牛结节性皮肤病病毒一管式巢式RPA-CRISPR/Cas12a检测试剂盒及应用的制作方法

牛结节性皮肤病病毒一管式巢式rpa-crispr/cas12a检测试剂盒及应用
技术领域
1.本发明属于生物病毒检测领域，具体涉及一种牛结节性皮肤病病毒(lsdv)一管式巢式rpa-crispr/cas12a检测方法及试剂盒。


背景技术：

2.牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus，lsdv)属于痘病毒科亚科(chordopoxvirinae)家族中的capripoxvirus属(capv)。lsdv引起牛发生牛结节性皮肤病，该病的临床特征是发热、消瘦，淋巴结肿大，皮肤水肿、局部形成坚硬的结节或溃疡，使牛的奶产量下降，破坏皮革和兽皮影响皮张价值。该病毒具有高的发病率和强的传染性，累计造成的经济损失相当高，对小农场主的生计造成毁灭性打击，甚至影响国际贸易。lsdv被世界动物卫生组织(oie)列为必须通报的动物疫病，也是《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》中的一类传染病。因此，灵敏和特异地检测lsdv对疫病的监控和防治具有重要意义。目前，检测lsdv的方法主要分为免疫和核酸检测。其中，免疫检测方法是滞后的，动物在感染病毒后的几天内才会产生抗体，这是不利于早期监控和筛查的。而核酸检测成为检测lsdv的主要方法。
3.目前，临床上的核酸检测是基于核酸扩增技术，如变温核酸扩增和恒温核酸扩增。其中，聚合酶链反应(polymerase chain reaction,pcr)和实时定量pcr(real-time quantitative pcr,qpcr)是变温扩增中的最常用的方法，而液滴数字pcr(droplet digital pcr,ddpcr)是一种能实现绝对定量的灵敏方法。然而，这些方法是耗时的并且依赖于大型、精确的温度控制仪器。而等温扩增在恒温条件下快速和高效地扩增，被广泛应用于多个领域。如利用重组酶聚合酶扩增(rpa)和环介导等温扩增(lamp)对sars-cov2病毒进行高灵敏度检测；应用核酸序列扩增技术(nasba)检测rna病毒通过逆转录-转录的方法；利用链位移扩增(sda)和滚环扩增(rca)检测肿瘤标志物等。其中，特异性和敏感性是核酸扩增方法的重要参数。研究表明，ddpcr在检测中存在假阳性。而pcr和qpcr的灵敏度不够在对丰度较低的样品检测中。这些问题在等温放大中也明显存在。大量研究表明，rpa和lamp具有非特异性扩增，容易受到气溶胶污染。也因此一直被质疑。另外，它们也显示出像pcr同样具有扩增平台期的限制。也就是说，在一个给定的扩增系统中，随着扩增的进行，引物被消耗或酶逐渐失活造成的扩增暂停。这将掩盖了样品含量之间的差异，并会影响方法的灵敏度。在变温扩增方法中，开发了嵌套pcr来解决扩增平台性和特异性问题，实现对低丰度样本的灵敏检测。然而，嵌套pcr是耗时的，并且为了达到一管式反应对引物的tm有严格的要求，增加了引物设计的难度，更需要依靠大型仪器进行精确的温度控制。这是复杂的和高成本的，不利于现场检测。因此，在灵敏地和特异性地现场检测领域中，开发新的等温扩增技术打破扩增平台期和解决非特异性扩增，并代替变温扩增是非常重要的。
4.聚类规则间隔短回文重复序列(clustered periodic interspaced short palindromic repeats,crispr)/crispr相关蛋白12a(crispr-associated protein12a,
cas12a)是从细菌和古生菌的免疫系统中衍生出来的一项新兴技术。具体来说，cas12a蛋白与crispr rna(crrna)形成二元复合体，通过原间隔相邻基序protospacer adjacent motif(pam，5'-tttn-3')搜索双链dna(dsdna)。当dsdna与crrna互补时，会激活cas12a的顺式和反式裂解活性。顺式切割活性会切割dsdna，而反式切割活性会切割周围的单链dna(ssdna)。通过对ssdna修饰，crispr/cas12a系统被广泛用作特异和灵敏的终端信号输出方法。例如，陈勇使用光激活crispr/cas12a结合rpa实现了一锅高灵敏核酸检测，40分钟内检测限低至2.5copies。陈艳菊采用cas12a结合rt-lamp检测sasr-cov-2，准确率达100％。虽然crispr/cas12a实现了对扩增产物的选择性识别，提高方法的特异性，但它没有从根本上解决扩增方法的非特异性扩增。
