一种紫草素靶向递送胶束及其制备方法和用途

1.本发明涉及药物领域，具体涉及一种紫草素靶向递送胶束及其制备方法和 用途。


背景技术：

2.三阴性乳腺癌(tnbc)是一种高度侵袭性、经常复发且预后差的乳腺癌亚 型。目前可用的药物由于缺乏有效的靶点，导致tnbc被认为是不治之症。因此， tnbc治疗迫切需要新的治疗策略。线粒体是一种细胞器，已被证实影响肿瘤发 生的几乎所有步骤，是开发抗癌药物的一个有希望的靶点。就tnbc而言，肿瘤 细胞中最常见的代谢表型是线粒体型，其次是谷氨酰胺分解和糖酵解型。此外， tnbc的进展伴随着线粒体生物合成的增强，而线粒体生物合成的抑制有效地降 低了tnbc细胞的侵袭和转移能力。因此，这些临床研究提示线粒体靶向药物治 疗可能是克服非靶向tnbc的潜在策略。
3.三苯基膦(tpp)这种阳离子化合物，通常被用作介导纳米颗粒线粒体靶向 性的特异性配体。据报道，其在线粒体膜负电位引导下协助纳米粒穿过膜孔，促 进纳米颗粒在线粒体中的积累。然而，开发tpp修饰的线粒体靶向纳米颗粒的主 要障碍是克服循环中的消除以最大限度地扩大肿瘤病灶分布。在存在生物流体 的情况下，阳离子纳米颗粒表面形成“蛋白质冠”，通常导致纳米颗粒通过网状 内皮系统(res)或单核吞噬细胞系统(mps)从循环中清除。几十年来，人们 提出了许多策略来克服这些挑战，例如通过在纳米颗粒表面掺入聚乙二醇(peg) 来逃避免疫监视，并结合肿瘤细胞靶向部分以促进纳米颗粒在肿瘤中的积累。然 而，越来越多的证据显示聚乙二醇化和配体介导的主动靶向策略存在局限性，包 括反复注射聚乙二醇化纳米颗粒容易诱导抗聚乙二醇免疫反应以及由于不可控 修饰导致的主动靶向效率低下。
4.紫草素(sk)是从紫草根中提取的主要活性成分，由于对多种癌症具有强 大的抑制活性，成为一种很有前途的抗癌候选药物。sk干扰线粒体能量产生和 ros生成，导致凋亡的诱导。研究发现，sk在体外和活体内都能有效抑制tnbc 细胞的生长和转移，这表明sk是治疗tnbc的一种有吸引力的生物活性化合物。 然而，sk具有较高的亲脂性，容易被氧化和聚合，导致稳定性差和口服生物利 用度低。因此，为实现tnbc的最佳抗癌效果，有必要开发一种协助sk克服体内 屏障并在肿瘤病变处特别是细胞线粒体部位实现特异性积聚的递送材料，从而 更有效的发挥紫草素的抗癌作用。


技术实现要素：

5.为解决现有技术中存在的问题，一方面，本发明提供一种紫草素靶向胶束， 所述胶束由红细胞膜或经改性的红细胞膜包覆含负载紫草素(简称sk)的阳离 子纳米颗粒，所述负载紫草素的阳离子纳米颗粒中，紫草素与嵌段共聚物tpp
‑ꢀ
peg
n1-pcl
m1
、tpp-peg
n2-hyd-pcl
m2
、mpeg
n3-pcl
m3
的pcl端形成疏水内核， peg在中间形成亲水层。
6.根据本发明的实施方案，所述红细胞膜或经改性的红细胞膜在tpp的静电 吸附力作用下在外侧形成具有仿生功能的壳。未结合红细胞膜的tpp具有对线 粒体的靶向功能。
7.根据本发明的实施方案，tpp即pph3br-(ch2)
4-cooh的缩写。tpp通过羧 基与nh
2-peg
n1-pcl
m1
经缩合反应相连。所述tpp-peg
n1-pcl
m1
如下结构所示：
[0008][0009]
所述tpp-peg
n1-pcl
m1
中，n1选自1000-5000，优选的，为2000-3500，例 如为2000；m1选自5000-10000，优选的，为5000-8000，例如为6600；
[0010]
根据本发明的实施方案，所述tpp-peg
n2-hyd-pcl
m2
如下结构所示：
[0011][0012]
所述tpp-peg
n2-hyd-pcl
m2
中，n2选自1000-5000，优选的，为2000-3500， 例如为3400；m2选自5000-10000，优选的，为5000-8000，例如为6600。
[0013]
所述mpeg
n3-pcl
m3
结构如下所示：
[0014][0015]
n3选自1000-5000，优选的，为2000-3500，例如为2000；m3选自2000
‑ꢀ
10000，优选的，为5000-8000，例如为6600。
[0016]
根据本发明的实施方案，所述经改性的红细胞膜为通过fa-peg
n4-fa改性 的红细胞膜；其中fa代表叶酸，所述fa-peg
n4-fa结构如下所示：
[0017][0018]
其中，n4选自500-8000，优选的，为1000-5000，例如为1000，2000，3400。
[0019]
根据本发明的实施方案，所述经改性的红细胞膜(红细胞膜简写为rbcm) 的制备方法包括如下步骤：
[0020]
使用具有不同peg长度的fa-peg
n4-fa与rbcm以1:1的质量比孵育。优 选的，在37℃下预混合20-40min，可使fa-peg
n4-fa插入rbcm的外膜。
[0021]
根据本发明的实施方案，所述经改性的红细胞膜的制备方法具体包括如下 步骤中的一步或多步：
[0022]
(a1)收集红细胞并分离红细胞膜，并在pbs(1x)中重新悬浮；
[0023]
(b1)改性前，对rbcm进行超声波浴处理(200w)4-10分钟；
[0024]
(c1)使用fa-peg
n4-fa与rbcm以1:1的质量比孵育，在37℃下预混合 20-40min，可使fa-peg
n4-fa插入rbcm的外膜；
[0025]
(d1)超滤去除未结合的fa-peg
n4-fa。
[0026]
根据本发明的实施方案，在孵化之前，通过bca蛋白质分析试剂盒定量 rbcm的蛋白质浓度；所述蛋白质浓度为1.5mg/ml；
[0027]
根据本发明的实施方案，所述fa-peg
n4-fa溶解在dmso中，浓度为50
‑ꢀ
100mg/ml，例如为80mg/ml。
[0028]
根据本发明的实施方案，所述tpp-peg
n1-pcl
m1
、tpp-peg
n2-hyd-pcl
m2
的 制备方法包括如下步骤：
[0029]
(a2)将tpp和edcl分别溶解于有机溶剂a中；
[0030]
(b2)将hobt溶解于有机溶剂b中；
[0031]
(c2)将步骤(a)和(b)的溶液加入反应容器，并在室温下搅拌20-60分 钟；
[0032]
(d2)将nh
2-peg
n1-pcl
m1
