一种侧柏转录因子PoWRKY2和编码基因PoWRKY2、重组质粒和重组菌及其应用的制作方法

一种侧柏转录因子powrky2和编码基因powrky2、重组质粒和重组菌及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学以及基因工程技术领域，具体涉及一种侧柏转录因子powrky2和编码基因powrky2、重组质粒和重组菌及其应用。


背景技术：

2.植物在生长发育中会受到多种非生物胁迫和生物胁迫。非生物胁迫包括温度胁迫、干旱胁迫、氧化胁迫、盐胁迫、营养元素的缺乏等，生物胁迫包括真菌、细菌、病毒、线虫等。通过常规方法定向培育具有抗性的植物新品种存在周期长、耗资大的问题。随着现代分子育种手段的发展，利用基因工程技术定向培育具有抗性的植物新品种具有重要的现实意义。
3.转录因子是通过识别特殊dna序列形成蛋白复合体调控基因表达的蛋白质分子。wrky转录因子家族是高等植物中最大的转录因子家族之一，其wrky蛋白结构域是由约60个氨基酸残基组成的dna结合结构域，n末端包含高度保守的wrkygqk序列，c末端包含c2h2型或c2hc型锌指蛋白结构。wrky转录因子家族成员通过wrky蛋白结构域和锌指蛋白结构域特异性结合靶基因的w-box序列来进行转录调控。有研究发现超表达拟南芥atwrky57基因增加了转基因植株的抗旱性；超表达黄瓜cswrky46基因增强了植物的抗寒性；超表达葡萄vvwrky11基因增强了植物的抵抗渗透胁迫能力；大豆gmwrky27基因和gmmyb174基因相互作用，抑制负调控胁迫响应因子的表达，提高了植物的抗盐和抗干旱能力。总之，wrky基因家族成员在植物生长发育、非生物胁迫和生物胁迫响应中起到重要调控作用。
4.侧柏(platycladusorientalis)具有长达几千年的寿命，在漫长的生命周期中，会受到多种非生物胁迫和生物胁迫，仍能够保持旺盛的生命力，说明侧柏耐具有适应性强、抗性强的特点。侧柏属于强耐盐植物，因此，发掘侧柏的优良抗盐基因，用于培育抗盐的植物新品种具有重要意义。目前具有抗盐胁迫功能的侧柏转录因子还未见报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种侧柏转录因子powrky2，该转录因子powrky2可以提高植物的抗盐胁迫能力。
6.本发明提供了一种侧柏转录因子powrky2，所述侧柏转录因子powrky2的氨基酸序列如seq id no:4所示。
7.本发明提供了上述技术方案所述侧柏转录因子powrky2的编码基因powrky2，所述编码基因powrky2的核苷酸序列如seq id no:3所示。
8.本发明提供了一种重组质粒，插入有上述技术方案所述的编码基因powrky2。
9.本发明提供了一种重组菌，包含上述技术方案所述的重组质粒。
10.本发明提供了上述技术方案所述的侧柏转录因子powrky2或上述技术方案所述的编码基因powrky2或者上述技术方案所述的重组质粒或上述技术方案所述的重组菌在提高
植物盐胁迫抗性中的应用。
11.优选的，所述应用包括如下步骤：将侧柏转录因子powrky2的编码基因powrky2转化入植物细胞，得到具有盐胁迫抗性的植物品种。
12.优选的，所述植物包括烟草。
13.优选的，所述提高植物盐胁迫抗性通过1)～5)中的一个或者几个方面实现：
14.1)提高植物叶片的脯氨酸含量；
15.2)提高植物叶片的可溶性蛋白含量；
16.3)提高植物叶片的sod的活性；
17.4)提高植物叶片的pod的活性；
18.5)提高植物叶片的cat的活性。
19.本发明的有益效果：本发明提供了一种侧柏转录因子powrky2，所述侧柏转录因子powrky2的氨基酸序列如seq id no:4所示。该侧柏转录因子powrky2由编码基因powrky2编码，该编码基因powrky2作为正调控因子参与了盐胁迫，可以提高植物的抗盐胁迫能力。wrky转录因子powrky2作为正调控因子参与了盐胁迫下植物种子的萌发，通过转基因及功能鉴定证实超量表达wrky转录因子powrky2的转基因种子在盐胁迫下萌发率提高。实施例结果表明：筛选得到的powrky2转基因烟草植株具有较强的耐盐能力，转基因种子在盐胁迫下萌发率提高。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