5.为解决上述的等温扩增的非特异性扩增和扩增平台期的问题，我们开发了一管式巢式rpa结合crispr/cas12a系统的方法。从新型的扩增方法和crispr/cas12a来双重保障方法的特异性和提高灵敏度。建立了一管式巢式rpa和crispr/cas12a的lsdv检测方法，对于海关口岸、养殖场、基层动物疫病防控机构的现场快速检查具有重要意义。目前国内外尚无结合巢式rpa和crispr/cas12a的lsdv检测方法。


技术实现要素：

6.为获得对lsdv更灵敏和特异的检测方法，本发明的第一个目的是提供高灵敏和特异的巢式rpa-crispr/cas12a检测用引物和crrna，准确鉴定处于qpcr的“灰色区域”难以定性的样本；第二个目的是基于以上引物构建试剂盒，利用巢式rpa解决rpa的非特异性扩增，并打破扩增平台期来提高灵敏度；第三个目的是开发一管式巢式rpa，减少中间步骤，提供更简便的检测方法，用crispr/cas12a结合巢式rpa提供更快速的、更特异的、适合point-of-care的检测方法。
7.为了实现上述第一目的，本发明采用的技术方案是：牛结节性皮肤病病毒一管式巢式rpa-crispr/cas12a检测用引物，包括一对外引物、一对内引物和crrna序列，其中
8.所述内引物中outer-forward引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，outer-reverse引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；
9.所述外引物中inner-forward引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，inner-reverse引物的核苷酸序列如seq id no.4所示；
10.所述crrna的核苷酸序列如seq id no.5所示。
11.seq id no.1：5
’‑
atctgctacaagttttaacgaactta-3’12.seq id no.2：5
’‑
tgaatgtgatctcatatccttattg-3’13.seq id no.3：5
’‑
ttatacaaagaatcgtaaaatgtgtt-3’14.seq id no.4：5
’‑
gattgtgtgtattgctttctttggagc-3’15.seq id no.5：
[0016]5’‑
aauuucuacuaaguguagauuaaaaaaagaaaaaaaaaaag-3’。
[0017]
为了实现上述第二目的，本发明采用的技术方案是：牛结节性皮肤病病毒一管式巢式rpa-crispr/cas12a检测试剂盒，包括上述引物、ddh2o、rpa试剂、cas12a、ssdna reporter和10
×
reaction buffer。所述ssdna reporter的核苷酸序列如seq id no.6所示。
[0018]
seq id no.6：fam-tattatt-bhq1。
[0019]
为了实现上述第三目的，本发明采用的技术方案是：牛结节性皮肤病病毒一管式巢式rpa-crispr/cas12a非疾病诊断目的检测方法，包括两个反映体系：
[0020]
一管式巢式rpa体系：内引物rpa体系包含一管rpa冻干粉，20μl溶解剂，18.5μl ddh2o，25～35μm inner-forward引物和25～35μm inner-reverse引物,2.5μl激活剂；外引物rpa体系包含一管rpa冻干粉，20μl溶解剂，18.5μl ddh2o，25～35μm outer-forward引物和25～35μm outer-reverse引物,2.5μl激活剂；内、外引物体系分别混合后，分别取20μl装载在pcr管管盖和管底，2μl待检样品加入到管底，在37℃反应10～12分钟后，将管盖上的内引物体系试剂离心到管底，在37℃反应15～20分钟。
[0021]
crispr/cas12a体系：取巢式rpa扩增产物4μl加入到crispr/cas12a体系中，crispr/cas12a包含1
×
reaction buffer，100～125nm cas12a，125～150nm crrna，1～1.5μm ssdnareporter和10μl ddh2o。crispr/cas12a体系在恒温荧光仪上37℃30min，采集荧光信号；结果判定如下：出现荧光信号的样本为阳性；荧光强度为0的为阴性。
[0022]
