一种氧化钼纳米线复合骨植入体及其制备方法

1.本发明涉及生物医用材料领域，具体而言，涉及一种氧化钼纳米线复合骨植入体及其制备方法。
2.

背景技术：

3.3d打印技术通过计算机绘制三维模型，将粉末状的金属、陶瓷、塑料、砂等作为“墨水”，进行逐层打印来构造物体。将该技术用于骨缺损修复，不仅可以规避传统骨移植存在的一些弊端，而且通过个性化定制可得到与骨或牙缺损部位相匹配的形态，针对生物植入体内部所需的多孔结构也可以实现孔隙大小和孔隙率的设计，这有利于养分的运输和细胞组织的生长，对骨或牙缺损修复具有重要意义。
4.随着医疗水平的提高，人们对口腔问题越来越重视，种植牙以手术风险小、安全可靠、美观等众多优点得到人们的青睐，是目前牙缺损最佳的修复方式。种植牙主要是将人工牙体植入到牙槽骨，使其和牙槽骨相结合，从而得到修复牙齿的效果。这就要求种植体不仅需要有良好的力学性能，还必须有优良的生物活性。
5.生物活性玻璃是一类能对机体组织进行修复、替代与再生、具有能使组织和材料之间形成键合作用的材料，由有sio2、cao和p2o5等基本成分组成。其降解产物能够促进生长因子的生成、促进细胞的繁衍、增强成骨细胞的基因表达和骨组织的生长。因此，将其制备成种植体可显著提高种植体的生物活性。
6.但是，种植体植入后常出现细菌感染这一棘手问题，并且感染原因一般比较复杂，从而导致种植体松动和种植失败，给病人带来身体上的痛苦和经济上的损失。因此，如何使种植体表面具有抗菌性能以预防细菌感染具有重大的临床意义。
7.化学动力学疗法（chemodynamic therapy, cdt）依靠芬顿或类芬顿反应将过氧化氢（hydrogen peroxide, h2o2）转化为毒性羟基自由基（hydroxyl radical,
·
oh）能破坏细菌中的生物分子（如dna和蛋白质）来达到抗菌的目的，是一种很有前途的细菌感染治疗方式。遗憾的是，受到相对较低的
·
oh产率和对高浓度过氧化氢的需求，单模态cdt抗菌途径难以彻底清除细菌。为了克服这个问题，cdt通常与光热疗法（photothermal therapy, ptt）相结合，其中温度升高可以增强cdt效果。因此，近红外光热增强cdt抗菌治疗将是提高细菌感染治疗效率的一种有希望的策略。而选择一种既有ppt又具有cdt能力的纳米材料来抗菌是至关重要的。
8.

技术实现要素：

9.针对上述问题，本发明的目的在于提供一种氧化钼纳米线复合骨植入体，用作骨科或牙科植入物，植入主体表面负载氧化钼纳米线，能够治疗种植牙过程中发生的细菌感染，且在治疗牙周致病菌的同时还可以修复牙缺损。
10.本发明的目的还在于提供上述氧化钼纳米线复合骨植入体的制备方法，简单方便，且成本低廉，可用于大规模生产。
11.本发明是这样实现的：本发明首先提供一种氧化钼纳米线复合骨植入体，包括植入主体以及负载于所述植入主体上的氧化钼纳米线，其中，氧化钼纳米线具有优异的近红外光热转换能力，在h2o2的存在下通过芬顿反应产生
·
oh，通过罗素机制（russell mechanism）产生单线态氧（1o2），并且热可以增强
·
oh和1o2的产生，且钼是机体必需的一种微量元素，作为亚硫酸盐氧化酶 （so）和黄嘌呤氧化酶 （xo）的催化中心。因此，在植入主体表面负载氧化钼纳米线所形成的氧化钼纳米线复合骨植入体，既能发挥光热增强的毒性活性氧杀死种植牙过程中的细菌，降解后又能修复缺损的牙周组织，特别适用于牙周缺损的治疗。
12.具体地，所述植入主体的材料为生物活性玻璃，由3d打印技术制备得到。
13.具体地，所述氧化钼纳米线与植入主体的质量比例为3~30：80，进一步优选为15~30：80。
