植物乳杆菌ASOSIN及其应用的制作方法

植物乳杆菌asosin及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及植物乳杆菌asosin及其应用。


背景技术：

2.近年来，高血压、高血糖、高血脂患者数量有明显上升趋势，高血压、高血糖、高血脂可能会导致一系列并发症甚至威胁生命安全，而高血压、高血糖、高血脂的早期防治有利于延缓并发症的发生发展。
3.高血压、高血糖、高血脂经常同时出现，采用药物治疗时，需要同时服用至少3种不同药物，除药物本身的副反应外，同时服用多种不同剂量的药物也为患者带来诸多不便。而很多早期症状较轻的人群，更不愿接受多种药物治疗，往往延误最佳的治疗时机。
4.益生菌近年来已被广泛应用于疾病的预防和治疗。在降糖、降压、降脂等功效方面，已报道的菌株包括鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌等，这些益生菌或通过菌株直接发挥降压、降糖、降脂作用，或通过菌株发酵底物发挥作用。然而，目前对于兼具降糖、降压、降脂功效的益生菌(尤其是植物乳杆菌)却少有报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供植物乳杆菌asosin，该菌株具有降血压、降血糖、降血脂功能。本发明还提供植物乳杆菌asosin的应用及其产品。
6.本发明通过改良筛选培养基及培养条件，意外地从新疆牧民家庭世代传承饮用的开菲尔酸奶发酵种子——开菲尔粒中筛选得到一株纯种的植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)asosin，该菌株在耐酸、耐胆盐方面较其他乳酸菌具有明显优势，无抗生素耐药性，肠道粘附性好，能够定殖肠道发挥降压、降糖、降脂作用。
7.具体地，本发明提供植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)asosin，该菌株已于2021年9月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为植物乳杆菌lactobacillus plantarum，保藏编号为cgmcc no.23412。
8.植物乳杆菌asosin的16s rdna序列如seq id no.1所示。
9.植物乳杆菌asosin的主要形态为杆状、革兰氏染色阳性、氧化酶阴性、接触酶阴性，其利用碳水化合物产酸情况如表1所示。
10.表1植物乳杆菌asosin理化实验结果
[0011][0012][0013]
注：表1中，产酸：+不产酸：-。
[0014]
本发明提供一种菌剂，其含有所述植物乳杆菌asosin。
[0015]
优选地，上述菌剂中植物乳杆菌asosin以活菌形式存在。
[0016]
优选地，上述菌剂还含有冻干保护剂和/或载体。
[0017]
上述菌剂可以为液体菌剂或固体菌剂(例如：干粉菌剂)。
[0018]
本发明提供以上所述的菌剂的制备方法，所述方法包括将植物乳杆菌asosin经培养获得菌液的步骤。
[0019]
优选地，所述培养使用的培养基包括如下组分：有机氮源30-50g/l，核糖20-25g/l，半乳糖或甘露糖10-15g/l，硫酸镁1-1.5g/l，氯化钠0-1g/l，磷酸氢二钾0-1g/l，硫酸亚铁0-0.1g/l，硫酸锰0-0.1g/l，硫酸锌0.5-0.6g/l，烟酸0.4-0.5g/l，嘌呤或嘧啶0.1-0.2g/l；
[0020]
所述有机氮源为选自大豆蛋白胨、乳清蛋白、牛肉膏、酵母粉中的一种或多种。
[0021]
优选地，所述培养为在25-36℃进行。
[0022]
上述获得的菌液可直接或加入微生物制剂领域允许的辅料制备为液体菌剂，也可收集菌液中的菌体与冻干保护剂等微生物制剂领域允许的辅料混合后经真空冷冻干燥制备为固体菌剂。
[0023]
本发明还提供一种培养物，所述培养物由所述植物乳杆菌asosin经培养得到。
[0024]