(0.86g，0.1mmol)或nh
2-peg
n2-hyd-pcl
m2
溶 解于有机溶剂b中并逐滴添加到步骤(c)所得溶液中，在室温、氮气下搅拌过 夜；
[0033]
(e2)将步骤(d)所得反应混合液用去离子水透析(mwco，3500da)12
‑ꢀ
36小时并冷冻干燥，即获得tpp-peg
n1-pcl
m1
、tpp-peg
n2-hyd-pcl
m2
。
[0034]
根据本发明的实施方案，所述有机溶剂a选自二甲基亚砜，丙酮中的一种 或两种；有机溶剂b选自四氢呋喃，丙酮中的一种或两种。
[0035]
根据本发明的实施方案，所述负载紫草素的阳离子纳米颗粒中，所述tpp
‑ꢀ
peg
n1-pcl
m1
、tpp-peg
n2-hyd-pcl
m2
、mpeg
n3-pcl
m3
的质量比为1-10：1-10： 1-10；优选的，为1:1:2。
[0036]
根据本发明的实施方案，所述负载紫草素的阳离子纳米颗粒采用如下方法 制备：
[0037]
(a3)将所述tpp-peg
n1-pcl
m1
、tpp-peg
n2-hyd-pcl
m2
、mpeg
n3-pcl
m3
和 sk溶解于有机溶剂c中，并在搅拌下注入去离子水；
[0038]
(b3)在室温下搅拌0.2-1小时，蒸发溶液以去除有机溶剂，离心超滤10
‑ꢀ
40min，通过0.45μm-0.8μm过滤器分离并去除未利用的sk。
[0039]
根据本发明的实施方案，所述有机溶剂c选自丙酮，二甲基亚砜、四氢呋 喃中的一种或多种；所述嵌段聚合物tpp-peg
n1-pcl
m1
、tpp-peg
n2-hyd-pcl
m2
、 mpeg
n3-pcl
m3
的总和质量与sk的质量比值为1:10-50，优选为1:15-25，例如 为1:20；所述sk与有机溶剂的质量体积比为1:1-4mg/ml，例如为1:2mg/ml。 所述离心超滤优选用amicon ultra-15管(mwco 100kda)对得到的溶液进行 3次3500
×
g离心超滤。
[0040]
根据本发明的实施方案，所述红细胞膜或经改性的红细胞膜包覆采用如下 方案：
[0041]
(a4)将负载紫草素的阳离子纳米颗粒加入所述红细胞膜或经改性的红细 胞膜溶液的pbs溶液中，旋转20-40秒，并在37℃下培养20-40min；
[0042]
(b4)对溶液进行超声处理；
[0043]
(c4)使用挤出机通过200nm聚碳酸酯膜挤出以接收thtm/sk@rbcm和 thtm/sk@fp-rbcm。
[0044]
根据本发明的实施方案，所述超声条件为在水浴超声波200w，4-6分钟条 件下；所述负载紫草素的阳离子纳米颗粒与所述红细胞膜或经改性的红细胞膜 的质量比为10-80:1，优选为10:1。
[0045]
又一方面，本发明提供所述紫草素靶向胶束的制备方法，所述制备方法包括 如下步骤：
[0046]
(1)制备嵌段共聚物tpp-peg
n1-pcl
m1
、tpp-peg
n2-hyd-pcl
m2
；优选的， 采用如前文所述方法；
[0047]
(2)采用嵌段共聚物tpp-peg
n1-pcl
m1
、tpp-peg
n2-hyd-pcl
m2
、mpeg
n3
‑ꢀ
pcl
m3
制备负载紫草素的阳离子纳米颗粒；优选的，采用如前文所述方法；
[0048]
(3)采用红细胞膜或经改性的红细胞膜包覆所述负载紫草素的阳离子纳米 颗粒；优选的，采用如前文所述方法。
[0049]
又一方面，本发明提供所述紫草素靶向胶束在制备治疗癌症的药物中的应 用。
[0050]
又一方面，本发明提供所述紫草素靶向胶束在制备抑制癌症细胞中线粒体 生物合成的药物中的应用。
[0051]
根据本发明的实施方案，所述癌症包括上皮细胞源性的癌症，例如选自乳腺 癌、基底细胞癌、腺癌、胃肠癌、唇癌、口腔癌、食管癌、小肠癌、胃癌、结肠 癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、皮肤癌、前列腺癌和肾细 胞癌；优选的，所述乳腺癌为三阴乳腺癌。
[0052]
有益效果
[0053]
本发明通过有效的递送载体体系，可以将紫草素活性成分有效富集在治疗 靶点，有利于提高临床治疗效果和顺应性，增效减毒。
附图说明
[0054]
图1(a)kaplan
–
meier分析不同polg表达水平的tnbc患者无远处转移 生存时间(dmfs)存期的差异(n＝434)；(b)多重荧光染色分析tnbc肿瘤 组织芯片中pan-ck,pgc-1α和polg表达的差异。细胞核用dapi染色定位； (c)tnbc肿瘤组织中pgc-1α和polg表达的水平(n＝39)；(d)tnbc肿 瘤组织中pgc-1α和polg表达呈正相关((r＝0.597,p《0.0001，n＝39)；(e) 紫草素和polg的分子对接情况；(f)mst法检测polg与紫草素结合的亲和 力；(g)紫草素抑制tnbc细胞mda-mb-231中线粒体、细胞浆和总polg 表达的影响。
[0055]
图2(a)rbcm包栽胶束在ph 7.4和5.5磷酸盐缓冲介质中的粒径分布； (b)rbcm包栽胶束在ph 7.4和5.5磷酸盐缓冲介质中的zeta电位(n＝3)； (c)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳检测rbcm，红细胞裂解物、 thtm/sk@rbcm,thtm/sk@fp-rbcm and thtm/sk中的蛋白质含量情况； (d)游离sk、rbcm、游离fa、thtm@fp-rbcm和thtm/sk@fp-rbcm的 紫外-可见光谱：(e,f,g)nm/sk,tm/sk,thtm/sk,thtm/sk@rbcm和 thtm/sk@fp-rbcm的直径、pdi
(e)、zeta电位(f)和lr、lc(g)(n＝3)；(h) 透射电子显微镜拍照检测thtm/sk,thtm/sk@rbcm和thtm/sk@fp
‑ꢀ
rbcm(标尺＝100nm)的形态和大小，标尺＝50nm，数据为平均值
±
标准差。
[0056]