21.图1为powrky2基因pcr扩增片段。m：dl2000dnamarker；1：目的片段；
22.图2为powrky2基因大肠杆菌菌液pcr扩增片段。m：dl2000dnamarker；3～5：目的片段；1～2没有目的条带，说明该菌液是阴性，菌液质粒中没有目的片段插入；
23.图3为powrky2-pbi121表达载体转化大肠杆菌菌液pcr扩增片段。m：dl2000dnamarker；1～3：目的片段；
24.图4为powrky2-pbi121表达载体转化农杆菌菌液pcr扩增片段。m：dl2000dnamarker；1～8：目的片段；
25.图5为t0代转基因烟草gdna-pcr扩增片段。m：dl2000dnamarker；1-8：目的片段。
26.图1～图5片中所有的m，代表“dna分子量标准品”，都购买自takara(宝日医生物技术(北京)有限公司)，商品名称是dl2,000 dna marker，货号是3427q，该marker由2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp共6条双链dna片段组成。
具体实施方式
27.本发明提供了一种侧柏转录因子powrky2，所述侧柏转录因子powrky2的氨基酸序列如seq id no:4所示。
28.本发明提供了一种上述技术方案所述侧柏转录因子powrky2的编码基因powrky2，所述编码基因powrky2的核苷酸序列如seq id no:3所示。
29.本发明所述wrky转录因子编码基因powrky2，优选通过核苷酸序列如seq id no.1
所示的powrky2-cds-f上游引物和核苷酸序列如seq id no.2所示的powrky2-cds-r下游引物pcr扩增得到。在本发明中，编码基因powrky2的pcr扩增使用的体系每50μl优选包括：takara高保真扩增酶预混液primestarmaxpremix25μl，正向引物(引物自身浓度为20μm)1μl，反向引物(引物自身浓度为20μm)1μl，模板(侧柏cdna)1μl，无菌ddh2o补足至50μl。在本发明中，编码基因powrky2的pcr扩增的程序优选包括：98℃变性10s，58℃退火5s，72℃延伸10s，35个循环。
30.powrky2-cds-f上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示；powrky2-cds-r下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示。本发明提供了一种重组质粒，插入上述技术方案所述的编码基因powrky2。本发明对powrky2的重组质粒的构建方法没有特殊限定，采用常规的方法即可。本发明所述含有powrky2的重组质粒构建时可以采用本领域常规的植物表达载体。本发明所述含有powrky2的重组质粒的构建方法优选包括：利用侧柏转录因子powrky2的编码基因powrky2和植物表达载体构建重组载体；本发明所述植物载体优选为pbi121；本发明所述编码基因powrky2和植物表达载体pbi121优选用t4连接酶连接。本发明构建的重组质粒优选为powrky2-pbi121。
31.本发明提供了一种重组菌，包含上述技术方案所述的重组质粒。本发明优选将表达powrky2的powrky2-pbi121重组质粒转入农杆菌株中，得到重组菌。本发明所述转化优选利用电击法实现。本发明所述农杆菌株优选为根癌农杆菌gv3101。本发明优选利用卡那霉素和利福平筛选得到powrky2阳性转化菌株。本发明所述powrky2阳性转化菌株优选利用pcr扩增方法进行验证。本发明所述验证时优选利用转化菌株的菌液为模板，利用引物nptii-f和nptii-r进行pcr扩增，pcr扩增得到powrky2目的基因片段的即为powrky2阳性转化菌株。
32.在本发明中，powrky2阳性转化菌株的pcr扩增使用的体系优选包括：takara高保真扩增酶预混液primestarmaxpremix25μl，正向引物nptii-f(20μm)1μl，反向引物nptii-r(20μm)1μl，模板(菌液)1μl，无菌ddh2o补足至50μl。在本发明中，powrky2阳性转化菌株的pcr扩增的程序优选包括：98℃变性10s；55℃退火5s；72℃延伸10s；共35个循环。
