一种小麦糖转运蛋白、基因及其应用

1.本发明属于生物工程技术领域，涉及农业生物技术中的植物抗病材料及生物防治药物靶标的的选育，具体涉及一种小麦糖转运蛋白、编码基因及其应用。


背景技术：

2.小麦作为世界三大主粮之一，养活了全球约40％的人口，在我国粮食生产中也长期占据重要地位。由条形柄锈菌小麦专化形(puccinia striiformis f.sp.tritici，pst)引起的小麦条锈病是小麦生产中的一类重大真菌病害，病害流行年份可导致小麦减产超40％，危害严重的甚至会造成绝收。小麦条锈病是引起小麦产量损失最为严重的威胁之一，具有发生范围广、流行速度快、危害损失大等特点，严重威胁着我国粮食生产安全。
3.小麦条锈病的防治方法以化学防治为主，然而，长期大量不合理地使用化学农药会给环境和食品安全带来危害，这些问题也逐渐引起人们的普遍关注，因此，抗病育种是防治小麦条锈病最为经济有效且环境友好的措施之一。但抗病基因的挖掘周期长，抗病品种的培育难度大，而且条锈菌毒性变异快，导致该病害的防治一直难以实现持久的控制。因此，创制广谱、持久的抗病材料，被认为是防控小麦条锈病的根本途径。
4.植物感病基因，即能够促进病原菌侵染和定殖，导致寄主植物感病的基因。所有促进感染和亲和性的植物基因都可被认为是易感性(susceptibility，s)基因，改变植物的感病基因能够促使植物产生广谱持久的抗病性，基于此，通过揭示条锈菌的致病机制、鉴定小麦易感条锈病因子，从而为利用易感病原因子创制小麦抗病材料提供新思路和育种材料，对于实现小麦育种的广谱、持久抗病具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种小麦糖转运蛋白tasweet14d，以及编码所述糖转运蛋白tasweet14d的基因tasweet14d。本发明还提供了糖转运蛋白tasweet14d及其编码基因在小麦抗条锈品种培育中的应用。
6.为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种小麦糖转运蛋白tasweet14d，其具有如seq id no：1所示的氨基酸序列，所述糖转运蛋白tasweet14d在小麦与条锈菌互作过程中发挥糖转运功能，所述糖转运蛋白tasweet14d特异性转运蔗糖，所述糖转运蛋白tasweet14d通过促进条锈菌糖分吸收负调控小麦的抗病性。
7.进一步地，本发明还要求保护编码糖转运蛋白tasweet14d的基因tasweet14d，其核苷酸序列如seq id no：2所示，在条锈菌侵染寄主植物中为易感性基因。基因tasweet14d具有核苷酸序列如seq id no：3和/或seq id no：4所示的沉默片段。
8.本发明还提供了糖转运蛋白tasweet14d及其编码基因在小麦抗条锈病品种培育中的应用。
9.本发明进一步提供了一种小麦抗病育种的方法，该方法包括：将小麦糖转运蛋白基因tasweet14d利用crispr/cas9技术创制编辑材料，得到tasweet14d基因编辑的转基因
小麦，所述tasweet14d基因编辑片段的核苷酸序列如seq id no：5所示。
10.为了完整无异议地理解本发明的技术方案，需要补充说明的是，本发明所述小麦糖转运蛋白基因用倾斜字体“tasweet14d”表示，所述小麦糖转运蛋白用非倾斜字体“tasweet14d”表示。当然，本领域普通技术人员可以根据本发明的记载，清楚、完整地理解相关基因及其编码蛋白的含义与表述。
11.本发明与现有技术相比具有以下有益效果或者优点：
12.1)本发明首次揭示小麦糖转运蛋白tasweet14d在条锈菌与小麦互作过程中发挥感病作用。本发明通过解析其感病机理，为利用蛋白tasweet14d创制小麦抗病材料奠定理论基础，对培育持久抗条锈病小麦品种具有重要的意义。
13.2)本发明利用反向遗传学方法分析糖转运蛋白tasweet14d基因功能，所述基因tasweet14d受条锈菌侵染诱导表达，采用crispr/cas9基因编辑技术沉默基因tasweet14d，确定基因tasweet14d为易感病原因子，在条锈菌与小麦互作过程中发挥糖转运功能及感病功能。
14.3)本发明在提高小麦抗病性方面意义重大。借助基因工程技术，通过沉默或敲除小麦糖转运蛋白基因tasweet14d，可提高小麦对条锈病的抗性，本发明为从分子生物学角度开展小麦抗条锈品种培育提供了新的解决思路。
