同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的引物组及应用

1.本发明涉及鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体技术领域，更具体地说是涉及同时检测和鉴别鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的引物组及应用。


背景技术：

2.家禽业是我国畜牧业的支柱产业之一，连续多年保持家禽饲养量、禽蛋产量世界第一、禽肉产量世界第二的水平。近年来，随着我国家禽产业规模化、集约化、智能化的迅猛发展，家禽支原体的感染率和发病率呈上升趋势。
3.禽类致病性的支原体主要有鸡毒支原体(mycoplasma gallisepticum,mg)和鸡滑液囊支原体(mycoplasma synoviae,ms)。mg又称鸡败血性支原体，是引起鸡呼吸系统疾病的主要病原菌。ms可引起鸡和火鸡的系统性感染发生呼吸道疾病，严重者导致关节渗出性滑液囊膜和腱鞘滑膜炎。鸡只感染mg和ms后，除造成上述症状外，还可造成鸡只生长缓慢、产蛋率下降，免疫力降低，对其它病原的易感性增加等，严重威胁养鸡业健康发展。目前，mg和ms在我国养鸡业中流行广泛且多为混合感染，二者前期引起鸡和火鸡的症状相似，为临床早期鉴别带来巨大困难。同时，鸡群中支原体隐性感染非常普遍，平时不表现明显的临床症状，往往在遇到生产应激以后诱发疾病，造成损失。因此，亟需开发新型、快速、准确的方法对mg和ms进行精准鉴别，通过流行病学调查和早期监测预警，实现疫病防控“关口前移”，为提前采取针对性的预防措施提供科学依据，降低鸡和火鸡的支原体病感染率和发病率，保障家禽行业绿色健康发展。
4.目前，实验室支原体检测方法包括培养法、pcr、血清学等检测mg和ms。但培养法耗时长、成本高、操作繁琐，血清学方法无法鉴别疫苗抗体和野毒感染产生的抗体，难以满足实际生产的需要。pcr方法具有灵敏性好、准确度高、检测速度快等特点，已经被广泛应用于动物疫病病原的检测。和常规pcr方法相比，荧光定量pcr技术，耗时更短、敏感性更高、特异性强，且可实现病原核酸的定量检测，可应用于动物疾病的流行病学调查、养殖场疫病监测预警和实验室研究等，具有良好的应用前景。同时，以上方法通常只能检测某一种支原体，工作效率低，成本高。因此，开发一种能同时检测并鉴别mg和ms荧光定量pcr方法，对于开展家禽支原体病的流行病学调查、疫病监测预警和开展针对性的防控，保障我国家禽安全生产和推进兽药减量化使用具有十分重要的意义。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了一种同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的引物组及应用。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的引物组，包括seq id no.1～seq id no.6所示的序列；
8.鸡毒支原体引物序列包括：
9.mg-f：5
’‑
accttacctagacttgacat-3’，seq id no.1；
10.mg-r：5
’‑
aacatctcacgacacga-3’，seq id no.2；
11.mg-probe：5
’‑
gacaggtggtgcatggtt-3’，seq id no.3；5’端和3’端分别携带有hex和bhq1荧光基团；
12.鸡滑液囊支原体引物序列包括：
13.ms-f：5
’‑
cacaatgggcgaaagcctgatggag-3’，seq id no.4；
14.ms-r：5
’‑
catagttagccgttgctttctgaca-3’，seq id no.5；
15.ms-probe：5
’‑
ttcgggttgtaaactactgtta-3’(bhq2)，seq id no.6；5’端和3’端分别携带有cy5和bhq2荧光基团。
16.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所示的引物组在制备同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体试剂盒中的应用。
17.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的试剂盒，包括所示的引物组。
18.优选地，其特征在于，包括：pcr缓冲液、对照a液和对照b液；所述pcr缓冲液包括2
×
premix ex taq和引物组，引物和探针浓度均为10.0μmol/l；所述对照a液为mg+ms模板，摩尔比为1:1；所述对照b液为灭菌超纯水。
19.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种以非诊断治疗为目的的同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的方法，提取检测样本的全基因组dna，以权利要求1所述的引物和探针进行荧光定量pcr反应，收集荧光信号，统计ct值，当ct值大于36时判定为阴性。