33.本发明所述nptii-f正向引物的核苷酸序列如seq id no.5所示；nptii-r反向引物的核苷酸序列如seq id no.6所示。
34.本发明提供了上述技术方案所述的侧柏转录因子powrky2或上述技术方案所述的侧柏转录因子powrky2的编码基因powrky2或上述技术方案所述的重组质粒或上述技术方案所述的重组菌在提高植物盐胁迫抗性中的应用。
35.本发明所述应用优选包括如下步骤：将侧柏wrky转录因子powrky2的编码基因powrky2转化入植物细胞，得到具有盐胁迫抗性的植物品种。
36.本发明所述的转化入植物细胞的方式优选包括农杆菌转化法，优选利用农杆菌介导植物遗传转化。本发明所述农杆菌转化法优选包括：将表达powrky2的重组质粒转入农杆菌株中，得到重组菌；以待转化入植物为受体，重组菌配制成od
600
为0.8～1.2的侵染液侵染受体，筛选，得到具有盐胁迫抗性的植物品种。本发明所述od
600
优选为0.8～1.2，更优选为od
600
为1。
37.本发明所述植物优选包括烟草。本发明所述侵染优选农杆菌介导叶圆盘转化法完成。
genes during aging.forests 2019,10,393.https://doi.org/10.3390/f10050393)序列，设计引物进行基因全长扩增。引物设计参数：(1)引物的长度在20～30个碱基之间。(2)引物的gc含量为30％～70％。(3)引物中两个重复碱基的最大次数是4。(4)引物中单个碱基重复的最大次数是3。其中，powrky2 orf(开放阅读框)正向引物powrky2-cds-f如序列表中seq id no.1所示，反向引物powrky2-cds-r如seq id no.2所示，见表1。
51.表1扩增powrky2引物对的核苷酸序列
[0052][0053]
pcr反应体系如下：takara高保真扩增酶预混液primestar max premix 25μl，正向引物(引物自身浓度20μm)1μl，反向引物(引物自身浓度20μm)1μl，模板(侧柏cdna)1μl，无菌ddh2o补足至50μl。pcr反应程序为：98℃变性10s；55℃退火5s；72℃延伸10s；共35个循环。对pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后，回收目的基因powrky2片段。powrkt2基因pcr扩增片段见图1。根据图1可知，powrkt2基因的长度为1503bp。
[0054]
(2)目的基因与载体重组
[0055]
将目的基因powrky2片段连接于pmd18-t载体(takara，beijing，china)，连接反应：pcr产物4.5μl，pmd18-t载体0.5μl，solutioni5μl，16℃反应30min。
[0056]
(3)导入受体细胞及重组子筛选
[0057]
取2μl的pmd18-t-powrky2连接产物，转到100μl大肠杆菌dh5α感受态细胞(takara，beijing，china)，冰上融化后在42℃水浴锅中放置60s，冰上放置1min后加入500μlsoc液体培养基，在37℃200rpm摇床中培养1h，涂于含50mg/l氨苄青霉素的lb固体培养基平板上，37℃过夜培养至长出菌落。
[0058]
(4)目的基因powrky2测序
[0059]
挑取表达pmd18-t-powrky2的大肠杆菌单菌落于含50mg/l氨苄青霉素的lb液体培养基中培养，选取1μl菌液作为模板，用引物对powrky2-cds-f和powrky2-cds-r进行pcr扩增，powrky2基因大肠杆菌菌液pcr扩增片段见图2。图1和图2中，除了1503bp的条带之外，所有肉眼能够看到的弥散或模糊的区域，均不是目的条带，小于100bp的位置可能是引物二聚体，点样孔里的亮点，是因为该琼脂糖凝胶在制作完成，拔出梳子的时候，在点样孔造成了小问题，导致dna没有在电泳的作用下迁移出来，所以eb染色后，看到亮点。
[0060]
pcr反应体系如下：takara高保真扩增酶预混液primestarmaxpremix25μl，正向引物powrky2-cds-f(20μm)1μl，反向引物powrky2-cds-r(20μm)1μl，模板(菌液)1μl，无菌ddh2o补足至50μl。pcr反应程序为：98℃变性10s；55℃退火5s；72℃延伸10s；共35个循环。
[0061]