14.另一方面，本发明还提供上述氧化钼纳米线复合骨植入体的制备方法，包括如下步骤：步骤1、采用水热法制备氧化钼纳米线；步骤2、通过3d打印技术制备得到植入主体；步骤3、将制得的氧化钼纳米线加入溶剂中，制得氧化钼纳米线分散液，将所述植入主体浸入所述氧化钼纳米线分散液中，所述植入主体负载氧化钼纳米线，烘干后，得到氧化钼纳米线复合骨植入体。
15.具体地，所述步骤1具体为；将123.5 mg四水合钼酸铵和300 mg甘氨酸溶于20 ml去离子水，之后滴加0.45 ml盐酸并剧烈搅拌，盐酸浓度为36 wt%，形成均匀的牛奶状溶液，移入反应釜中180 ℃加热12 h，冷却后，所得的沉淀经离心、洗涤、冻干成粉末，得到氧化钼纳米线。
16.具体地，所述步骤1中离心转速为：先500 rpm/min，10 min去除白色沉淀；再20000 rpm/min离心洗涤两次，每次20 min；最后所得蓝色溶液用液氮冷冻10 min，移入真空冷冻干燥机中干燥成粉末。
17.具体地，所述步骤2具体为：将生物活性玻璃粉末与聚乙烯醇（pva）溶胶混匀，得到打印墨水；通过挤出式3d打印机打印出植入坯体，经高温煅烧以去除聚乙烯醇。
18.具体地，所述聚乙烯醇溶胶的制备方法为：将聚乙烯醇粉末按照10 wt%的浓度溶于去离子水中，加热到90 ℃，再以转速200~400 rpm/min搅拌10~12 h，得到聚乙烯醇溶胶。
19.具体地，所述步骤2中，生物活性玻璃粉末与聚乙烯醇溶胶的质量比为1.2~1.3:1；3d打印机的打印参数为：压力0.4~0.6 mpa，喷头移动速度2~5 mm/s，煅烧温度为1060 ℃，煅烧时间为3~4 h。
20.具体地，所述步骤3具体为：所述步骤4具体为：将植入主体在氧化钼纳米线分散液中浸泡两次以上，氧化钼纳米线分散液的浓度为2~50 mg/ml，进一步优选为 15~50mg/ml，每次浸泡后在烘箱中干燥，每次浸泡时间为10~30 min，每次烘干时间为10~30 min，获得氧化钼纳米线复合骨植入体。
21.本发明具有以下有益效果：
（1）本发明的氧化钼纳米线复合骨植入体，包括植入主体及负载于植入主体表面的氧化钼纳米线，其中氧化钼纳米线具有优异的光热转化能力和产生羟基自由基（
·
oh）和单线态氧（1o2）两种活性氧（ros）的能力，光热可增强ros产生，来杀死种植牙过程中感染的细菌，且元素钼可以刺激骨早期发育，本发明的氧化钼纳米线复合骨植入体具有良好的生物相容性，可降解性，能促进骨髓间充质干细胞（rbmscs）增殖和分化，尤其适用于修复缺损的牙周组织。
22.（2）本发明氧化钼纳米线复合骨植入体的制备方法，氧化钼纳米线及植入主体的制备过程简单易操作，制备条件温和，成本低，适合批量生产，且植入体可根据需要设计成不同的形状和尺寸，满足不同的需求，所制备的氧化钼纳米线复合骨植入体可广泛用于骨科或牙科植入物。
23.附图说明
24.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
25.图1为本发明制备例制得的氧化钼纳米线的扫描电镜（sem）照片和透射电镜（tem）照片；图2为本发明制备例制得的氧化钼纳米线的x射线衍射（xrd）谱图；图3为测试氧化钼纳米线在不同条件下产生1o2的紫外-可见光吸收光谱（uv-vis）图及相应电子自旋共振（esr）图；图4为测试氧化钼纳米线在不同条件下产生
·