图3(a,b)包载c6的胶束(绿色荧光，黑色线)与mda-mb-231细胞共培 养2小时(a)和4小时(b)后，与溶酶体(红色荧光，灰色线)红定位的情况，通 过operetta cls高含量成像系统(标尺＝50μm)拍照；(c,d)包载c6的胶束 (绿色荧光，黑色线)与mda-mb-231细胞共培养2小时(a)和4小时(b)后，与 线粒体(红色荧光，灰色线)共定位(黑色线与灰色线重叠表示共定位)的情况。 通过operetta cls高含量成像系统(标尺＝50μm)拍照。
[0057]
图4(a)游离紫草素和包载了紫草素的药物载体对mda-mb-231细胞中 线粒体含量的影响；(b)游离紫草素和包栽了紫草素的药物载体对mda-mb
‑ꢀ
231细胞中线粒体dna(mtdna)含量的影响；(c)游离紫草素和包载了紫草 素的药物载体对mda-mb-231细胞中atp含量的影响；(d)游离紫草素和包 载了紫草素的药物载体对mda-mb-231细胞活力的影响；(e)游离紫草素和包 载了紫草素的药物载体对mda-mb-231细胞中线粒体、细胞浆中polg和pgc
‑ꢀ
1α表达的影响；(f)游离紫草素和包载了紫草素的药物载体对mda-mb-231 细胞迁移和侵袭的影响。
[0058]
图5(a)红细胞膜包栽的胶束在体内的情况；(b)western blot分析红细 胞膜、thtm/sk@rbcm、thtm/sk@fp-rbcm和thtm/sk等制剂中蛋白标 记物cd47的含量，其中膜蛋白用na
+-k
+-atp酶作为内参；(c)thtm/sk@rbcm 和thtm/sk@fp-rbcm的透射电镜图像(标尺＝50nm)，用免疫金标记cd47， 黑点表示；(d)小鼠静脉注射游离sk、nm/sk、thtm/sk、thtm/sk@rbcm、 thtm/sk@fp-rbcm后sk的血药浓度-时间曲线(n＝5)。数据为平均值
±
sd。 (e)nm/sk、thtm/sk、thtm/sk@rbcm、thtm/sk@fp-rbcm在ph7.4含 50％胎牛血清的pbs中直径在12h内的变化(n＝3)；(f)红细胞与nm/c6、 thtm/c6、thtm/c6@rbcm和thtm/c6@fp-rbcm在ph 7.4pbs中24小时 的结合率(n＝3)；(g)白细胞与nm/c6、thtm/c6、thtm/c6@rbcm和 thtm/c6@fp-rbcm在ph 7.4 pbs中24小时的结合率(n＝3)；
[0059]
图6(a)用活体成像系统观察尾静脉注射thtm/dir、thtm/dir@rbcm、 thtm/dir@fp-rbcm 2,6,12,24h后，dir在原位接种tnbc细胞小鼠体内的分 布；(b)静脉注射thtm/dir、thtm/dir@rbcm、thtm/dir@fp-rbcm 24 h后，在肿瘤、心、肝、肺及肾脏中的分布；(c，d)采用ivis luminaⅲ活体 成像系统分析thtm/dir、thtm/dir@rbcm、thtm/dir@fp-rbcm在肿瘤和 内脏器官中的强度.数据为平均值
±
sd，*p《0.05。
[0060]
图7(a)nod/scid小鼠乳腺脂肪垫注射mda-mb-231细胞用于肿瘤生 长研究的治疗时间线；(b)绘制肿瘤体积生长曲线分析游离sk和包栽sk的 药物载体对肿瘤生长的影响(n＝6)；(c)给药14天后检测瘤重(n＝6)；(d) 给药14天后拍照观察肿瘤组织；(e)药物治疗尾静脉注射mda-mb-231(luc 1)细胞于nod/scid小鼠体内构建肺转移模型的时间线；(f)药物治疗肺转移 模型7、14和21天后活体成像情况。发光部分代表肺转移灶；(g)不同治疗组 肺组织的代表性照片；(h)不同治疗组肺转移节结数的统计学结果(n＝3)；(i) 转移性肺组织代表性h&e染色结果(100
×
；n＝6，标尺＝100μm)；(j)根据h&e染色切片照片计算肺转移灶的平均面积(n＝6)；(k)免疫组织化学法检测 肿瘤和肺组织中polg和pgc-1α的表达情况(400
×
；n＝6，标尺＝50μm)；(l) 采用imagej软件进行对免疫组织化学染色进行定量分析，结果代表相对染色强 度(n＝5)。数据为平均值
±
sd，*p《0.05，**p《0.01。
[0061]
图8示意实施例2合成的tpp-peg-pcl的1h-nmr和
31
p-nmr光谱。
[0062]
图9示意tpp-peg-hyd-pcl的1h-nmr和
31
p-nmr光谱。
[0063]
图10示意tm/sk胶束中tpp-peg-pcl百分比的优化。
[0064]
图11示意聚合物/rbcm比率和peg链长度的优化。
[0065]
图12示意thtm/sk@fp-rbcm在ph7.4、6.8和5.5pbs缓冲液(0.01m， 含0.5％吐温80)中释放sk的行为。
[0066]
图13示意空白载体对mda-mb-231细胞的细胞毒性。
[0067]
图14示意装载c6胶束的特性。
[0068]
图15示意装载dir胶束的特性。
[0069]
图16示意sk制剂对雌性nod/scid小鼠体重和主要器官组织病理学的 影响。
具体实施方式
[0070]
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当 理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保 护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护 的范围内。
[0071]
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通 过已知方法制备。实施例中所涉及实验材料、试剂、仪器以及相关测试说明如下：
[0072]
(一)材料和试剂：
[0073]
nh
2-peg
2k-pcl
6.6k
,nh
2-peg
3.4k-hyd-pcl
6.6k
，mpeg
2k-pcl
6.6k
和fa-peg
‑ꢀ
fa(peg
1k
,peg
2k and peg
3.4k
)购买自西安瑞溪生物技术有限公司(中国陕西)。 n-(羰基甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dspe
‑ꢀ
peg2000)和dotap氯化物从nof公司(日本东京)获得。sk(纯度98.0％，批 号c12097235)和1,1
’‑
二十八烷基-3,3,3’，3
’‑