优选地，所述培养使用的培养基包括如下组分：有机氮源30-50g/l，核糖20-25g/l，半乳糖或甘露糖10-15g/l，硫酸镁1-1.5g/l，氯化钠0-1g/l，磷酸氢二钾0-1g/l，硫酸亚铁0-0.1g/l，硫酸锰0-0.1g/l，硫酸锌0.5-0.6g/l，烟酸0.4-0.5g/l，嘌呤或嘧啶0.1-0.2g/l；
[0025]
所述有机氮源为选自大豆蛋白胨、乳清蛋白、牛肉膏、酵母粉中的一种或多种。
[0026]
采用上述培养基进行发酵培养不仅有利于植物乳杆菌asosin的生长，而且所得培养物的降血压、降血糖、降血脂功效更佳。
[0027]
优选地，所述培养为在25-36℃进行。
[0028]
优选地，所述培养物为将所述植物乳杆菌asosin经发酵培养后得到的发酵液上清和/或菌体。所述发酵液上清中包含植物乳杆菌asosin的代谢产物。
[0029]
本发明还提供所述植物乳杆菌asosin的发酵培养方法，发酵培养所使用的培养基包含如下组分：氮源5-40g/l、碳源5-40g/l、无机盐1-10g/l、微量元素0.1-1g/l、生长因子0.1-1g/l。
[0030]
其中，所述氮源选自大豆蛋白胨、乳清蛋白粉、牛肉膏、酵母粉、胰蛋白胨中的一种或多种。
[0031]
所述碳源选自葡萄糖、核糖、乳糖、半乳糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、海藻糖中的一种或多种。
[0032]
所述无机盐选自氯化钠、磷酸氢二钾、硫酸亚铁铵、碳酸钙、硫酸镁中的一种或多种。
[0033]
所述微量元素选自p、s、mg、fe、k、na、cu、zn、mn中的一种或多种。
[0034]
所述生长因子选自维生素、碱基、嘌呤、嘧啶、生物素、烟酸中的一种或多种。
[0035]
优选地，当所述氮源为乳清蛋白与选自大豆蛋白胨和酵母粉中的任意一种的混合物且乳清蛋白在氮源中的占比为40-70wt％时，植物乳杆菌asosin的发酵效果(包括菌体生长效果及培养物的降血压、降血糖、降血脂效果)更优。
[0036]
优选地，当所述碳源为核糖、半乳糖、甘露糖中的至少一种且核糖在碳源中的占比为50-80wt％时，植物乳杆菌asosin的发酵效果(包括菌体生长效果及培养物的降血压、降血糖、降血脂效果)更优。
[0037]
优选地，当所述无机盐为氯化钠、磷酸氢二钾、硫酸镁中的至少一种且硫酸镁在无机盐中的占比为40-75wt％时，植物乳杆菌asosin的发酵效果(包括菌体生长效果及培养物的降血压、降血糖、降血脂效果)更优。
[0038]
优选地，当所述微量元素为fe、zn、mn中的至少一种且zn在微量元素中的占比为30-90wt％时，植物乳杆菌asosin的发酵效果(包括菌体生长效果及培养物的降血压、降血糖、降血脂效果)更优。
[0039]
优选地，当所述生长因子为嘌呤、嘧啶、烟酸中的至少一种且烟酸在生长因子中的占比为60-90wt％时，植物乳杆菌asosin的发酵效果(包括菌体生长效果及培养物的降血压、降血糖、降血脂效果)更优。
[0040]
基于植物乳杆菌asosin的功能，本发明提供植物乳杆菌asosin或所述菌剂或所述培养物在制备食品或药物中的应用。
[0041]
本发明提供植物乳杆菌asosin或所述菌剂或所述培养物在制备具有降血糖、降血
压和/或降血脂功效的产品中的应用。
[0042]
优选地，所述产品为药物或益生菌制剂。
[0043]
本发明提供植物乳杆菌asosin或所述菌剂或所述培养物在制备具有血管紧张素转化酶抑制功能的产品中的应用。
[0044]
优选地，所述产品为药物或益生菌制剂。
[0045]
本发明提供一种药物组合物，其包含所述植物乳杆菌asosin或所述菌剂或所述培养物。
[0046]
本发明的有益效果至少包括：本发明的植物乳杆菌asosin具有耐酸、耐胆盐的特性和较强的粘附能力，无抗生素耐药性，同时具有优良的降血糖、降血压和降血脂功效，可作为益生菌用以开发功能性食品、益生菌制剂等，具有较好的应用价值。
具体实施方式
[0047]
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0048]
实施例1植物乳杆菌asosin的分离与鉴定
[0049]