根据图2可知，3～5的菌液是阳性，相对应的质粒是pmd18-t-powrky2。
[0062]
将鉴定为目的基因powrky2阳性的克隆，送测序公司测序。扩增的目的基因powrky2片段，其核苷酸序列如seq id no.3所示，开放阅读框从第1位到1503位碱基，长1503bp，将此开放阅读框命名为侧柏wrky转录因子基因powrky2，其编码501个氨基酸，其氨基酸序列如seq id no.4所示，将该蛋白命名为侧柏wrky转录因子powrky2。
[0063]
powrky2的核苷酸序列如seq id no.3所示：atgacaactgaattctctgaaagacaagtgccagacaatactcgttcacgagatgctcctcttgttgttgctccactgcaatcagtttctttggagcagcaacaagagaggcagaccttgaacgagttttcagaagtaaaccaaagcgccctagttcctcagcatgtcatagagagacgctctgaggatggatacaactggcgcaagtatggtcaaaagcatgtcaaaggaagtgagtatcctcggagttactacaagtgcacacacccgagttgcccaactaagaagaaggttgaacgttctcttgatggccaagtaacagagatagtctataagggtgtccataaccatcctaaacctcaaccaactcgtcgaacgggagctgctcgtgtggctcatgaagaaggagagactaccgaaggctctgctgctactatcaaagtagaaggtgggtcttcttggggaagcaatttgaaagttaatgatgattcaaattactcacaaggctggaagagtgaaggccttgagagatcctcatcagcttctgttgttactgaactctcagatccatcctcgactccaccaggacaaaactctagtcatctggagtccgcaggtaccccggagcattcgtcgatttcagcaagtgaggaggatgatgcaaggacacaagctgacaaattcttgggagatgatgctgaagaagatgaacatgattcaaagcgcaggaggggcgaacaaagtgcgtctgatgtcataggggccaccagaactattcgggagcctcgggtggttgtgcaaacaaccagtgacattgatatactggatgatggataccgttggcgtaaatatgggcagaaagtggtgaaaggcaaccccaatccaaggagttactataaatgcacaaatgcaggatgcccagtaaggaagcacgttgagagagcctcacatgatgcaaaggcagtgattacgacttatgaaggaaaacacaatcatgatgtcccagctccacgaaacagtagccatagcaatgctggactagggaatgggccatctgtaccttctttgcagaataatgttgcatcctctacaaattccatgtctttgactggttctcagcctcagggaaccgtgtctcattttgataggcattgtgatcttagtaatgactatgcacagagcaattacatgtttggaagacttgcaaatgagagtttaaattctcaagacagaggtgtaggtgtttccaaccaaggtatggggatgggagcttctcttggagcttttggcctggacggcagacatgctgagagacaacaaacacaaggaggctccacagcattttcgatgcaggccaaccctgcaaatcagggatactcagctaccaatttcaatacttccatgcaaccttatcttggccatagtaatgagagagatattggacttgtcaggcctaaagaagaacagaaggataacttctactacgatggccctttgcaatga。
[0064]