15.4)本发明明确了一种小麦抗条锈品种培育方法。该方法是将小麦糖转运蛋白基因tasweet14d通过crispr/cas9技术，获得沉默了基因tasweet14d的小麦品种。经验证，采用本发明方法获得的转基因小麦对条锈菌主要的流行小种cyr31表现出抗性。
附图说明
16.图1为本发明“一种小麦糖转运蛋白、基因及其应用”的技术路线图。
17.图2为本发明实施例所述小麦糖转运蛋白tasweet14d基因的糖转运功能鉴定结果图，其中，tasweet14d表示含有pdr195-tasweet14d的酵母菌株ysl2-1，pdr195表示空载体，mannose表示甘露糖，sucrose表示蔗糖。
18.图3为本发明实施例所述小麦糖转运蛋白基因tasweet14d vigs表型结果图，其中，tapds表示小麦白化病基因，gfp表示绿色荧光蛋白基因，tasweet14d as1表示vigs沉默片段1，其核苷酸序列如seq id no：3所示，tasweet14d as2表示vigs沉默片段2，其核苷酸序列如seq id no：4所示。
19.图4为本发明实施例所述条锈菌糖转运蛋白基因tasweet14d编辑位点和测序结果，其中，上方为tasweet14d基因结构示意图，数字1、2、3、4、5为标注的tasweet14d基因的5个外显子，intron表示内含子，exon表示外显子，upstream表示基因上游，downstream表示基因下游，sgrna表示导链序列，pam表示编辑位点；下方是测序比对结果，wt表示野生型序列，tasweet14d-line3表示编号为3的编辑株系，tasweet14d-line37表示编号为37的编辑株系。
20.图5为本发明实施例tasweet14d编辑的转基因小麦接种条锈菌致病型cyr31表型结果图，其中，fielder表示小麦品种fielder受体植株，tasweet14d-ko3表示纯合植株株系l3，tasweet14d-ko37表示纯合植株株系l37。
具体实施例
21.下面，结合实施例对本发明的技术方案进行说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
22.下述各实施例中实验方法和检测方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述药剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到；所述指标数据，如无特殊说明，均为常规测量方法。
23.图1给出了本发明“一种小麦糖转运蛋白、基因及其应用”的技术路线图。本发明实施例提供了蛋白tasweet14d糖转运功能的验证方法，包括：
24.s101，利用酵母突变体系统验证蛋白tasweet14d的糖转运功能；
25.s102，利用病毒诱导的基因沉默技术特异性瞬时沉默tasweet14d基因，明确其毒性功能；
26.s103，获取tasweet14d编辑的转基因小麦，对其进行测序分析；
27.s104，对tasweet14d编辑的转基因植株接种条锈菌致病型cyr31，鉴定转基因植株对条锈菌流行小种cyr31的抗性，确定tasweet14d沉默的转基因小麦的抗条锈特性。
28.本发明实施例进一步提供了小麦糖转运蛋白tasweet14d感病功能的鉴定方法，包括：
29.利用病毒诱导的基因沉默技术特异性瞬时沉默小麦糖转运蛋白基因tasweet14d，在二叶期接种病毒，接种后第10天检测在接种tapds后小麦叶片上是否呈现出漂白状，若是，则表示病毒接种成功；在四叶期接种小麦条锈菌新鲜孢子，接种后第12天检测叶片表面出现的孢子堆数量，并查看接菌叶片是否出现坏死；
30.利用crispr/cas9技术获得沉默了所述糖转运蛋白基因tasweet14d的小麦品种，并验证转基因编辑植株对条锈菌cyr31抗性情况。
31.实施例1
32.本实施例提供了小麦糖转运蛋白tasweet14d的分离克隆试验。
33.收集条锈菌生理小种cyr31的夏孢子，采用rna提取试剂盒(北京华越洋生物科技有限公司)按照操作说明使用，提取cyr31夏孢子的总rna。
34.利用重组逆转录酶m-mulv rt(thermo scientific公司)将cyr31夏孢子的总rna逆转录合成cdna第一链，反应条件为：42℃，30min；75℃，5min。以此为模板，利用tasweet14d基因特异性引物tasweet14d-cdna-f(5'-atgggcggcctctctgttca-3')与tasweet14d-cdna-r(5'-ctagacttgctcgacatggg-3')进行pcr扩增，扩增出含有tasweet14d基因全长编码框的dna片段。pcr反应条件为：95℃预变性5min；95℃30sec，58℃1min，72℃3min，40个循环；72℃补充延伸10min。