四甲基吲哚三碳菁(dir，纯度≥ 95.0％，批号c11697305)购自macklin生化有限公司(中国上海)。香豆素6(c6， 纯度≥98.0％，批号j1916037)从阿拉丁试剂有限公司(中国上海)获得。
[0074]
(二)仪器和测试方法：
[0075]
胶束的粒径、多分散指数(pdi)和zeta电位由nanobrook 90pluspals(美 国纽约布鲁克黑文)测量。检测前，所有样品均用ph值为7.4的磷酸盐缓冲液(0.01 m)稀释10倍。对于ph敏感性研究，thtm/sk@rbcm和thtm/sk@fp-rbcm 用ph值为5.5或7.4的磷酸盐缓冲液(0.01m)稀释10倍，并在检测前培养3小时。
[0076]
thtm/sk、thtm/sk@rbcm和thtm/sk@fp-的形态利用负染色法，通过 透射电镜(tem)观察rbcm。简单地说，将胶束吸附到铜网格上，并用2％磷钨 酸溶液(ph 7.0)染色30秒。在120kv的加速电压下，通过tem(ht7800，日立 有限公司，日本东京)观察网格，并用ccd相机拍摄数字图像。
[0077]
(三)sk负载率、负载能力和释放行为的检测
[0078]
通过hplc(lc-16，中国苏州岛津)和uv检测器(spd-16，中国苏州岛津) 检测sk负载胶束的载药率(lr)和载药量(lc)。具体的，将胶束样品以1:20 的体积比溶解在甲醇中，并超声处理20分钟以打破胶束获得游离sk。hederaods-c18柱(250
×
4.6mm，5m、使用hanbon，江苏，中国)并使用甲醇：3％ 乙酸(90:10，v/v)以1ml/min的流速分析样品，在516nm处检测。根据以下公 式计算sk的lc和lr。
[0079][0080][0081]
胶束中sk的释药行为采用膜透析技术进行研究。在释放介质的制备中，分 别使用含有0.5％吐温80的ph 7.4、6.8和5.5磷酸盐缓冲液(0.01m)刺激生理条件、 肿瘤微环境和溶酶体。将300微升胶束置于透析袋(mwco，12kda)中，并在 管中暴露于20ml培养基中。试管在37℃水浴中培养，并以50rpm/min的速度摇 动。在适当的时间间隔，取出200μl培养基，并补充相同体积的新鲜培养基。通 过相同的hplc方法检测样品。
[0082]
(四)胶束的体外细胞内转运
[0083]
使用operetta cls高含量成像系统(德国柏林perkinlemer)捕获胶束的细胞 内运输，并使用imagej软件(v.1.8.0)量化共焦信息。具体的，将mda-mb-231 细胞(6000个细胞/孔)接种在viewplate-96微孔板(perkinlemer)中24小时，然 后用nm/c6、tm/c6、thtm/c6、thtm/c6@rbcm和thtm/c6@fp-rbcm在等 浓度的c6下处理。孵育2或4小时后，用线粒体示踪剂mitotracker deep red fm (thermo，2179203600nm)或溶酶体示踪剂lysodeep red(abcam，ab176829， 1:500)染色30分钟，最后用hoechst 33342(1μg/ml)染色30分钟。
[0084]
线粒体质量用mitotracker green fm染料进行标记。收集细胞并在37℃下 与100nm mitotracker green fm孵育35分钟。使用novocyte流式细胞仪在 ex/em＝488/525nm处检测荧光强度，并使用novoexpress软件(美国加利福尼亚 州acea biosciences)进行分析。
[0085]
使用含有pmsf和蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液裂解细胞，并使用bca 蛋白质分析试剂盒(thermo)测量蛋白质浓度。使用发光atp测定试剂盒(美国 加利福尼亚州卡尔斯巴德市invitrogen)评估atp含量，并使用varioskan多模微 孔板阅读器(thermo)在560nm处检测atp含量。atp水平标准化为蛋白质浓度。
[0086]
实施例1紫草素经由靶向polg抑制tnbc细胞中线粒体生物合成
[0087]
作为线粒体中的dna聚合酶，polg是线粒体dna修复和复制所必需的， 因此它是调节线粒体生物合成和功能的关键介质。本发明分析了polg mrna表 达与tnbc乳腺癌患者预后的相关性。kaplan-meier plotter数据库进行分析显 示，polg高表达的tnbc乳腺癌患者比polg低表达的tnbc乳腺癌患者的 无远处转移生存时间(dmfs)更短(图1a)。polg在乳腺癌患者中的高表达 预示着预后不良。此外，使用肿瘤组织芯片的多重免疫荧光染色来确定polg表 达是否与tnbc组织中的线粒体生物合成有关(图1b)。过氧化物酶体增殖物 激活受体γ-辅激活因子(pgc-1α)的表达用于指示线粒体生物生物合成，pan
‑ꢀ
ck用于区分tnbc组织中的肿瘤细胞和基质细胞。发明人发现，pgc-1α蛋白 在肿瘤细胞(pan-ck
+
)中的表达高于基质细胞(pan-ck-)，这表明肿瘤细胞中 的线粒体生物合成比tnbc组织中的基质细胞更活跃(图1c)。同样，polg在 肿瘤细胞中的表达也很高，但在基质细胞中的表达较低。根据非参数spearman 相关检验，我们发现在tnbc样本的肿瘤细胞中polg和polg表达之间存在 正相关性(r＝0.59，p《0.001，图1d)。
[0088]
使用autodock vina软件分析紫草素对polg的潜在亲和力。在polg的这 些残基中，asp-890和asp-1135是用于磷酸转移的催化残基；lys-947是o-螺 旋指结构域上带正电
荷的残基，负责三磷酸盐结合；tyr-951参与核糖识别。研 究结果表明紫草素被预测与polg的活性残基形成氢键，包括asp-890、asp
‑ꢀ
1135、lys-947和tyr-951(图1e)。此外，通过mst分析进一步证实紫草素 和polg的结合能力。将不同浓度的紫草素与含有gfp标记的polg或游离 gfp的细胞裂解物孵育。结果表明紫草素能够与gfp-polg结合，形成典型的 结合曲线(kd＝3.1
±
0.4
×
e-5