oh的紫外-可见光吸收光谱（uv-vis）图及相应电子自旋共振（esr）图；图5为不同浓度氧化钼纳米线的uv-vis-nir图；图6为实施例1-3制备的复合植入体的数码照片图及sem照片；图7为实施例1-3制备的复合植入体的光热升温曲线图；图8为本发明氧化钼纳米线复合骨植入体促进rbmscs增长的测试结果图；图9为通过western blot分析本发明氧化钼纳米线复合骨植入体促进rbmscs骨再生相关蛋白（col1、opn、bmp2和runx2）表达的结果图；图10为通过qrt-pcr分析本发明氧化钼纳米线复合骨植入体促进rbmscs骨再生相关基因（col1、opn、bmp2和runx2）表达的结果图；图11为通过h&e、masson、ocn和bmp2切片染色评估本发明氧化钼纳米线复合骨植入体的牙缺损再生水平的结果图；图12通过定量分析bv/tv、bmd和tot来评估本发明氧化钼纳米线复合骨植入体的牙缺损再生水平的结果图。
26.具体实施方式
diphenylisobenzofuran, dpbf）（20 μg/ml）、双氧水（h2o2，10 mm）和moo（20 μg/ml）共 2 ml，在2、5、8、20 和30 min的时间点，用紫外分光光度计记录dpbf在410nm的吸收峰变化。
37.结果如图3a所示，图3a表明在含有moo、h2o2和dpbf的水溶液中，随着时间的增加，dpbf在410 nm处的吸收峰逐渐下降，证明moo纳米线具有产1o2的能力。
38.②
电子自旋共振法（electron spin resonance, esr）检测：去离子水包含20
ꢀµ
l moo （100
ꢀµ
g/ml），10
ꢀµ
l四甲基哌啶酮 （2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidone,temp）（1 m）和10
ꢀµ
l h2o2（20 mm）立刻放入37
ꢀ°
c水浴孵育3 min，进行esr测试。
39.结果如图3b所示，图3b通过esr测试进一步证明moo可以产生1o2，并且在水浴加热可促进1o2产生。
40.（4）体外
·
oh检测：
①
紫外可见光吸收光谱法检测：取三个比色皿，每个里添加去离子水包含的3,3',5,5'-四甲基联苯胺（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,tmb）（100
ꢀµ
m），h2o2（10 mm）和不同浓度的moo（20、40和80 μg/ml）共2 ml，之后用紫外分光光度计记录tmb在650 nm 处的吸收峰变化。
41.图4a可以看出在只有tmb和h2o2的组在650 nm处没有峰出现，而在加了moo的组在650nm处均有峰出现，峰的高度随着moo的浓度增大而增高，表明其可催化h2o2产生了
•
oh。
42.②
电子自旋共振法检测：100
ꢀµ
l溶液包含moo 100
µ
g/ml）和 h2o2（20 mm），之后添加4
ꢀµ
l dmpo 1 m），立刻放入37
ꢀ°
c水浴孵育3 min，进行esr测试。
43.结果如图4b所示，图4b通过esr测试进一步证明moo可以产生
·
oh，并且在水浴加热可促进
·
oh产生，表明其催化h2o2产生了大量
•
oh，具有极强的cdt效应。因此，moo催化h2o2产生的两种ros可以用于后续的抗菌治疗。
44.（5）紫外-可见-近红外光（uv-vis-nir）吸收检测：将制备的moo粉末溶于去离子水，先用电感耦合等离子体原子发射光谱法（inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry, icp-aes）定量，再稀释成不同浓度（1、2、4和8
µ
g/ml ）用紫外分光光度计检测其在300~1050 nm波长范围的光吸收。
45.结果如图5所示，表明所制备的moo在808 nm处具有很好的光吸收作用，可将光转化成热用于抗菌治疗。