本发明的原理是：针对lsdv的varv b22r基因的特异性区域，设计了两对引物，分别为内引物和外引物。其中内引物位于外引物扩增的区域内。如图1所示，外引物与目标物匹配进行首次扩增，产生大量产物。接着内引物系统将外引物的产物作为模板进行二次扩增。在此过程中，内引物与扩增产物配对，降低了非特异性扩增的概率。由于非特异性产物不能与内引物配对，因此在扩增过程中它会被大量的特异性产物遮盖和丢弃。理论上，首轮扩增后剩余的外部引物和内部引物相互组合，会产生四种产物。每个产物都包含中心区域。crrna被设计与产物的中心区域配对。通过crrna对巢式rpa的扩增产物的识别，cas12a的反切活性被激活，切割周围的ssdnareporter，产生强烈的荧光信号。
[0023]
内引物位于外引物扩增区域内，即只有目标物及其正确产物才能与两对引物匹配，而非特异性扩增产物不能与内引物匹配。因此，巢式rpa将特异性提高到一个新的水平，解决了rpa的非特异性扩增带来的假阳性问题。内、外引物介导的两次连续扩增打破了扩增平台期，产生大量的特异性的扩增产物，极大地提高了灵敏度。此外，一管式巢式rpa通过将内、外引物体系分别加载到管底和管盖上，减少了打开瓶盖补充系统的中间步骤，减少了污染的几率，使得操作更加便利。此外，crispr/cas12a的crrna识别进一步增强了方法的特异性。cas12a的反式切割活性的信号放大能力增强了方法的灵敏度。因此，一管式巢式rpa结合crispr/cas12a在双重保障下具有超高的敏感性和特异性。因此，方法对于低浓度的样本仍然可以产生高的信号，这就规避了因信号模糊造成的困扰。相比于嵌套pcr，一管式巢式rpa不需要对温度精准控制，引物设计简单，因此更加简单和低成本，在现场检查中更具有优势。
[0024]
本发明的优点是：(1)、巢式rpa结合crispr/cas12a对低丰度样本可以产生超高信号，终结了信号模糊的“灰色区域”，产生更易判断和准确的信号；(2)、高灵敏度：巢式rpa打破扩增的平台期，产生更多的扩增子，提高了灵敏度。对lsdv的实际检测限低至2.169copies
·
μl-1
。高的灵敏度可以解决由于丰度低造成的假阴性现象；(3)、高特异性：巢式rpa通过两对引物的匹配和crispr/cas12a系统的识别，将特异性提高到一个新的水平，解决了rpa的非特异性扩增造成的假阳性；(4)、快速：一管式巢式rpa结合crispr/cas12a的方法在32分钟内完成检测，比传统的pcr或者qpcr方法缩短了半小时以上；(5)、操作简便和
便捷：利用便携式荧光仪，在等温条件下，方法实现了快速、超灵敏和特异的即时检测(poct)，方法可以在户外随时随地检测；(6)、用途广：可广泛用于病毒检测。通过更改引物和crrna的序列，方法可用于多种病毒检测。
附图说明
[0025]
图1是基于一管式巢式rpa结合crispr/cas12a系统对lsdv检测的原理图；
[0026]
图2是以2.169
×
103copies
·
μl-1
和2.169
×
101copies
·
μl-1
为靶标利用outer-rpa、inner-rpa、mix-rpa和巢式rpa的比较，(a)和(c)为荧光光谱，(b)和(d)为荧光强度与时间的一阶导数结果，+和-分别代表实验组和对照组；
[0027]
图3是一管式巢式rpa的条件优化，(a)和(b)为内外引物浓度优化，(c)和(d)为内外引物时间优化；
[0028]
图4是crispr/cas12a的条件优化，(a)，(b)和(c)分别为cas12a,crrna和ssdna探针的浓度优化；
[0029]
图5是一管式巢式rpa-crispr/cas12a对核酸灵敏度检测，(a)、(c)、(e)分别为巢式rpa、outer-rpa和inner-rpa对不同浓度dna的荧光光谱，(b)、(d)、(f)分别为他们的荧光强度与时间的一阶导数结果；
[0030]
图6是巢式pcr-crispr/cas12a对核酸的灵敏度检测。(a)内引物pcr对不同浓度的lsdv检测的荧光光谱；(b)内引物的荧光光谱和核酸浓度的对数的线性关系从2.169
×
101到2.169
×
105copies
·
μl-1
。(c)巢式pcr对不同浓度的lsdv检测的荧光光谱；(d)巢式pcr的荧光光谱和核酸浓度的对数；
[0031]
图7是一管式巢式rpa-crispr/cas12a对病毒灵敏度检测，(a)不同浓度lsdv的荧光光谱分析，1～8为1.41
×
105～1.41
×
10-2
tcid
50
,9为对照组，(b)不同浓度lsdv的qpcr结果；
[0032]
图8是一管式巢式rpa-crispr/cas12a方法的特异性(a)和重现性(b)；
[0033]
图9是利用一管式巢式rpa-crispr/cas12a方法和qpcr方法对60个实际样本检测结果的热图分析；