20.优选地，所述pcr反应的反应体系为：
[0021][0022]
优选地，pcr反应程序为：
[0023][0024]
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明达到的技术效果是：
[0025]
(1)分别针对mg和ms的16s rrna基因核苷酸序列设计引物对和taqman探针，反应体系中各组分之间互不干扰，能够同时检测和鉴别mg和ms；
[0026]
(2)本发明方法检测全程用时55分钟，与常规pcr(pcr扩增1小时30分钟，制备琼脂糖凝胶30分钟，电泳40分钟，观察结果10分钟)相比，具有时效快、操作简便、准确度高等特点。
[0027]
(3)本发明的试剂盒能同时、快速、准确的鉴别mg和ms，检测最低限分别为5.4
×
101copies
·
μl-1
和6.6
×
101copies
·
μl-1
。
附图说明
[0028]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0029]
图1为利用本发明双重荧光定量pcr检测方法检测鸡毒支原体标准品的扩增结果，图中1～9标识分别代表鸡毒支原体标准品浓度2.7
×
109copies
·
μl-1
至2.7
×
101copies
·
μl-1
对应的检测结果；
[0030]
图2为利用本发明双重荧光定量pcr检测方法检测鸡滑液囊支原体标准品的扩增结果，图中1～9标识分别代表鸡滑液囊支原体标准品浓度3.3
×
109copies
·
μl-1
至3.3
×
101copies
·
μl-1
对应的检测结果；
[0031]
图3为利用本发明双重荧光定量pcr检测方法检测鸡毒支原体的标准曲线；
[0032]
图4为利用本发明双重荧光定量pcr检测方法检测鸡滑液囊支原体的标准曲线；
[0033]
图5为鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体双重荧光定量pcr检测方法的特异性试验结果，图中1～4标识分别代表鸡滑液囊支原体ms wvu1853株、鸡毒支原体标准品puc7-mg、鸡毒支原体mg rlow株和鸡滑液囊支原体标准品puc57-ms对应的检测结果，5标识代表灭菌超纯水、禽腺病毒iv型y17215-1株、禽腺病毒标准株fadv-1、fadv-8a、fadv-8b、fadv-11、鸡大肠杆菌ww1株、鸡沙门氏菌79-13株、鸡减蛋综合征病毒76株、鸡传染性喉气管炎病毒k317株、鸡传染性支气管炎病毒h129株、鸡新城疫病毒lasota株、鸡马立克病病毒814株、鸡传染性法氏囊病毒b87株、鸭瘟病毒cvccav1222株、禽流感病毒h5亚型和h9亚型对应的检测结果；
[0034]
图6为利用本发明双重荧光定量pcr检测方法检测鸡毒支原体标准品的敏感性试验结果，图中1～9标识分别代表鸡毒支原体标准品浓度2.7
×
109copies
·
μl-1
至2.7
×
101copies
·
μl-1
对应的检测结果；
[0035]
图7为利用本发明双重荧光定量pcr检测方法检测鸡滑液囊支原体标准品的敏感性试验结果，图中1～9标识分别代表鸡滑液囊支原体标准品浓度3.3
×
109copies
·
μl-1
至3.3
×
101copies
·
μl-1
对应的检测结果；
[0036]
图8为利用本发明双重荧光定量pcr检测方法检测鸡毒支原体标准品的重复性试验结果，图中1～3标识分别代表标识分别代表鸡毒支原体标准品浓度2.7
×
108copies
·
μl-1
、2.7
×
106copies
·
μl-1
、2.7
×
104copies
·
μl-1
)对应的检测结果；
[0037]
图9为利用本发明双重荧光定量pcr检测方法检测鸡滑液囊支原体标准品的重复性试验结果，图中1～3标识分别代表标识分别代表鸡滑液囊支原体标准品浓度3.3
×
108copies
·
μl-1
、3.3
×
106copies
·
μl-1
、3.3
×
104copies
·
μl-1
对应的检测结果。
taq(probe qpcr)10.0μl，mg-f、mg-r、ms-f和ms-r分别1.0μl，mg-probe和ms-probe分别0.5μl，加灭菌超纯水补足至18.0μl，制备反应液，做好标记(建议按照n+1个样品量进行反应液的配制)。随后将反应管转移至超净工作台，向每个反应管加入2.0μl的质粒标准品，瞬时离心30s，排出反应管里的气泡。调节gentier 96e全自动医用pcr仪(购自西安天隆科技有限公司)的反应程序，设置退火温度(tm)为54.0℃、56.0℃、58.0℃、60.0℃和62.0℃，反应程序为：第一步：95℃预变性3min；第二步：94℃变性10s，tm延伸30s，40个循环，在延伸阶段收集荧光信号。pcr仪荧光通道设置为：通道1：hex，通道2：cy5。
[0049]
根据检测结果(表2)，60℃，ct值最低，说明敏感性最好，确定60℃为最佳退火温度。
[0050]
表2不同退火温度对应的检测结果
[0051][0052]