m)，这在gfp中未观察到(图1f)。此外，紫草素 降低了tnbc mda-mb-231细胞的线粒体polg水平以及细胞质和总polg水 平(图1g)。总之，实验显示肿瘤组织中的polg预测乳腺癌患者预后不良， 是减少tnbc细胞线粒体生物合成的一个有希望的靶点，紫草素靶向polg表 明其对tnbc细胞线粒体的抑制潜力。
[0089]
实施例2fp-rbcm包覆紫草素的胶束制备与表征
[0090]
2.1紫草素靶向修饰策略
[0091]
叶酸(fa)是红细胞形成血红素所必需的，血红素是血红蛋白的一部分， 叶酸受体(fr)广泛分布在rbcm(红细胞膜)上。在tnbc细胞上也检测到 叶酸受体α(frα)的过度表达。因此，本发明采用rbcm修饰策略来实现定 向膜包裹。将不同链长的聚乙二醇(peg)衍生物与两端的fa偶联，合成fa
‑ꢀ
peg-fa。在膜覆盖之前，rbcm和fa-peg-fa的共孵育有望通过特定的配体
‑ꢀ
受体相互作用将一头fa-peg-fa与rbcm的fr结合，从而获得修饰的rbcm (fp-rbcm)。peg链在rbcm上形成的水合壳可以阻止纳米颗粒核与rbc 外膜之间的吸引，从而避免细胞膜的随机吸附和崩塌。fp-rbcm保证了rbcm 维持长循环的功能，fa暴露在rbcm表面使纳米颗粒通过锚定frα对tnbc 细胞具有靶向性。
[0092]
2.2胶束制备方法
[0093]
胶束的制备包括thtm/sk胶束的制备和rbcm的膜提取、修饰和包覆。具 体如下：
[0094]
2.2.1 tpp-peg
2k-pcl
6.6k and tpp-peg
3.4k-hyd-pcl
6.6k
的合成 将(4-羧丁基)三苯基溴化膦(tpp，0.09g，0.2mmol)和(1-(3-二甲氨基丙 基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edci，0.04g，0.2mmol)分别溶解于1ml二甲 基亚砜中。将1-羟基苯并三唑一水合物(hobt，0.03mg，0.2mmol)溶解于 1ml四氢呋喃中。将上述溶液加入圆底烧瓶中，并在室温下搅拌30分钟。nh2‑ꢀ
peg
2k-pcl
6.6k
(0.86g，0.1mmol)或nh
2-peg
3.4k-hyd-pcl
6.6k
溶解于2ml四氢呋 喃(0.90g，0.1mmol)并逐滴添加到活化tpp中，并在室温、氮气下搅拌过夜。 所得反应混合物用去离子水透析(mwco，3500da)24小时并冷冻干燥，获得 白色固体形式的tpp-peg
2k-pcl
6.6k
和tpp-peg
3.4k-hyd-pcl
6.6k
，产率分别为 84.5％(0.765g)和82.3％(0.778g)。所得产物分别通过1h nmr和
31
p nmr (avance neo 600mhz，瑞士布鲁克)进行表征(参见图8、图9)。
[0095]
tpp-peg
2k-pcl
6.6k
：
[0096]1h nmr(600mhz,dmso)δ7.96-7.74(m),6.00(m,1h),3.98(t,j＝6.3hz,2h), 3.51(s,2h),3.34(s,2h),2.27(t,j＝6.7hz,2h),1.52(m),1.28(m).
[0097]
31
p-nmr(600mhz,dmso)δ23.89ppm(m).
[0098]
tpp-peg
3.4k-hyd-pcl
6.6k
：
[0099]1h-nmr(600mhz,dmso):9.01-8.96(m,1h),8.70(m,1h),8.57(s,1h),7.49(d, j＝8.0hz,2h),7.39(d,j＝8.0hz,2h),6.98-6.94(m),3.98(t,j＝5.9hz,2h),3.51 (s,4h),3.35(s,1h),2.27(t,j＝6.3hz,2h),1.53(m2h),1.28(m,2h).
[0100]
31
p-nmr(600mhz,dmso)δ23.90ppm.
[0101]
2.2.2 thtm/sk胶束的制备
[0102]
采用溶剂扩散法制备负载sk的正常胶束(nm)，具体包括：将20毫克 mpeg
2k-pcl
6.6k
和1mg sk溶解于2ml丙酮中，并在搅拌下注入10ml去离子 水中。然后在室温下再搅拌0.5小时，用旋转蒸发器(中国南京北帝实验仪器re
‑ꢀ
52aa)蒸发聚合物溶液，以去除有机溶剂。用amicon ultra-15管(mwco 100 kda)对得到的溶液进行3次3500
×
g离心超滤20min，以替换介质。通过0.45μm 过滤器分离并去除未利用的sk。
[0103]
用tpp-peg
2k-pcl
6.6k
部分取代mpeg2k-pcl6.6k以不同比例制备tm/sk 胶束。为了获得ph敏感胶束，tpp-peg
2k-pcl
6.6k
和tpp-peg
3.4k-hyd-pcl
6.6k
参 与了thtm/sk胶束的制备。研究tpp-peg-pcl占聚合物总重量的比率，以获 得最佳粒径、多分散指数(pdi)、zeta电位和载药能力(图10)。当tpp-peg
‑ꢀ
pcl的质量比为50％时，tm/sk胶束的sk lr最高。
[0104]
2.2.3 rbcm的提取
[0105]
通过bca分析对提取和纯化的rbcm进行定量，以获得在胶束上包衣之前 的总蛋白浓度。当rbcm在1x pbs中以同等体积的全血重新悬浮时，平均蛋 白质浓度达到约1.5mg/ml。
[0106]
2.2.4 rbcm改性
[0107]
将不同peg长度的fa-peg-fa用于rbcm改性，以优化膜伪装工艺。 rbcm来源于从雄性ddy小鼠采集的全血。具体的，从小鼠的主动脉动脉接收 全血，并在1,000
×
g下离心15分钟。用pbs(1x)洗涤三次后收集红细胞， 并通过低张效应用pbs(0.25x)进行溶血。通过8000
×
g离心15分钟分离rbcm， 并在pbs(1x)中重新悬浮。在进一步应用之前，对rbcm进行超声波浴处理 (200w)5分钟。对于rbcm的表面改性，使用具有不同peg长度的fa-peg
‑ꢀ
fa与rbcm以1:1的质量比孵育，以得到fa-peg-fa改性rbcm(fp-rbcm)。 在37℃下预混合30min，可使fa-peg-fa插入rbcm的外膜。在孵化之前，通 过bca蛋白质分析试剂盒(thermo fisher scientific，waltham，ma，usa)定 量rbcm的蛋白质浓度，fa-peg-fa溶解在dmso中，浓度为80mg/ml。使 用amicon ultra-0.5试管(mwco 10kda，默克密理博有限公司，爱尔兰)在 10000