powrky2蛋白seq id no.4序列：mttefserqvpdntrsrdaplvvaplqsvsleqqqerqtlnefsevnqsalvpqhvierrsedgynwrkygqkhvkgseyprsyykcthpscptkkkversldgqvteivykgvhnhpkpqptrrtgaarvaheegettegsaatikveggsswgsnlkvnddsnysqgwkseglersssasvvtelsdpsstppgqnsshlesagtpehssisaseeddartqadkflgddaeedehdskrrrgeqsasdvigatrtireprvvvqttsdidilddgyrwrkygqkvvkgnpnprsyykctnagcpvrkhverashdakavittyegkhnhdvpaprnsshsnaglgngpsvpslqnnvasstnsmsltgsqpqgtvshfdrhcdlsndyaqsnymfgrlaneslnsqdrgvgvsnqgmgmgaslgafgldgrhaerqqtqggstafsmqanpanqgysatnfntsmqpylghsnerdiglvrpkeeqkdnfyydgplq。
[0065]
实施例2侧柏powrky2基因超表达载体powrky2-pbi121的构建
[0066]
采用质粒dna小量提取试剂盒(takara，beijing，china)提取插入powrky2基因的大肠杆菌质粒pmd18-t-powrky2以及植物表达载体pbi121的质粒，取1μl用于琼脂糖凝胶电泳检测质粒的完整性，用nanodrop 8000分光光度计检测质粒的浓度和纯度。质粒dna的浓度在100～300ng/μl；质粒dna的纯度标准是同时满足两个条件：(1)od
260
/od
280
比值＝1.8；(2)od
260
/od
230
比值在2.0～2.2。
[0067]
用限制性内切酶xbaⅰ和sal
ⅰ‑
hf(neb，beijing，china)分别对质粒pmd18-t-powrky2和pbi121进行双酶切，反应体系如下：质粒10μl，10
×
rcutsmart buffer 5μl，xba
ꢀⅰꢀ
1μl，sal
ꢀⅰ‑
hf 1μl，无菌ddh2o补足至50μl，置于37℃反应2h；通过琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行检测，利用琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒(takara，beijing，china)对powrky2片
段和pbi121载体大片段进行凝胶回收，取1μl用于琼脂糖凝胶电泳检测凝胶回收产物的大小，用nanodrop 8000分光光度计检测回收产物的浓度和纯度。凝胶回收产物dna的浓度在20～40ng/μl；凝胶回收产物dna的纯度标准是同时满足两个条件：(1)od
260
/od
280
比值为1.8；(2)od
260
/od
230
比值在2.0～2.2。
[0068]
利用t4 dna ligase(neb，beijing，china)，将回收的powrky2片段和pbi121载体片段进行连接反应，反应体系如下：pbi121载体片段6μl，powrky2片段6μl，10
×
t4dna ligase buffer 2μl，t4dna ligase 1μl，无菌ddh2o补足至20μl，置于室温反应10min。
[0069]
取2μlpowrky2-pbi121连接产物，转到100μl大肠杆菌dh5α感受态细胞(takara，beijing，china)，冰上融化后在42℃水浴锅中放置60s，冰上放置1min后加入500μl soc液体培养基，在37℃200rpm摇床中培养1h，涂于含50mg/l卡那霉素的lb固体培养基平板上，37℃过夜培养至长出菌落。
[0070]
用植物表达载体pbi121上的选择标记基因nptii序列设计的正向引物nptii-f如序列表中seq id no.5所示(seq id no.5：tgctcctgccgagaaagtat)，反向引物nptii-r如seq id no.6(seq idno.6：aatatcacgggtagccaacg)所示。挑取单菌落于含50mg/l卡那霉素的lb液体培养基中培养，37℃200rpm摇床中培养8h，选取1μl菌液作为模板，用引物nptii-f和nptii-r进行pcr扩增。
[0071]