(3)双重荧光定量pcr方法最佳引物浓度和探针浓度摸索
[0053]
以上述制备的质粒puc57-mg和puc57-ms为模板，分别选取2.7
×
105copies
·
μl-1
和3.3
×
105copies
·
μl-1
浓度，应用宝生物工程(大连)有限公司生产的2
×
premix ex taq(probe qpcr)开展荧光定量pcr试验，进行最佳引物浓度和探针浓度摸索。引物和探针的使用情况见表3，反应体系为20.0μl。先制备总反应液，混匀后分装于荧光定量pcr反应管中，做好标记(建议按照n+1个样品量进行反应液的配制)。随后将反应管转移至超净工作台，向每个反应管加入2.0μl的质粒标准品，瞬时离心30s，排出反应管里的气泡。调节gentier 96e全自动医用pcr仪的反应程序：第一步：95℃预变性3min；第二步：94℃变性10s，60℃延伸30s，40个循环，在延伸阶段收集荧光信号。pcr仪荧光通道设置为：通道1：hex，通道2：cy5。
[0054]
表3不同浓度引物和探针使用结果
[0055][0056]
表4不同使用浓度引物和探针对应的检测结果
[0057][0058]
结果显示，双重荧光定量pcr方法使用的引物浓度和探针浓度分别为1.0μl和0.5μl时反应结果最佳(表3和表4)。
[0059]
(4)标准曲线的建立
[0060]
应用双重荧光定量pcr反应对mg和ms对应质粒标准品puc57-mg和puc57-ms进行扩增，其中mg质粒标准品浓度为2.7
×
109copies
·
μl-1
至2.7
×
100copies
·
μl-1
；ms质粒标准品浓度为3.3
×
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·
μl-1
至3.3
×
100copies
·
μl-1
。应用宝生物工程(大连)有限公司生产的2
×
premix ex taq(probe qpcr)开展荧光定量pcr试验，获得数据绘制相应的标准曲线。反应体系20.0μl：2
×
premix ex taq(probe qpcr)10.0μl，mg-f、mg-f、mg-r、ms-f和ms-r各1.0μl，mg-probe和ms-probe各0.5μl，加入灭菌超纯水1.0μl，按照n+1个样品制备反应液。按照(3)所述操作添加模板并设置gentier 96e全自动医用pcr仪的反应程序。结果见图1～4和表5。
[0061]
表5标准曲线扩增效率结果统计
[0062]
[0063]
综上所述，发明人已成功建立了鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体双重荧光定量pcr方法。
[0064]
(5)特异性试验
[0065]
以表6中涉及的菌毒株的核酸为待测病原模板，以mg和ms对应的质粒标准品puc57-mg和puc57-mg为阳性对照，超纯水为阴性对照，利用(4)建立的鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体双重荧光定量pcr方法进行特异性试验。
[0066]
表6菌/毒株种类和来源
[0067][0068][0069]
注：“*”分离与鉴定依据“王利丽,田向学,路超,李秀丽,李富强,任卫科,李程,张莉,鄢明华.禽腺病毒血清4型y17215-1株对spf鸡胚及spf鸡的致病性研究[j].黑龙江畜牧兽医,2022(7):8.”；天津市农业科学院畜牧兽医研究所实验室位于天津市西青区津静公路17公里处天津市农业科学院园区畜牧兽医研究所办公楼。
[0070]
结果如表7和图5所示，应用本发明的方法检测fadv、e.coli、se、edsv、iltv、ibv、ndv、mdv、ibdv、dpv、aiv等病原阴性，检测mg和ms对应质粒标准品puc57-mg和puc57-ms以及mg rlow株和ms wvu1853株均为阳性，表明双重荧光定量pcr方法具有很好的特异性。
[0071]
表7双重荧光定量pcr方法的特异性试验结果
[0072][0073][0074]
注：“+”表示阳性；
“‑”
表示阴性。
[0075]
(7)敏感性试验
[0076]
分别以(1)中10倍比稀释的质粒标准品puc57-mg和puc57-ms为模板，选用(4)中的反应体系和操作步骤，应用鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体双重荧光定量pcr方法对不同浓度的质粒标准品进行扩增，试验重复1次。
[0077]
如图6～7的结果所示，本发明的双重荧光定量pcr方法检测mg和ms的最低检测限分别为5.4
×
101copies
·
μl-1
和6.6
×
101copies
·
μl-1
，表明本发明检测用引物和方法的灵敏度高。
[0078]
(8)重复性试验
[0079]
选取mg和ms对应质粒标准品puc57-mg(浓度为2.7
×
108co pies
·
μl-1
、2.7
×
106copies
·
μl-1
、2.7
×
104copies
·
μl-1
)和puc57-ms(浓度3.3