将新疆牧民家庭世代传承饮用的开菲尔酸奶发酵种子——开菲尔颗粒用0.9％无菌生理盐水冲洗干净，接种至已灭菌的生牛乳中，于37℃活化培养24h。用无菌移液枪吸取已活化好的乳液接种至已灭菌的筛选培养基，并进行分离纯化。
[0050]
在分离培养中，采用平板划线法，在25℃静置培养72h后，挑取颜色为乳白色、形状呈圆形、表面凸起且光滑的菌落。
[0051]
经筛选、分离和纯化，得到一株细菌，对筛选得到的菌株进行形态、生理生化和16s rdna序列的鉴定，结果如下：
[0052]
形态：菌株主要形态为杆状，单个、有时成对或成链状。
[0053]
生理生化：革兰氏染色阳性、氧化酶阴性、接触酶阴性。
[0054]
16s rdna测序结果如seq id no.1所示。经分析，该菌株为植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)。
[0055]
将该菌株命名为植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)asosin，该菌株已于2021年9月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为植物乳杆菌lactobacillus plantarum，保藏编号为cgmcc no.23412。
[0056]
实施例2植物乳杆菌asosin的性能检测
[0057]
1、酸耐受力
[0058]
模拟胃液的制备：取16.4ml配制好的稀盐酸加入800ml水和10g胃蛋白酶，摇匀，加水稀释至1000ml。
[0059]
将植物乳杆菌asosin接入模拟胃液中，调节菌体浓度为1
×
109cfu/ml，37℃静置培养3个小时，通过倾注平板法计数模拟胃液处理前后的活菌数，实验重复3次。
[0060]
耐受力计算公式为：耐受力(％)＝(lg耐受条件下活菌数/lg耐受条件处理前活菌数)
×
100。
[0061]
结果显示，植物乳杆菌asosin在模拟胃液中的存活率高达95.62
±
0.64％。具有良好的酸耐受力。
[0062]
2、胆盐耐受力
[0063]
将植物乳杆菌asosin接入0.3％胆盐的液体mrs培养基中拌匀，调节菌体浓度为1
×
109cfu/ml，37℃静置培养3个小时，通过倾注平板法计数胆盐处理前后的活菌数，实验重复3次。通过耐受力计算公式得出耐受力。
[0064]
结果显示，植物乳杆菌asosin经胆盐处理后的存活率高达82.33％，该菌株具有良好的胆盐耐受能力。
[0065]
3、疏水性测试
[0066]
将植物乳杆菌asosin在37℃静置培养24h后，4℃，5000rpm离心10min，弃上清，收集沉淀。无菌的pbs缓冲液洗涤菌体2次，再重新悬浮于灭菌的0.1m kno3溶液中，调整细菌悬浮液浓度为107～108cfu/ml，od
600nm
的吸光度达到0.5
±
0.2(a0)。从中取3ml菌悬液并向其中加入1ml二甲苯，涡旋震荡3min，室温静置。仔细吸取水相部分，在600nm下测定水相的吸光度(a1)。
[0067]
细胞表面疏水性计算公式：表面疏水性(％)＝(1-a1/a0)
×
100。结果显示，植物乳杆菌asosin的疏水性为60.25％，表明该菌株具有较强的粘附能力。
[0068]
实施例3植物乳杆菌asosin的发酵培养
[0069]
将植物乳杆菌asosin菌株制备为菌悬液，接种到不同配方的液体发酵培养基中并在不同培养条件下进行发酵培养，然后进行活菌计数，具体如下：
[0070]
发酵培养基配方1：每1l发酵培养基中含有大豆蛋白胨20g、乳清蛋白20g、核糖20g、半乳糖15g、硫酸镁1g、磷酸氢二钾1g、硫酸亚铁0.1g、硫酸锌0.5g、烟酸0.5g、嘌呤0.1g。
[0071]
在25℃下发酵24小时，在发酵结束后，对活菌进行计数，为3.7
×
106cfu/ml。
[0072]
发酵培养基配方2：每1l发酵培养基中含有乳清蛋白20g、酵母粉20g、核糖20g、甘露糖15g、硫酸镁1g、氯化钠1g、硫酸锰0.1g、硫酸锌0.5g、烟酸0.5g、嘧啶0.1g。
[0073]
在36℃下发酵24小时，在发酵结束后，对活菌进行计数，为4.2
×
