δeryaδotnk对妊娠小鼠的致病性显著降低，显著减弱孕鼠流产和致胎盘炎的特性，在后续制备布鲁氏菌弱毒疫苗具有重要的应用价值。
[0142]
宿主动物的生殖器官中富含赤藓酸糖和赤藓糖醇，本发明发现了一种流产布鲁氏菌赤藓酸糖代谢基因簇以及该基因簇有利于布鲁菌在细胞外的大量增殖。该发明阐释了布鲁氏菌感染导致生殖器官发生严重的炎症反应并诱发死胎和流产的新机制。
[0143]
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一株流产布鲁氏菌，其特征在于，该菌株醛缩酶-duf1537代谢通路被阻断；或者该菌株中erya基因和/或otnk基因沉默。2.根据权利要求1所述的流产布鲁氏菌，其特征在于，通过以下方式阻断醛缩酶-duf1537代谢通路：mfs基因、otnc基因、dend基因、vdtr基因、otni基因、otnk基因和ltnd基因中的任何一个或多个基因处于沉默状态。3.一株流产布鲁氏菌，其特征在于，该菌株无法利用赤藓糖醇和/或d-赤藓酸糖作为碳源。4.一种布鲁氏菌弱毒疫苗，其特征在于，所述的布鲁氏菌无法利用赤藓糖醇和/或d-赤藓酸糖作为碳源；或者所述的布鲁氏菌以下一个或者多个基因沉默：mfs基因、otnc基因、dend基因、vdtr基因、otni基因、otnk基因、ltnd基因和erya基因。5.根据权利要求4所述的布鲁氏菌弱毒疫苗，其特征在于，所述的布鲁氏菌的otnk基因和/或erya基因沉默。6.一株流产布鲁氏菌或者布鲁氏菌弱毒疫苗，其特征在于，所述的布鲁氏菌中erya基因和/或otnk基因缺失。7.如权利要求1所述的流产布鲁氏菌的构建方法或者如权利要求4所述的布鲁氏菌弱毒疫苗的制备方法，其特征在于，通过敲除、插入或者替换mfs基因、otnc基因、dend基因、vdtr基因、otni基因、otnk基因、ltnd基因和erya基因中的任意一个或者多个基因的核苷酸片段中的全部或者部分和核苷酸实现对应基因的沉默。8.根据权利要求7所述的构建方法或制备方法，其特征在于，包括以下步骤：通过构建otnk基因和/或erya基因的自杀性质粒pkbδotnk和/或自杀性质粒pkbδerya，将自杀性质粒pkbδotnk和/或自杀性质粒pkbδerya导入流产布鲁氏菌。9.如权利要求1所述的流产布鲁氏菌在制备布鲁氏菌弱毒疫苗中的应用。10.流产布鲁氏菌的mfs基因、otnc基因、dend基因、vdtr基因、otni基因、otnk基因、ltnd基因在流产布鲁氏菌代谢四碳酸糖中的应用；或流产布鲁氏菌的erya基因在流产布鲁氏菌代谢赤藓糖醇中的应用。

技术总结
本发明公开了一株流产布鲁氏菌、布鲁氏菌弱毒疫苗、构建方法及应用。该流产布鲁氏菌的醛缩酶-DUF1537代谢通路被阻断；或者该菌株中eryA基因和/或otnk基因沉默。本发明通过发现新的布鲁氏菌利用的四碳酸糖代谢通路，揭示了布鲁氏菌利用偏嗜碳源促进快速增殖，引起孕畜流产和炎性反应的机制，并且通过沉默对应基因，制备了布鲁氏菌弱毒疫苗。制备了布鲁氏菌弱毒疫苗。制备了布鲁氏菌弱毒疫苗。


技术研发人员：于圣青 田明星 尹伊
受保护的技术使用者：扬州优佳创生物科技有限公司
技术研发日：2022.08.29
技术公布日：2023/7/31