pcr反应体系如下：takara高保真扩增酶预混液primestarmaxpremix25μl，正向引物nptii-f(20μm)1μl，反向引物nptii-r(20μm)1μl，模板(菌液)1μl，无菌ddh2o补足至50μl。pcr反应程序为：98℃变性10s；55℃退火5s；72℃延伸10s；共35个循环。
[0072]
pbi121-powrky2表达载体转化大肠杆菌菌液pcr扩增片段见图3。根据图3可知，1～3的菌液是阳性，相对应的质粒是pbi121-powrky2。
[0073]
将鉴定为阳性的克隆，送测序公司测序。将基因序列正确的阳性克隆的菌液加入甘油后置于-80℃超低温冰箱备用。
[0074]
实施例3农杆菌介导的植物遗传转化以及转基因植物筛选
[0075]
(1)农杆菌介导的植物遗传转化
[0076]
采用质粒dna小量提取试剂盒(takara，beijing，china)提取大肠杆菌质粒powrky2-pbi121，取1μl用于琼脂糖凝胶电泳检测质粒的完整性，用nanodrop8000分光光度计检测质粒的浓度和纯度。质粒dna的浓度在100～300ng/μl；质粒dna的纯度标准是同时满足两个条件：(1)od
260
/od
280
比值为1.8；(2)od
260
/od
230
比值在2.0～2.2。
[0077]
通过电击法，将浓度和纯度合格的质粒powrky2-pbi121转入根癌农杆菌gv3101。操作步骤如下：将-80℃超低温冰箱中保存的gv3101感受态(50μl)取出，置于冰上孵育20min至融化，加入1μl质粒powrky2-pbi121，混合后转移到电击转化杯中，进行电击转化(2.5kv)，将800μl液体lb培养基加入到转化杯中，用移液器吸打混匀后，在温度为28℃，转速为200rpm摇床中培养4h，涂于含50mg/l卡那霉素和50mg/l利福平的lb固体培养基平板上，28℃过夜培养至长出菌落。挑取单菌落于含50mg/l卡那霉素和50mg/l利福平的lb液体培养基中培养，28℃200rpm摇床中培养16h，选取1μl菌液作为模板，用引物nptii-f和nptii-r进行pcr扩增，
[0078]
pcr反应体系如下：takara高保真扩增酶预混液primestarmaxpremix25μl，正向引物nptii-f(20μm)1μl，反向引物nptii-r(20μm)1μl，模板(菌液)1μl，无菌ddh2o补足至50μ
l。pcr反应程序为：98℃变性10s；55℃退火5s；72℃延伸10s；共35个循环。
[0079]
pbi121-polwrkt2表达载体转化农杆菌菌液pcr扩增片段见图4，根据图4可知，1～8的菌液是阳性，相对应的质粒是pbi121-powrky2。
[0080]
将鉴定为powrky2-pbi121阳性的克隆菌液加入甘油后置于-80℃超低温冰箱备用。
[0081]
图1和图2中检测的目的基因powrky2的pcr产物，是powrky2的cds全长，即1503bp。而图3和图4检测的pbi121-powrky2的pcr产物是标记基因nptii的一段364bp的序列，下面seq id no.7是nptii的全长序列，下划线区域是图3和图4、图5检测的364bp的pcr产物的区域。
[0082]
seq id no.7序列：atgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgatgatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctga。
[0083]
(2)转基因植物筛选
[0084]
本实验的转基因受体是烟草(nicotianatabacumcv.sr1)，在超净工作台上，将烟草种子用无水乙醇浸泡1min，然后用70％乙醇浸泡10min，用无菌水漂洗3次后，播种于1/2ms培养基上，置于光照培养箱中培养(温度为：23℃光照培养/21℃黑暗培养，光照时间为：16h光照培养/8h黑暗培养)。烟草种子发芽后，每个月用1/2ms培养基继代一次，培养21d获得烟草叶。
[0085]
取100μl保存于-80℃超低温冰箱中的含有powrky2-pbi121质粒的农杆菌菌液，加入到含有50mg/l卡那霉素和50mg/l利福平的lb液体培养基中，28℃200rpm摇床中培养至培养液的od
600