35.将获得的pcr扩增产物进行t连接，构建到pmd
tm
19(simple)载体(takara公司)，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞(上海唯地生物技术有限公司)，筛选检测出阳性克隆并过夜摇菌，提取质粒命名为t-tasweet14d，委托擎科生物技术有限公司测序，得到如seq id no：2所示的核苷酸序列。
36.实施例2
37.本实施例提供了小麦糖转运蛋白tasweet14d的糖转运功能验证试验。
38.根据tasweet14d基因序列设计引物pdr195-tasweet14d-f(5'-tataccccagcctcg
agatgggcggcctctctgttca-3')与pdr195-tasweet14d-r(5'-ccgcgcggccgctcgagctagacttgctcgacatggg-3')进行pcr扩增，扩增出含有pdr195同源序列的tasweet14d基因全长编码框的dna片段。pcr反应条件为：95℃预变性5min；95℃30sec，58℃1min，72℃3min，40个循环；72℃补充延伸10min。
39.将获得的pcr扩增产物构建到pdr195载体，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞(上海唯地生物技术有限公司)，筛选检测出阳性克隆并过夜摇菌，委托擎科生物技术有限公司测序，保留测序结果正确的质粒进行下一步实验，提取质粒命名为pdr195-tasweet14d。
40.将阳性克隆转化至酵母菌株ysl2-1，取ysl2-1菌液100μl，接种于ypd培养基(2％麦芽糖，液体)，30℃，200rpm培养24小时；用新鲜的上述培养基，以1:10的体积比进行转接，再培养5小时左右至od
600
＝0.6-1.0；离心机8000rpm，1min，收集菌体2ml；无菌水重悬菌体，8000rpm，1min，收集菌体。加100μl无菌水重悬菌体；配制转化反应体系peg/liac混合液500μl、pdr195-tasweet14d质粒100ng、ssdna 100μl、酵母菌液100μl；混匀，30℃，160rpm，复苏30min；每管加入20μl dmso，上下颠倒混匀；水浴锅中42℃放置15min，每4-5min上下颠倒混匀一次；700g离心5min，加600μl无菌水，混匀，蘸取涂在sd-ura(麦芽糖)固体培养基上，培养3天；pcr检测酵母单菌落。
41.将阳性克隆(酵母转化子)放入液体sd-ura(麦芽糖)培养基中，培养24小时。离心收集2ml酵母菌体，用1ml无菌水悬浮菌体。酵母细胞悬浮液稀释100倍，用血球计数板计算每毫升酵母细胞数量。梯度稀释酵母浓度分别为106、105、104、103倍，混匀后吸取6μl分别滴落在蔗糖含量2％和甘露糖含量2％的固体培养基上(sd-ura)。空载体作为阴性对照，30℃培养3-4d并拍照。结果如图2所示，其中，tasweet14d表示含有pdr195与tasweet14d融合质粒，pdr195表示空载体，其中甘露糖作为碳源组显示酵母状态正常，蔗糖组试验说明，蛋白tasweet14d具有蔗糖转运能力。
42.实施例3
43.本实施例提供了瞬时沉默基因tasweet14d特异性基因片段对条锈菌致病力影响的试验。
44.通过序列比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)及特异性分析，tasweet14d基因具有两个特异性较高的基因片段，核苷酸序列如seq id no：3所示的基因片段1和核苷酸序列如seq id no：4所示的基因片段2。以此两段特异性基因片段为基础构建小麦糖转运蛋白基因tasweet14d瞬时沉默载体bsmv：γ(bsmv：00)。tasweet14d基因沉默载体构建的具体操作过程参照实施例2。
45.将大麦条纹花叶病毒(bsmv)组装的3个部分α、β、γ，γ-tasweet14d，γ-tapds分别进行线性化。将线性化的dna片段体外转录成rna，体外转录过程中使用ribomaxtm large scale production system-t7试剂盒(promega公司)，反应体系为：37℃，1h；70℃，5min。