46.制备例2：植入主体的制备聚乙烯醇（pva）溶于去离子水，浓度为10 wt%。在90 ℃下，以200~400 rpm/min搅拌10~12 h，得到溶胶。生物活性玻璃粉末与pva溶胶按照质量比1.28：1混匀作为“墨水”；装入打印桶中。3d打印机参数设置：压力0.5 mpa，喷头移动速度3mm/s，孔隙200 μm，直径5mm，层高0.33 μm，层数6，打印出植入坯体，将植入坯体在1060℃下煅烧3 h以去除有机物，即得植入主体，记为毛坯。
47.实施例1：氧化钼纳米线复合骨植入体（简称复合植入体）的制备将制备得到的植入主体浸泡在5 mg/ml 氧化钼纳米线水溶液20min，然后 40 ℃烘干20 min，重复浸泡及烘干步骤5次，即得到负载氧化钼纳米线的复合植入体，记为5复合植入体。
48.称量植入主体及负载氧化钼纳米线后的重量，通过质量差的方法计算得到5复合
植入体中氧化钼纳米线与植入主体的质量比为0.044：1。
49.实施例2: 氧化钼纳米线复合骨植入体的制备与上述实施例1相比，其区别仅在于：将制备得到的植入主体浸泡在10 mg/ml 氧化钼纳米线水溶液中，所获得氧化钼纳米线复合骨植入体记为10复合植入体。
50.称量植入主体及负载氧化钼纳米线后的重量，通过质量差的方法计算得到10复合植入体中氧化钼纳米线与植入主体的质量比为0.192：1。
51.实施例3: 氧化钼纳米线复合骨植入体的制备与上述实施例1相比，其区别仅在于：将制备得到的植入主体浸泡在15 mg/ml 氧化钼纳米线水溶液中，所获得氧化钼纳米线复合骨植入体记为15-复合植入体。
52.称量植入主体及负载氧化钼纳米线后的重量，通过质量差的方法计算得到15复合植入体中氧化钼纳米线与植入主体的质量比为0.345：1。
53.性能测试：氧化钼纳米线复合骨植入体的表征（1）复合植入体形貌检测：结果如图6所示，由图6示出所制备的毛坯和复合植入体的形貌，可以看出，毛坯是白色的，有规则的孔隙。左边数码照片从上到下显示随着moo浓度增大，复合植入体表面颜色越深。右边不同倍数的sem照片显示出随着涂覆的moo浓度增大，复合植入体的表面越光滑。
54.（2）复合植入体光热性能检测：808 nm激光器（1.5 w/cm2）分别照射毛坯、5复合植入体、10复合植入体和15复合植入体5 min，同时光热相机记录温度变化。之后，将15复合植入体放在808 nm激光器（1.5 w/cm2）下，通过调整不同的功率密度（0.5、0.75、1.0和1.25 w/cm2）照射5 min，同时光热相机记录温度变化。
55.毛坯和复合植入体的光热性能评估结果参见图7，图7a表明经808 nm激光器照射5 min（1.25 w/cm2）后，毛坯温度几乎没有变化，而5复合植入体、10复合植入体和15复合植入体的温度依次升高；图7b表明15复合植入体经808 nm激光器照射5 min，随着功率密度增大，温度升得越高。由此表明复合植入体具有很好的光热抗菌潜力。（3）体外评估复合植入体促进rbmsc s增殖和分化：
①
从sd大鼠提取的骨髓间充质干细胞 (rbmscs) 用添加了10%胎牛血清（fbs）和1% 抗生素的dmem/f12 培养基培养，放在含5% co2的 37
ꢁ°
c培养箱中孵育。rbmscs (1
ꢀ×ꢀ
105) 分别与毛坯和15复合植入体在48孔板培养，并设置对照组，分别在第1、3、5和7天用cell counting kit-8（cck-8）试剂检测细胞增值情况。
56.毛坯和复合植入体体外促进rbmsc增殖和分化的cck-8结果参见图8。在7天中，与对照组相比，毛坯和复合植入体都可以促进rbmscs增殖，其中复合植入体促进rbmscs增殖的效果更好。
②