＝1.0，利用含有powrky2-pbi121质粒的农杆菌培养液对烟草叶圆盘进行侵染，烟草叶圆盘进行侵染的具体条件为：将农杆菌培养液倒进50ml离心管(无菌)，放入台式离心机，温度为4℃，离心转速为6000rpm，离心时间15min。在超净工作台上倒掉上清液，收集菌体。用农杆菌重悬溶液(ms培养基为基础培养基，添加蔗糖30g/l，高压灭菌后，加入0.02μm乙酰丁香酮溶液)，将菌体重悬，倒入三角瓶中，放入摇床，温度为28℃，温度为200rpm，时间1h。在超净工作台上，将切成一平方厘米大小的烟草叶片放入装有重悬菌体的三角瓶中，放入摇床，28℃，200rpm，1h。把三角瓶从摇床中取出，将每个叶片从重悬菌体中夹到滤纸上，让滤纸吸干所有叶片小块上的菌液，在滤纸上放置2min，既能让滤纸吸干菌液，又不能让叶片失水或太干。所有烟草叶片在黑暗中共培养2d，共培养培养基以ms培养基为基本培养基，还仅再添加1mg/l6-ba。
[0086]
共培养后，将烟草叶圆盘用含有400mg/l特美汀的无菌水冲洗3次后进行不定芽筛
选诱导，不定芽筛选诱导培养基以ms培养基为基本培养基，还仅再添加2mg/l6-ba、100mg/l卡那霉素和200mg/l特美汀。培养30d后，将抗性芽切下后进行生根诱导，生根诱导培养基以1/2ms培养基为基本培养基，还仅再添加50mg/l卡那霉素和200mg/l特美汀，得到t0代生根烟草。
[0087]
将t0代生根烟草从组培瓶转移到营养土中，置于人工植物生长培养室中培养(温度为：25℃光照培养/23℃黑暗培养，光照时间为：16h光照培养/8h黑暗培养)，烟草植株放在一个塑料托盘上，每周周二和周五施加hoagland营养液1l(每周两次，周二和周五上午9点15分进行)，每次将1lhoagland营养液倒进塑料托盘，静置1h，然后将剩余的没有被吸收的hoagland营养液导出。
[0088]
采用植物组织材料基因组dna小量纯化试剂盒(takaraminibestplant genomicdnaextractionkit，货号：9768)提取t0代生根烟草叶片的基因组dna，取1μl用于琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna的完整性，用nanodrop8000分光光度计检测基因组dna的浓度和纯度。基因组dna的浓度在50～150ng/μl；基因组dna的纯度标准是同时满足两个条件：(1)od
260
/od
280
比值＝1.8；(2)od
260
/od
230
比值在2.0～2.2之间。
[0089]
选取浓度和纯度合格的t0代生根烟草叶片基因组dna1μl作为模板，用引物nptii-f和nptii-r进行pcr验证。t0代转基因烟草gdna-pcr扩增片段见图5。根据图5可知1～8的基因组中存在质粒pbi121-powrky2，即1～8是转基因阳性烟草植株。
[0090]
t0代生根烟草培养直至种子成熟，将收集的烟草种子用无水乙醇浸泡1min，然后用70％乙醇浸泡10min，用无菌水漂洗3次后，播种于含100mg/l卡那霉素的ms培养基上，置于光照培养箱中培养(温度为：23℃光照培养/21℃黑暗培养，光照时间为：16h光照培养/8h黑暗培养)，从3个t1代转基因株系(line3、line5、line8，line3、line5、line8是图5中的泳道3、泳道5、泳道8检测的t1代转基因烟草植株，下同)和野生型烟草(nicotiana tabacum cv.sr1)中各选取12个单株移栽到基质(珍珠岩和蛭石体积比1：1)中进行培养，用于后续试验。
[0091]
(3)转基因植株耐盐性分析
[0092]
分别从3个t1代转基因株系(12棵line3、12棵line5、12棵line8)和野生型烟草(nicotiana tabacum cv.sr1)中各选取12棵，共48棵烟草植株置于光照培养箱中培养，每隔2d施加hoagland营养液。8周后，从3个t1代转基因株系各选取6个line3单株、6个line5单株、6个line8单株和野生型6个单株，每隔2d，每棵烟草施用氯化钠浓度为300mmol/l的hoagland营养液100ml进行盐胁迫处理；剩余24棵烟草植株，每隔2d，每棵施加hoagland营养液100ml。在进行盐胁迫处理的第14天，根据叶间隔期指数(leaf plastochron index，lpi)从每棵烟草植株中选取3片成熟叶片(lpi＝5～7，lpi0的叶片长度设定为小于2cm)，进行叶片叶绿素、脯氨酸、可溶性蛋白的含量和sod、pod、cat的活性，结果如表2-1和2-2所示。结果表明，叶片叶绿素、脯氨酸、可溶性蛋白的含量和sod、pod、cat的活性显著提高，转基因烟草植株具有较强的耐盐的能力。