[0034]
图10是一管式巢式rpa-crispr/cas12a方法检测1～30个样品的结果，图中的小图为qpcr结果；
[0035]
图11是一管式巢式rpa-crispr/cas12a方法检测31～60个样品的结果，图中的小图为qpcr结果。
具体实施方式
[0036]
实施例1，按照上述原理分析，设计如下表所示的引物和crrna的序列。
[0037][0038]
牛结节性皮肤病病毒(lsdv)一管式巢式rpa-crispr/cas12a检测方法如下，包括两个体系：
[0039]
一管式巢式rpa体系：分为内、外引物体系。首先，内引物rpa体系包含一管rpa冻干粉，20μl溶解剂，18.5μl ddh2o，35μm inner-forward引物和35μm inner-reverse引物,2.5μl激活剂。外引物rpa体系包含一管冻干粉，20μl溶解剂，18.5μl ddh2o，35μm outer-forward引物和35μm outer-reverse引物,2.5μl激活剂。内、外引物体系分别混合后，分别取20μl装载在pcr管管盖和管底。2μl待检样品加入到管底，在37℃反应10分钟后，将管盖上的内引物体系试剂离心到管底，在37℃反应15分钟。
[0040]
crispr/cas12a体系：取巢式rpa扩增产物4μl加入到crispr/cas12a体系中。crispr/cas12a包含1
×
reaction buffer，100nm cas12a，125nm crrna，1.5μm ssdna reporter和10μl ddh2o。crispr/cas12a体系在恒温荧光仪上37℃30min，采集荧光信号。
[0041]
结果判定：
[0042]
出现荧光信号的样本为阳性；荧光强度为0的为阴性。
[0043]
实施例2，巢式rpa和常规rpa的比较：
[0044]
一般来说，影响rpa效率的因素有引物的结合效率、dna聚合酶、解旋酶和单链结合蛋白的能力。理论上，巢式rpa不受扩增平台期的限制，并且两对引物连续反应将减少非特异性扩增，因此比常规rpa具有更高的灵敏度和特异性。采用crispr/cas12a作为终端信号输出，利用两种不同浓度的样品来评估他们的扩增效率。首先使用单独的外引物rpa(记为outer-rpa)、内引物rpa(记为inner-rpa，)、和两对引物混合的rpa(记为mix-rpa)和巢式rpa扩增2.169
×
103copies
·
μl-1
样本。如图2(a)所示，他们的荧光差异较小。用荧光强度和时间的一阶导数计算反应效率。在图2(b)中，在2.169
×
103copies
·
μl-1
浓度下，巢式rpa与常规rpa相比并不突出，这是由于crispr/cas12a系统的饱和现象造成的。即虽然巢式rpa比其他rpa能产生更多的扩增子，但常规rpa的产物的量对crispr/cas12a系统来说也是过多的，导致系统饱和，因此降低了荧光差异。对2.169
×
101copies
·
μl-1
的dna检测，如图2(c)所示明显看出巢式rpa的荧光强度最高，outer-rpa高于inner-rpa,而mix-rpa位于两者之间。图2(d)一阶导数结果显示巢式rpa具有更高的扩增效率，是远高于传统的rpa的效率。对于小浓度的样品，rpa产物对crispr/cas12a体系是不饱和，荧光信号与产物含量呈正相关。此外，outer-rpa的扩增效率高于inner-rpa。与单一引物相比，mix-rpa的效率并没有提高，而处于两者之间。高效外引物与低效内引物之间的竞争降低了整体扩增效率。综上所述，巢
＝0.9730。实际检测限低至2.169
×
101copies
·
μl-1
的。利用内引物和外引物进行巢式pcr扩增，如图6(c)，连续两次的扩增使得荧光强度非常高从2.169
×
10-1
到2.169
×
103copies
·
μl-1
，实际检测限低至2.169
×
10-1
copies
·
μl-1
。与传统的pcr相比，巢式pcr的灵敏度提高了1000倍。相比于巢式rpa，巢式pcr的灵敏度高了10倍，但是巢式rpa节约了30分钟，并且不需要变温仪器。巢式rpa的灵敏度已经满足了检测的灵敏度，与crispr/cas12a系统协同作用，使得检测更加特异和灵敏，更加适合快速的point-of-care检测，为lsdv的防疫提供技术支持。
[0052]
用lsdv感染mdbk细胞，用reed和mench方法计算tcid
50
。将病毒以10倍为梯度进行稀释并提取dna。如图7(a)所示，从1.41
×
10-2
到1.41
×
103tcid
50
，荧光强度随着tcid