×
g下超滤15分钟以去除未结合的fa-peg-fa。
[0108]
2.2.5 rbcm包覆胶束的制备与优化
[0109]
根据2.2.2的方法，在tpp-peg-hyd-pcl/tpp-peg-pcl/mpeg-pcl重量比 为1/1/2的条件下制备thtm/sk胶束。将20mg thtm/sk胶束逐滴分别添加到 2mg rbcm和fp rbcm的pbs溶液中，然后旋转30s，并在37℃下培养30 min。随后，在水浴超声波(200w，5min)下对溶液进行超声处理，使用挤出 机(加拿大阿瓦斯丁)通过200nm聚碳酸酯膜挤出以得到thtm/sk@rbcm和 thtm/sk@fp-rbcm。
[0110]
相应地，参照上述相同工艺制备c6和dir胶束，所述胶束中，sk被c6和 dir取代，其中，载体与c6的质量比为20:0.1，载体与dir的质量比为20:1。 就rbcm伪装而言，thtm/sk@rbcm的尺寸随着聚合物/rbcm重量比从80/1 降至10/1，从60nm增大至140nm(图11)。尽管阳离子纳米颗粒上的细胞膜 涂层通常会导致细胞膜坍塌和纳米粒聚积，但在聚合物/rbcm重量比达到5/1 之前，未观察到沉淀。可以看出，thtm/sk@fp-rbcm在聚合物/rbcm重量 比为10:1时，具有更小的尺寸和更稳定的zeta电位。
[0111]
2.3胶束的表征
[0112]
胶束的ph敏感性通过其大小的变化(图2a)和zeta电位(图2b)进行评 估。在不同的ph下，所有样品都观察到了电荷反转。thtm/sk@rbcm在ph 值为7.4到5.5之间，粒径分布
峰值出现左移，而thtm/sk@fp-rbcm无论peg 链的长度如何，均显示出相反的尺寸增加。综合考虑胶束的大小、稳定性和ph 敏感性，实验使用按照2.2.5制备的thtm/sk@rbcm和thtm/sk@fp-rbcm (聚合物/rbcm重量比为10:1)进行研究。为了验证rbcm的成功涂层和sk 的封装，进行了sds-page和uv光谱检测。thtm/sk@rbcm和thtm/sk@fp
‑ꢀ
rbcm在sds-page的高分子部分具有与rbcm相似的条带(图2c)。同时， 在420nm处测定了rbcm的特征峰，该特征峰与thtm/sk@rbcm和 thtm@fp-rbcm上的峰完全重叠。可以合理地得出结论，rbcm成功且完整 地包覆在这些胶束上。此外，游离sk和thtm/sk@fp-rbcm在450～580nm处 的峰重叠表明了sk的封装(图2d)。280nm处游离fa的特征峰证实了 thtm/sk@fp-rbcm和thtm@fp-rbcm被fp所修饰。
[0113]
测定了sk负载胶束的粒径、pdi、zeta电位和sk的lr/lc。除 thtm/sk@rbcm外，所有胶束的直径均小于80nm(图2e)。rbcm伪装后观 察到电荷反转(图2f)。所有组sk的lr均高于50％，rbcm包覆略微降低了 sk的lr(图2g)。据推测，rbcm包覆可能会部分去除thtm/sk表面附着的 sk。与粒径检测结果一致，在透射电子显微镜(tem)下，50nm左右的thtm/sk 呈现球形(图2h)。通过rbcm伪装，在thtm/sk@rbcm中观察到高达150nm 的胶束聚集体呈现不规则形状。胶束单元之间的结合部分约为8nm，与细胞膜 的厚度相似。经fa-peg-fa改性后，在thtm@fp-rbcm中观察到约60nm的 分离颗粒具有清晰的核壳结构。鉴于thtm/sk@rbcm和thtm@fp-rbcm在 ph7.4到5.5之间的粒径变化趋势相反，推测胶束单元与rbcm的部分分离导致 thtm/sk@rbcm的粒径减小。由于thtm/sk@fp-rbcm以独立胶束而非聚 合体的形式存在，与rbcm吸附作用较强，可能需要一定时间才能与rbcm分 离，因此表现为膨胀的纳米颗粒。相应地，确定了sk的ph敏感释放行为(图 12)。在ph值为5.5时，sk的释放速度更快，累积释放量更高，这与酸性环境 下腙键断裂密切相关。
[0114]
实施例3香豆素6包裹胶束的细胞内转运
[0115]
为了研究胶束的摄取和细胞内运输，香豆素6(c6)被包裹在胶束中(图 14)，并通过共聚焦显微镜进行观察。定量分析显示胶束与荧光标记的细胞器共 定位。绿色和红色曲线的重叠表明胶束在标记的细胞器上的位置。纳米颗粒的有 效线粒体靶向性通常受到细胞摄取和随后的内体途径的限制。我们使用溶酶体 标记物lysotracker red和线粒体标记物mitotracker red进行了时间依赖性摄取 研究，以研究胶束的细胞内转运，包括摄取、溶酶体融合和逃逸以及线粒体积累。 对于含有tpp-peg-pcl的胶束，在2小时时观察到与溶酶体的共定位(黑色和 灰色线重叠处)，并在4小时时明显减少(图3a、b)。这表明胶束的有效溶酶 体逃逸归因于tpp的“质子海绵”效应，该效应阻止内体/溶酶体酸化，从而导 致渗透膨胀和膜破裂。无论基团如何，绿色荧光强度均不随时间发生明显变化， thtm/c6甚至在4h时在膜上的吸附减少。假设大多数胶束在2h内被细胞吸收， 吸附在膜上的thtm/c6可能会因腙键断裂而随时间剥离。rbcm包被的胶束显 示出很少的膜吸附和清晰的溶酶体逃逸，这使得随后的线粒体积累成为可能。然 而观察到，与thtm@rbcm相比，thtm@fp-rbc对细胞摄取没有明显的增 强作用。线粒体靶向能力反映了胶束的传递效率和在线粒体上的积累，这是sk 抑制线粒体生物合成的关键。在2小时和4小时监测了胶束与线粒体的共定位 (图3c、d)。所有胶束在2小时和4小时时均显示出相似的细胞摄取。检测对 象在线粒体聚集由红色和绿曲线重叠表示，thtm@rbcm和thtm@fp-rbcm， 可见明显的红绿曲线重叠。与溶酶体共定位研究结果一致，tm/c6和thtm/c6 表现出明显的细胞膜吸收。因此，细胞内转运研究表明，
rbcm通过阻止tpp诱 导的膜吸附促进细胞对胶束的摄取，从而进一步促进tpp介导的溶酶体逃逸和 随后的线粒体易位。thtm@fp-rbcm的细胞摄取率不高于thtm@rbcm，这 可能是由于两种rbcm包裹胶束的粒径都足够小。