46.接毒时首先对照组将α、β、γ各10μl加入到200-300μl的fes缓冲液中，利用摩擦接种法将液体接种到小麦二叶上，摩擦三次。实验组将α、β、重组的γ-tasweet14d或者γ-tapds，以相同方式进行接毒。然后，将接毒的小麦苗置于25-28℃条件下培养10天，观察到接毒叶片上有明显的条纹状褪绿，则证明病毒接种成功。将病毒接种成功的小麦苗接种小麦条锈菌cyr31，接菌培养14天后，小麦叶片出现症状，小麦苗接毒培养10天及接菌14天后叶片形态见图3。
47.如图3所示，瞬时沉默小麦糖转运蛋白基因tasweet14d后，条锈菌产孢减少，叶片坏死面积减少，条锈菌的致病力明显减弱，表明糖转运蛋白基因tasweet14d在小麦条锈菌侵染小麦过程中发挥感病功能。
48.实施例4
49.本实施例提供了糖转运蛋白基因tasweet14d沉默表达转基因小麦的培育和其抗病性鉴定试验。
50.通过农杆菌介导的转化法将tasweet14d基因沉默载体导入小麦品种fielder受体材料，经过卡纳霉素抗性愈伤组织的筛选、预再生、再生、生根等步骤产生t0代转基因植株。选取两个独立的tasweet14d基因编辑的转基因纯合株系(l3和l37)进行抗条锈病鉴定，cyr31病菌接种具体操作过程参照实施例2。
51.小麦糖转运蛋白基因tasweet14d编辑纯合植株株系l3和l37的编辑位点示意图和测序结果见图4。小麦糖转运蛋白基因tasweet14d编辑纯合植株株系l3和l37接种条锈菌cyr31后的小麦叶片形态见图5，由图5可知，条锈菌cyr31对糖转运蛋白基因tasweet14d编辑纯合植株株系l3和l37的致病性明显减弱，基因tasweet14d沉默的转基因植株对条锈菌cyr31表现出抗性。
52.如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。
53.54.
技术特征：
1.一种小麦糖转运蛋白tasweet14d，其特征在于，具有如seq idno：1所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的糖转运蛋白tasweet14d，其特征在于，所述糖转运蛋白tasweet14d在小麦与条锈菌互作过程中发挥糖转运功能。3.根据权利要求1所述的糖转运蛋白tasweet14d，其特征在于，所述糖转运蛋白tasweet14d通过促进条锈菌糖分吸收负调控小麦的抗病性。4.根据权利要求1至3任一项所述的糖转运蛋白tasweet14d，其特征在于，所述糖转运蛋白tasweet14d特异性转运蔗糖。5.一种小麦糖转运蛋白基因tasweet14d，其特征在于，核苷酸序列如seq id no：2所示，编码表达糖转运蛋白tasweet14d。6.根据权利要求5所述的糖转运蛋白基因tasweet14d，其特征在于，在条锈菌侵染寄主植物中为易感性基因。7.根据权利要求5所述的糖转运蛋白基因tasweet14d，其特征在于，具有核苷酸序列如seq id no：3和/或seq id no：4所示的沉默片段。8.一种表达载体，其特征在于，含有核苷酸序列如seq id no：3和/或seq id no：4所示的沉默片段。9.小麦糖转运蛋白基因tasweet14d及其编码蛋白在抗条锈材料培育中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，沉默或敲除小麦糖转运蛋白基因tasweet14d，提高寄主植物对条锈菌的抗性。

技术总结
本发明公开了一种小麦糖转运蛋白TaSWEET14d，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述糖转运蛋白表达基因TaSWEET14d的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。所述糖转运蛋白TaSWEET14d具有蔗糖转运能力，在小麦与条锈菌互作过程中发挥感病功能。本发明利用CRISPR/Cas9技术，获得基因TaSWEET14d编辑的转基因植株，并验证了转基因干扰植株对条锈菌表现出抗性。本发明为后续小麦抗条锈病的遗传改良提供基因资源和技术支撑。基因资源和技术支撑。基因资源和技术支撑。


技术研发人员：刘杰 康振生 袁普 郑佩晶
受保护的技术使用者：西北农林科技大学
技术研发日：2023.03.21
技术公布日：2023/7/26