106cfu/ml。
[0074]
发酵培养基配方3：每1l发酵培养基中含有乳清蛋白25g、酵母粉15g、核糖25g、甘露糖10g、硫酸镁1.5g、氯化钠0.5g、硫酸锰0.05g、硫酸锌0.55g、烟酸0.4g、嘧啶0.2g。
[0075]
在25℃下发酵72小时，在发酵结束后，对活菌进行计数，为8.3
×
108cfu/ml。
[0076]
发酵培养基配方4：每1l发酵培养基中含有牛肉膏40g、核糖20g、半乳糖15g、硫酸镁1g、磷酸氢二钾1g、硫酸亚铁0.1g、硫酸锌0.5g、烟酸0.5g、嘌呤0.1g。
[0077]
在25℃下发酵48小时，在发酵结束后，对活菌进行计数，为2.1
×
105cfu/ml。
[0078]
实施例4植物乳杆菌asosin对血压的调节作用
[0079]
制备植物乳杆菌asosin的菌悬液，其中植物乳杆菌asosin的活菌数达到1
×
108cfu/ml，于4℃保存备用。
[0080]
测定菌悬液的血管紧张素转化酶(ace)抑制活性(acei)，操作步骤如下：
[0081]
取a、b、c、d四个试管，依据表2中所示剂量向各管依次加入各种试剂，37℃水浴预热5分钟，再加入ace、37℃水浴反应30min，然后向各个试管中加入1mol/l hcl以终止反应，再向各试管中加入乙酸乙酯1.5ml吸收反应产生的马尿酸，旋涡混合后4000g离心10min，吸取1ml乙酸乙酯层移入另一试管中，放入烘箱100℃挥发溶剂30min，冷却后加入2.5ml去离子水，旋涡混合30秒后在228nm下测定其吸光度值。
[0082]
表2ace抑制活性测定
[0083][0084]
ace抑制活性的计算公式如下：
[0085][0086]
式中，a：样a的光密度值，样a在反应中不加抑制剂，反应结束后添加抑制剂以维持整个反应体系平衡，是ace与hhl完全反应的对照；
[0087]
b：样b的光密度值，样b在反应中不加抑制剂，在反应前先失活ace、反应结束后添加抑制剂以维持整个反应体系平衡，是样a反应的空白；
[0088]
c：样c的光密度值，样c在反应中加抑制剂，是ace与hhl同时反应的样品；
[0089]
d：样d的光密度值，样d在反应中加抑制剂，在反应前先失活ace、是样c反应的空白。
[0090]
结果显示，植物乳杆菌asosin的ace抑制活性为51.2％，表明植物乳杆菌asosin能够显著抑制血管紧张素转换酶(ace)，从而发挥降血压功效。
[0091]
实施例5植物乳杆菌asosin对血糖和血脂的调节作用
[0092]
对植物乳杆菌asosin进行体内实验验证其对血糖和血脂的调节作用，具体如下：
[0093]
1、2型糖尿病模型大鼠的构建
[0094]
选取70只雄性6-8周龄的wistar大鼠，用基础饲料适应性喂养5天后，随机分为低脂组和高脂组。前四周，除低脂组喂食基础饲料外，其它各组均喂食高脂饲料，并于每周固定时间进行大鼠的体重测量记录。第五周，所有大鼠禁食不禁水12-18h，除低脂组外，其余各组大鼠均按照30-40mg/kg体重注射新鲜配制的链脲霉素stz(将stz溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(ph 4.5)中，现配现用，冰浴保存)，低脂组注射柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中(ph 4.5)。造模后72h期间保证充足的无菌水及高脂饮食，并每日更换垫料，72h后随机血糖高于
16.7mmol/l，或者空腹血糖高于11.7mmol/l即为造模成功的糖尿病大鼠。
[0095]
2、灌胃治疗
[0096]
将造模成功的大鼠随机分为模型组、lgg组(市售菌株，鼠李糖杆菌gg株)、植物乳杆菌asosin组，模型组用0.85％的生理盐水作为对照，lgg组和植物乳杆菌asosin组以1
×
109cfu/天进行为期6-8周的灌胃治疗。体内实验的验证中灌胃6周大鼠随机血糖、血脂变化值如表3所示。
[0097]
表3各组大鼠血糖变化值
[0098]
组别低脂组模型组lgg组植物乳杆菌asosin血糖值mmol/l8.3
±
1.525.2