[0116]
实施例4制备胶束抑制线粒体生物合成，以及体外抗tnbc的增殖和转移作用
[0117]
评估游离sk及本发明制备的sk胶束对mda-mb-231细胞线粒体生物合 成的抑制作用，包括对线粒体dna(mtdna)、线粒体含量和atp生成的影 响。游离sk降低线粒体dna和线粒体含量以及atp水平，而含有tpp部分 的sk胶束进一步增强了对线粒体生物合成的抑制作用，尤其是thtm/sk@fp
‑ꢀ
rbcm(图4a、b、c)。为了证实线粒体生物合成抑制主要是通过调节polg和 pgc-1α介导的，在mda-mb-231细胞中用游离sk及其胶束处理后测定其蛋 白质水平(图4e)。对线粒体生物合成的抑制作用一致，sk胶束以类似的趋势 下调线粒体或总polg和pgc-1α蛋白水平的表达。
[0118]
此外，通过细胞毒性试验评估本发明制备的sk胶束的抗增殖活性(图4d)。 rbcm包覆胶束的ic
50
比游离sk低约3倍(图4d)。同时thtm@fp-rbcm 和thtm@rbcm空白载体即使在最高浓度下，不产生明显的毒性(图13)。尽 管tm/sk和thtm/sk对mda-mb-231细胞的细胞毒性也增强，但空白tm和 thtm的细胞毒性可忽略不计。通过细胞侵袭和迁移实验评价sk胶束对tnbc 细胞的抗转移活性，sk胶束显示出与细胞毒性相似的趋势(图4f)。值得注意 的是，thtm/sk@fp-rbcm和thtm/sk@rbcm ic
50
值接近，但 thtm/sk@fp-rbcm的抗转移作用略高于thtm/sk@rbcm。众所周知，纳米 粒子通过输入孔在膜上的传输以及分布到线粒体内膜与粒径和电荷势密切相关。 据报道，纳米颗粒的最大吸收限制在100nm，而正电荷在线粒体积累中起决定 性作用。显然，thtm/sk@fp-rbcm粒径小于70nm的和酸性环境下的电荷反 转有利于线粒体运输。虽然thtm/sk@rbcm约150nm的大小限制了其在线粒 体孔中的运输，溶酶体介导的胶束分离的低ph条件可能促进线粒体的积累。总 的来说，优先运输到线粒体可以改善对线粒体生物生成的抑制作用，从而增强细 胞毒性和抗转移作用。
[0119]
实施例5紫草素胶束的药代动力学和生物分布
[0120]
用sk和dir装载的胶束(图15)，分别研究小鼠的药代动力学特征和生 物分布。理论上，带正电荷的thtm胶束易于通过吞噬被识别和消除，而阳离 子胶束上的fp-rbcm伪装有望通过膜上的蛋白cd47逃避免疫监视，从而导致 长循环(图5a)。western blot显示rbcm最重要的标记蛋白cd47被完整地转 移到thtm/sk@rbcm和thtm/sk@fp-rbcm，保留了红细胞逃避免疫监视 的能力(图5b)。带有免疫金的透射电镜结果如图5c所示，进一步证明fa-peg
‑ꢀ
fa实现了rbcm的定向包裹。在健康小鼠中进行sk药代动力学研究。静脉给 药后，采集血清样本并检测sk的血浆药物浓度(图5d)。所有样品在6小时内 从循环中消除，与游离sk和thtm/sk相比，nm/sk、thtm/sk@rbcm和 thtm/sk@fp-rbcm具有更低的清除率和更高的auc(表s1)，尤其是 thtm/sk@fp-rbcm。胶束的血液滞留与纳米颗粒、血清和循环中细胞之间的 相互作用密切相关。其中全血中高百分比的血清蛋白是纳米颗粒循环的第一道 屏障。在高达50％的fbs(胎牛血清)中，检测胶束直径变化评估对胶束的干扰 (图5e)。thtm胶束直径增大，而nm/sk和thtm/sk@fp-rbcm胶束直径 没有明显变化，表明其稳定性较高。此外，检测胶束与血液细胞的结合，评价血 液细胞对胶束生理分布的改变。thtm/c6@fp-rbcm检测到约30％的红细胞结 合率，甚至低于nm/c6(图5f)。与结合率高于40％的thtm/c6相比， thtm/c6@fp-rbcm在24小时时白细胞结合率同样低于30％(图5g)。可以 合理地得出结论，
fp-rbcm伪装后通过蛋白cd47介导的免疫监视逃逸延长胶 束循环，且peg链赋予较高的血清稳定性和较低的细胞结合率。
[0121]
使用mda-mb-231细胞接种至雌性nod/scid小鼠乳腺脂肪垫构建tnbc 细胞原位接种模型，评价sk胶束的生物分布。thtm/dir，thtm/dir@rbcm 和thtm/dir@fp-rbcm静脉注射，并在注射后2、6、12和24小时采集活体 图像(图6a)。在thtm/dir@rbcm和thtm/dir@fp-rbcm组中，dir的 聚集在肿瘤病灶处清晰可见，且荧光强度随时间增加而增加。相反，thtm/dir 组在24小时内未检测到荧光信号。在实验结束时分离器内脏官并量化荧光强度 (图6b、c、d)。进一步证实thtm/dir组肿瘤病灶中几乎未检测到任何信号。 thtm/dir@fp-rbcm与thtm/dir@rbcm相比，在肿瘤病灶处有效积累，并 伴随着从肝脏的快速清除。本发明发现rbcm伪装有利于肿瘤的聚集，fa配体 进一步提高了肿瘤的靶向性。总的来说，rbcm延长了胶束的循环，从而改善了 肿瘤病灶处的积聚，fa-peg-fa修饰的rbcm增强了这种作用。
[0122]
实施例6 sk胶束对tnbc细胞原位接种模型和肺转移模型的治疗作用
[0123]
构建tnbc细胞的原位和肺转移小鼠模型用于探索sk胶束在体内的抗增 殖和抗转移作用(图7a，e)。与对照组相比，游离sk和nm/sk适度抑制肿 瘤生长，但thtm/sk@fp-rbcm和thtm/sk@rbcm与游离sk或nm/sk相 比，其对肿瘤生长的抑制作用更明显(图7b、c、d)。游离sk、nm/sk、 thtm/sk@rbcm和thtm/sk@fp-rbcm治疗组对肿瘤重量的抑制率分别为 22.73％、32.15％、43.01％和61.10％(图7c)。与体外结果一致，thtm/sk@fp
‑ꢀ
rbcm对肿瘤生长具有最有效的抑制作用(图7b、c、d)。此外，游离sk和 nm/sk也适度减少了mda-mb-231x细胞在肺部转移形成的结节数， thtm/sk@rbcm和thtm/sk@fp-rbcm显示出比游离sk和nm/sk更好的 抑制效果(图7e、f)。游离sk、nm/sk、thtm/sk@rbcm和thtm/sk@fp
‑ꢀ