50
的增加而增加。浓度为1.41
×
104和1.41
×
105的lsdv的荧光强度低于浓度为1.41
×
103tcid
50
的lsdv，这是由于高浓度的抑制作用。显然，巢式rpa组合crispr/cas12a的实际lod为1.41
×
10-2
tcid
50
。作为对比，qpcr检测不同浓度的lsdv，如图7(b)，随着浓度的降低，ct值增大。在1.41
×
100tcid
50
处的lsdv结果与对照组相似。qpcr的实际lod为1.41
×
101tcid
50
。因此，一管式巢式rpa结合crispr/cas12a方法的灵敏度是qpcr的1000倍。更重要的是，巢式rpa不会产生难以判断的混淆结果。此外，它的操作简单。因此，一管式巢式rpa是一种超灵敏、特异、简单的方法。
[0053]
实施例6、特异性检测
[0054]
一管式巢式rpa不仅提高了灵敏度，而且通过内外引物的连续扩增，大大提高了特异性。由于几乎没有干扰序列可以同时匹配两对引物，因此它极大地减少了非特异性扩增。此外，crispr/cas12a特异性系统也发挥了重要作用。crrna识别的区域是lsdv特有的序列，与同属的、同源性高达97％的sppv和gtpv有很好的区分。在图8(a)中，对几种经常感染牛和羊的病毒提取核酸进行反应。明显地，只有lsdv具有较强的荧光信号，而其他无荧光信号。因此，巢式的rpa结合crispr/cas12a体系具有很强的特异性。这解决了rpa非特异性扩增的问题，对rpa的应用具有深远的意义。
[0055]
实施例7、重现性检测
[0056]
对于超灵敏的方法，重现性是一个非常重要的参数。5个实验由不同的实验者进行，如图8(b)所示，五次实验的荧光光谱几乎重合，证明了该方法重现性好，适合临床试验。
[0057]
实施例8、实际样本检测
[0058]
在60个真实样本中验证了巢式rpa的检测能力。这些样本来自两头牛。牛1号是未感染病毒的健康牛，牛2号感染了lsdv。样本1-10、59、60为血液样本，11-20为眼拭子，20-30为鼻拭子，31-43为咽拭子，44-58为粪便。根据qiaamp dna mini kit试剂盒提取核酸，采用一管式巢式rpa和qpcr检测。如图9和10所示，12个血样中，有8个阳性份，3个阴性，这些样本经过两种方法检测的结果一致。而样品8在巢式rpa中为阳性，在qpcr中为阴性。这可能是由于该样本量小于其他血液样本，导致qpcr无法检出。在10例眼拭子中，7个阴性样本和1个阳性样本，两种方法结果一致。样品12和19在巢式rpa为阳性，而qpcr为阴性。而这2个样本来自牛2号。在10个鼻拭子样本中，1个样本为阳性，5个样本为阴性，两种方法的结果一致。而来自牛2号的21、23、25和27号样本，他们通过巢式rpa检测为阳性，而qpcr检测阴性。在图11中，13个咽拭子样本中，5个样本为阴性，31-38号样本在巢式rpa是阳性，而qpcr为阴性。在15份粪便拭子中，3份样本为阴性，两种方法结果一致，样品46、47、49-58(来自牛2号)在巢
式rpa为阳性，而qpcr为阴性。虽然两种方法对这些样本的结果存在差异，但在来源方面看，巢式rpa没有出现误检。造成这种差异的可能原因是lsdv在不同部位的表达量不同，并且qpcr的灵敏度不足以检测低浓度的样品。综上所述，这表明巢式rpa具有高灵敏度和强的样本检测能力。

技术特征：
1.牛结节性皮肤病病毒一管式巢式rpa-crispr/cas12a检测用引物，其特征在于：包括一对内引物、一对外引物和crrna序列，其中所述内引物中outer-forward引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，outer-reverse引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述外引物中inner-forward引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，inner-reverse引物的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述crrna的核苷酸序列如seq id no.5所示。2.牛结节性皮肤病病毒一管式巢式rpa-crispr/cas12a检测试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1所述的一对外引物、一对内引物和crrna序列。3.根据权利要求2所述牛结节性皮肤病病毒一管式巢式rpa-crispr/cas12a检测试剂盒，其特征在于：还包括ddh2o、rpa试剂、cas12a、ssdna reporter和10