×
108copies
·
μl-1
、3.3
×
106copies
·
μl-1
、3.3
×
104copies
·
μl-1
)为模板，应用鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体双重荧光定量pcr方法进行重复性试验，反应体系和操作步骤同(4)。统计批内(3个重复)和批间(3个重复)的检测结果，计算变异系数cv％(＝标准差sd
×
平均值mean-1
×
100％)，分析方法的重复性。上述试验重复2次。
[0080]
表8双重荧光定量pcr方法检测mg重复性试验结果
[0081][0082][0083]
表9双重荧光定量pcr方法检测ms重复性试验结果
[0084][0085]
如表8～9和图8～9的结果所示，批内和批间试验的变异系数(cv％)均小于1％，表明本发明双重荧光定量pcr方法的稳定性好、准确性高。
[0086]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0087]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明
将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：
1.一种同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的引物组，其特征在于，包括seq id no.1～seq id no.6所示的序列；鸡毒支原体引物序列包括：mg-f：5
’‑
accttacctagacttgacat-3’，seq id no.1；mg-r：5
’‑
aacatctcacgacacga-3’，seq id no.2；mg-probe：5
’‑
gacaggtggtgcatggtt-3’，seq id no.3；5’端和3’端分别携带有hex和bhq1荧光基团；鸡滑液囊支原体引物序列包括：ms-f：5
’‑
cacaatgggcgaaagcctgatggag-3’，seq id no.4；ms-r：5
’‑
catagttagccgttgctttctgaca-3’，seq id no.5；ms-probe：5
’‑
ttcgggttgtaaactactgtta-3’，seq id no.6；5’端和3’端分别携带有cy5和bhq2荧光基团。2.权利要求1所示的引物组在制备同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体试剂盒中的应用。3.一种同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所示的引物组。4.根据权利要求3所述的一种同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的试剂盒，其特征在于，包括：pcr缓冲液、对照a液和对照b液；所述pcr缓冲液包括2
×
premixextaq和引物组，引物和探针浓度均为10.0μmol/l；所述对照a液为mg+ms模板，摩尔比为1:1；所述对照b液为灭菌超纯水。5.一种以非诊断治疗为目的的同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的方法，其特征在于，提取检测样本的全基因组dna，以权利要求1所述的引物和探针进行荧光定量pcr反应，收集荧光信号，统计ct值，当ct值大于36时判定为阴性。6.根据权利要求5所述的一种以非诊断治疗为目的的同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的方法，其特征在于，所述pcr反应的反应体系为：支原体的方法，其特征在于，所述pcr反应的反应体系为：7.根据权利要求6所述的一种以非诊断治疗为目的的同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的方法，其特征在于，pcr反应程序为：

技术总结
本发明公开了一种同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的引物组和应用，属于鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体检测技术领域，包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的序列，将该序列应用于以上2种病原的检测，具有操作简便、检测效率高、灵敏度高和准确率高等特点，可广泛应用于相关疾病流行病学调查、相关药物和疫苗实验动物和靶动物模型临床应用效果评价等研究中鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的检测和鉴别，检测结果可靠。结果可靠。结果可靠。


技术研发人员：董志民 鄢明华 王利丽 田向学 张莉 李秀丽 朱琪 池晶晶
受保护的技术使用者：天津市农业科学院
技术研发日：2023.03.02
技术公布日：2023/7/20