rbcm治疗组对肺转移结节数的抑制作用分别为39.31％、51.03％、68.96％和 88.97％(图7h)。肺切片的组织学分析显示pbs、空白载体、freesk、nm/sk、 thtm/sk@rbcm和thtm/sk@fp-rbcm治疗组中的转移灶区域分别为83.1
ꢀ±
13.0μm2、85.8
±
7.9μm2、33.5
±
7.3μm2、25.6
±
3.1μm2、18.5
±
1.6μm2、8.3
±
1.7μm2(图7i、j)。同样，thtm/sk@fp-rbcm的抗转移作用比其 他制剂更明显(图7f-j)。
[0124]
肿瘤组织或肺组织切片的ihc染色显示，与pbs治疗组相比，游离sk降 低了肿瘤组织或肺转移灶中pgc-1α和polg的表达，并且nm/sk、 thtm/sk@rbcm和thtm/sk@fp-rbcm对pgc-1α和polg表达的抑制作 用优于游离sk，其中thtm/sk@fp-rbcm显示出最有效的效果(图7k、l)。 这些结果表明sk胶束通过干扰polg而抑制tnbc细胞的生长和转移，反映 了线粒体生物合成的抑制。
[0125]
sk的胶束包括nm/sk、thtm/sk@rbcm和thtm/sk@fp-rbcm未对体 重造成明显损害(图16a、b)。心脏、肺、肝、脾和肾切片的he染色显示，游 离sk及其制剂在主要器官中未引起显著的组织病理学变化(图16c、d)。
[0126]
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施 方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种紫草素靶向胶束，其特征在于，所述胶束由红细胞膜或经改性的红细胞膜包覆含负载紫草素(的阳离子纳米颗粒，所述负载紫草素的阳离子纳米颗粒中，紫草素与嵌段共聚物tpp-peg
n1-pcl
m1
、tpp-peg
n2-hyd-pcl
m2
、mpeg
n3-pcl
m3
的pcl端形成疏水内核，peg在中间形成亲水层。2.根据权利要求1所述的一种紫草素靶向胶束，其特征在于，所述红细胞膜或经改性的红细胞膜在tpp的静电吸附力作用下在外侧形成具有仿生功能的壳；优选的，所述经改性的红细胞膜为通过fa-peg
n4-fa改性的红细胞膜，所述fa-peg
n4-fa结构如下所示：其中，n4选自500-8000。3.根据权利要求1所述的一种紫草素靶向胶束，其特征在于，所述tpp-peg
n1-pcl
m1
如下结构所示：所述tpp-peg
n1-pcl
m1
中，n1选自1000-5000；m1选自5000-10000。4.根据权利要求1所述的一种紫草素靶向胶束，其特征在于，所述tpp-peg
n2-hyd-pcl
m2
如下结构所示：所述tpp-peg
n2-hyd-pcl
m2
中，n2选自1000-5000；m2选自5000-10000。5.根据权利要求1所述的一种紫草素靶向胶束，其特征在于，所述mpeg
n3-pcl
m3
结构如下所示：
n3选自1000-5000；m3选自2000-10000。6.根据权利要求1-5任一项所述的一种紫草素靶向胶束的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)制备嵌段共聚物tpp-peg
n1-pcl
m1
、tpp-peg
n2-hyd-pcl
m2
；(2)采用嵌段共聚物tpp-peg
n1-pcl
m1
、tpp-peg
n2-hyd-pcl
m2
、mpeg
n3-pcl
m3
制备负载紫草素的阳离子纳米颗粒；(3)采用红细胞膜或经改性的红细胞膜包覆所述负载紫草素的阳离子纳米颗粒。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述经改性的红细胞膜的制备方法包括如下步骤：使用具有不同peg长度的fa-peg
n4-fa与rbcm以1:1的质量比孵育。8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述前段共聚物tpp-peg
n1-pcl
m1
、tpp-peg
n2-hyd-pcl
m2
的制备方法包括如下步骤：(a2)将tpp和edcl分别溶解于有机溶剂a中；(b2)将hobt溶解于有机溶剂b中；(c2)将步骤(a)和(b)的溶液加入反应容器，并在室温下搅拌20-60分钟；(d2)将nh
2-peg
n1-pcl
m1
(0.86g，0.1mmol)或nh
2-peg
n2-hyd-pcl
m2
溶解于有机溶剂b中并逐滴添加到步骤(c)所得溶液中，在室温、氮气下搅拌过夜；(e2)将步骤(d)所得反应混合液用去离子水透析(mwco，3500da)12-36小时并冷冻干燥，即获得tpp-peg
n1-pcl
m1
、tpp-peg
n2-hyd-pcl
m2
。9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述负载紫草素的阳离子纳米颗粒的制备方法包括如下步骤：(a3)将所述tpp-peg
n1-pcl
m1
、tpp-peg
n2-hyd-pcl
m2
、mpeg
n3-pcl
m3
和sk溶解于有机溶剂c中，并在搅拌下注入去离子水；(b3)在室温下搅拌0.2-1小时，蒸发溶液以去除有机溶剂，离心超滤10-40min，通过0.45μm-0.8μm过滤器分离并去除未利用的sk；和，或所述红细胞膜或经改性的红细胞膜的制备方法包括如下步骤：(a4)将负载紫草素的阳离子纳米颗粒加入所述红细胞膜或经改性的红细胞膜溶液的pbs溶液中，旋转20-40秒，并在37℃下培养20-40min；(b4)对溶液进行超声处理；(c4)使用挤出机通过200nm聚碳酸酯膜挤出以接收thtm/sk@rbcm和thtm/sk@fp-rbcm。10.根据权利要求1-5任一项所述的一种紫草素靶向胶束在制备治疗癌症的药物中的应用。

技术总结
本发明涉及一种紫草素靶向胶束，所述胶束由红细胞膜或经改性的红细胞膜包覆含负载紫草素的阳离子纳米颗粒，所述负载紫草素的阳离子纳米颗粒中，紫草素与嵌段共聚物TPP-PEG


技术研发人员：陈妍 彭剑青 沈祥春 陈艺 胡晓霞 樊双琴
受保护的技术使用者：贵州医科大学
技术研发日：2022.01.19
技术公布日：2023/7/31