×
reaction buffer。4.根据权利要求3所述牛结节性皮肤病病毒一管式巢式rpa-crispr/cas12a检测试剂盒，其特征在于：所述ssdna reporter的核苷酸序列如seq id no.6所示。5.根据权利要求2或3或4所述牛结节性皮肤病病毒一管式巢式rpa-crispr/cas12a检测试剂盒，其特征在于：使用试剂盒进行检测时，包括两个体系：一管式巢式rpa体系：内引物rpa体系包含一管rpa冻干粉，20μl溶解剂，18.5μl ddh2o，25～35μm inner-forward引物和25～35μm inner-reverse引物,2.5μl激活剂；外引物rpa体系包含一管rpa冻干粉，20μl溶解剂，18.5μl ddh2o，25～35μm outer-forward引物和25～35μm outer-reverse引物,2.5μl激活剂；内、外引物体系分别混合后，分别取20μl装载在pcr管管盖和管底，2μl待检样品加入到管底，在37℃反应10～12分钟后，将管盖上的内引物体系试剂离心到管底，在37℃反应15～20分钟；crispr/cas12a体系：取巢式rpa扩增产物4μl加入到crispr/cas12a体系中，crispr/cas12a包含1
×
reaction buffer，100～125nm cas12a，125～150nm crrna，1～1.5μm ssdna reporter和10μl ddh2o。6.根据权利要求5所述牛结节性皮肤病病毒一管式巢式rpa-crispr/cas12a检测试剂盒，其特征在于：所述一管式巢式rpa体系中inner-forward引物、inner-reverse引物、outer-forward引物和outer-reverse引物的浓度均为35μm，外引物rpa体系反应时间为10分钟，内引物rpa体系反应时间为15分钟；所述crispr/cas12a包含1
×
reaction buffer，100nm cas12a，125nm crrna，1.5μm ssdna reporter和10μl ddh2o。7.根据权利要求5所述牛结节性皮肤病病毒一管式巢式rpa-crispr/cas12a检测试剂盒，其特征在于：crispr/cas12a体系在恒温荧光仪上37℃30min，采集荧光信号；结果判定如下：出现荧光信号的样本为阳性；荧光强度为0的为阴性。8.权利要求2-7任一项所述试剂盒在牛结节性皮肤病病毒一管式巢式rpa-crispr/cas12a非疾病诊断目的检测中的应用。9.使用权利要求2-4任一项所述试剂盒的牛结节性皮肤病病毒一管式巢式rpa-crispr/cas12a非疾病诊断目的检测方法，其特征在于，包括两个反应体系：一管式巢式rpa体系：内引物rpa体系包含一管rpa冻干粉，20μl溶解剂，18.5μl ddh2o，25～35μm inner-forward引物和25～35μm inner-reverse引物,2.5μl激活剂；外引物rpa
体系包含一管rpa冻干粉，20μl溶解剂，18.5μl ddh2o，25～35μm outer-forward引物和25～35μm outer-reverse引物,2.5μl激活剂；内、外引物体系分别混合后，分别取20μl装载在pcr管管盖和管底，2μl待检样品加入到管底，在37℃反应10～12分钟后，将管盖上的内引物体系试剂离心到管底，在37℃反应15～20分钟；crispr/cas12a体系：取巢式rpa扩增产物4μl加入到crispr/cas12a体系中，crispr/cas12a包含1
×
reaction buffer，100～125nm cas12a，125～150nm crrna，1～1.5μm ssdnareporter和10μl ddh2o，在恒温荧光仪上37℃30min，采集荧光信号。

技术总结
本发明公开了一种牛结节性皮肤病病毒一管式巢式RPA-CRISPR/Cas12a检测试剂盒及应用。一管式巢式RPA利用两对引物先后对同一区域进行扩增，打破了扩增平台期，提高了灵敏度，并解决了RPA的非特异性扩增问题。CRISPR/Cas12a系统的协助下，方法的特异性和灵敏度进一步被提高。针对牛结节性皮肤病病毒(LSDV)的VARV B22R基因，巢式RPA的实际检测限低至2.169copies


技术研发人员：聂福平 曹改花 杨俊 史梅梅 侯长军 王昱 谢晓倩 李应国 霍丹群 王国民
受保护的技术使用者：重庆海关技术中心
技术研发日：2023.03.20
技术公布日：2023/7/26