±
3.323.5
±
3.617.1
±
2.1总胆固醇mmol/l65.7
±
0.4121.2
±
1.4109.2
±
2.771.2
±
0.5
[0099]
结果表明，植物乳杆菌asosin对血糖、血脂具有显著降低作用。
[0100]
综上所述，本发明提供的植物乳杆菌asosin同时具有较好的降血压、降血糖和降血脂作用，对于高血压、高血糖和高血脂具有良好的治疗效果，且安全高效，可应用于功能性食品、药物、益生菌制剂等的开发。
[0101]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)asosin，其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23412。2.一种菌剂，其特征在于，其含有权利要求1所述的植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)asosin。3.权利要求2所述的菌剂的制备方法，其特征在于，包括将植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)asosin经培养获得菌液的步骤。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述培养使用的培养基包括如下组分：有机氮源30-50g/l，核糖20-25g/l，半乳糖或甘露糖10-15g/l，硫酸镁1-1.5g/l，氯化钠0-1g/l，磷酸氢二钾0-1g/l，硫酸亚铁0-0.1g/l，硫酸锰0-0.1g/l，硫酸锌0.5-0.6g/l，烟酸0.4-0.5g/l，嘌呤或嘧啶0.1-0.2g/l；所述有机氮源为选自大豆蛋白胨、乳清蛋白、牛肉膏、酵母粉中的一种或多种。5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述培养为在25-36℃进行。6.一种培养物，其特征在于，其由权利要求1所述的植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)asosin经培养得到。7.权利要求1所述的植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)asosin或权利要求2所述的菌剂或权利要求6所述的培养物在制备食品或药物中的应用。8.权利要求1所述的植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)asosin或权利要求2所述的菌剂或权利要求6所述的培养物在制备具有降血糖、降血压和/或降血脂功效的产品中的应用。9.权利要求1所述的植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)asosin或权利要求2所述的菌剂或权利要求6所述的培养物在制备具有血管紧张素转化酶抑制功能的产品中的应用。10.一种药物组合物，其特征在于，其包含权利要求1所述的植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)asosin或权利要求2所述的菌剂或权利要求6所述的培养物。

技术总结
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及植物乳杆菌ASOSIN及其应用。本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ASOSIN保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23412。植物乳杆菌ASOSIN具有耐酸、耐胆盐的特性和较强的粘附能力，无抗生素耐药性，同时具有优良的降血糖、降血压和降血脂功效，可作为益生菌用以开发功能性食品、益生菌制剂等，具有较好的应用价值。具有较好的应用价值。


技术研发人员：郭智华 徐双华 田宇
受保护的技术使用者：北京中京丰创科技有限公司
技术研发日：2023.03.21
技术公布日：2023/7/26