[0093]
表2-1转基因烟草和野生型烟草叶片生理指标测定结果
[0094]
[0095][0096]
注：**表示在每一组中，转基因烟草株系与野生型之间极显著(p值《0.01)差异。
[0097]
表2-2转基因烟草和野生型烟草生理指标测定
[0098][0099]
注：**表示在每一组中，转基因烟草株系与野生型之间极显著(p值《0.01)差异。
[0100]
(4)转基因烟草种子的盐胁迫处理下的萌发试验
[0101]
从3个t1代转基因株系(line3、line5、line8)在人工植物生长培养室中培养(温度为：25℃光照培养/23℃黑暗培养，光照时间为：16h光照培养/8h黑暗培养)，每周周二和周五施加hoagland营养液(施加方式同t0代)，最后，收集成熟的种子。从t2代转基因株系(line3、line5、line8)和野生型烟草(nicotiana tabacum cv.sr1)中各选取100粒种子，用无水乙醇浸泡1min，然后用70％乙醇浸泡10min，用无菌水漂洗3次后，播种于氯化钠浓度为0，100，200，300mmol/l的ms培养基中，置于光照培养箱中培养(温度为：23℃光照培养/21℃黑暗培养，光照时间为：16h光照培养/8h黑暗培养)，实验设4次生物学重复。种子的发芽率见表3，line3、line5、line8的t2代烟草转基因种子在盐胁迫下萌发率提高。
[0102]
表3烟草种子发芽率
[0103][0104]
注：**表示在每一组中，转基因烟草株系与野生型之间极显著(p值《0.01)差异。
[0105]
综上，wrky转录因子powrky2或其编码基因在抗盐作物品种选育过程中具有重要的理论意义及应用价值，能够获得耐盐能力较强的转基因烟草植株，烟草转基因种子在盐胁迫下萌发率提高。
[0106]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种侧柏转录因子powrky2，其特征在于，所述侧柏转录因子powrky2的氨基酸序列如seq id no:4所示。2.权利要求1所述侧柏转录因子powrky2的编码基因powrky2，其特征在于，所述编码基因powrky2的核苷酸序列如seq id no:3所示。3.一种重组质粒，其特征在于，插入有权利要求2所述的编码基因powrky2。4.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求3所述的重组质粒。5.权利要求1所述的侧柏转录因子powrky2或权利要求2所述的编码基因powrky2或权利要求3所述的重组质粒或权利要求4所述的重组菌在提高植物盐胁迫抗性中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：将侧柏转录因子powrky2的编码基因powrky2转化入植物细胞，得到具有盐胁迫抗性的植物品种。7.根据权利要求5的应用，其特征在于，所述植物包括烟草。8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述提高植物盐胁迫抗性通过1)～5)中的一个或者几个方面实现：1)提高植物叶片的脯氨酸含量；2)提高植物叶片的可溶性蛋白含量；3)提高植物叶片的sod的活性；4)提高植物叶片的pod的活性；5)提高植物叶片的cat的活性。

技术总结
本发明属于分子生物学以及基因工程技术领域，具体涉及一种侧柏WRKY转录因子PoWRKY2、侧柏转录因子的编码基因PoWRKY2、重组质粒和重组菌及其应用。本发明提供了一种侧柏转录因子PoWRKY2，所述侧柏转录因子PoWRKY2的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。本发明的侧柏转录因子PoWRKY2作为正调控因子参与了盐胁迫，可以提高植物的抗盐胁迫能力。实施例结果表明：筛选得到的PoWRKY2转基因烟草植株具有较强的耐盐能力。盐能力。盐能力。


技术研发人员：常二梅 郭伟 董遥 刘建锋 张利 贾子瑞 赵秀莲
受保护的技术使用者：中国林业科学研究院林业研究所
技术研发日：2022.12.19
技术公布日：2023/7/19