western blot分析：分别与毛坯和复合植入体孵育后的rbmscs用细胞裂解液（beyotime biotechnology, china）处理提取蛋白，总蛋白浓度用bca试剂盒（beyotime biotechnology, china）检测。之后，蛋白与抗鼠一抗1型骨胶原（col1），形态发生蛋白2（bmp2），骨钙素（opn）和runt相关转录因子2（runx2）和 β-actin孵育。所有条带的灰度用
image j软件分析。
57.复合植入体体外促进rbmsc增殖和分化的western blot结果参见图9。与对照组相比，毛坯和复合植入体这两种植入体都可以使骨再生相关蛋白（coli、bmp2、opn和runx2）表达量上调，其中复合植入体使这几种蛋白表达量上调的更明显。
58.③
qrt-pcr表达：通过实时定量聚合酶链式反应（qrt-pcr）来检测骨再生相关基因的mrna转录水平。毛坯和复合植入体分别处理后的rbmscs，用于检测骨再生基因的mrna表达，包括col1、opn、bmp2和runx2。经过14天的骨再生诱导，从trizol 试剂处理后的rbmscs中提取总rna之后再转录成互补dna（cdna）。
59.复合植入体体外促进rbmsc增殖和分化的qrt-pcr结果参见图10。与对照组相比，毛坯和复合植入体都可以使骨再生相关基因（coli、bmp2、opn和runx2）表达量上调，其中复合植入体使这几种基因表达量上调的更明显。
60.（4）体内评估复合植入体促进牙周骨缺损修复将牙缺损建模成功的sd大鼠麻醉，随机分为3组，每组3只：对照、毛坯和复合植入体。将毛坯和复合植入体放入缺损部位并固定。分别在第3和第6周时处死，使用ctvox软件重建三维图像，测定骨体积/总体积（bv/tv）、骨矿化密度（bmd）和总空隙度（tot），收集牙周组织用于组织学分析：h&e、masson、ocn和bmp2。组织切片使用olympus vs120（olympus company, japan）全扫。
61.不同处理组体内促进牙周骨缺损修复的组织学染色切片结果参见图11。h&e染色结果显示即使到了第6周对照组也只有小部分新生骨基质，毛坯组的新生骨组织比对照多些，而复合植入体组有大量成熟的骨组织，几乎覆盖了缺损部位。masson染色表明对照组没有明显的骨胶原纤维生成，毛坯组有很多不成熟的骨胶原纤维。而复合植入体组有大面积的成熟骨胶原。ocn和bmp2的免疫组织化学染色结果表明毛坯组和复合植入体组有更高的骨再生相关蛋白表达。
62.不同处理组体内促进牙周骨缺损修复的bv/tv、bmd和tot结果参见图12，结果表明复合植入体组有着最好的牙缺损修复效果。
63.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种氧化钼纳米线复合骨植入体，其特征在于，包括植入主体以及负载于所述植入主体上的氧化钼纳米线。2.根据权利要求1所述的氧化钼纳米线复合骨植入体，其特征在于，所述植入主体的材料为生物活性玻璃，由3d打印技术制备得到。3.根据权利要求2所述的氧化钼纳米线复合骨植入体，其特征在于，所述氧化钼纳米线与植入主体的质量比例为3~30：80。4.一种如权利要求1所述的氧化钼纳米线复合骨植入体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、采用水热法制备氧化钼纳米线；步骤2、通过3d打印技术制备得到植入主体；步骤3、将制得的氧化钼纳米线加入溶剂中，制得氧化钼纳米线分散液，将所述植入主体浸入所述氧化钼纳米线分散液中，所述植入主体负载氧化钼纳米线，烘干后，得到氧化钼纳米线复合骨植入体。5.根据权利要求4所述的氧化钼纳米线复合骨植入体的制备方法，其特征在于，所述步骤1具体为；将123.5 mg四水合钼酸铵和300 mg甘氨酸溶于20 ml去离子水，之后滴加0.45 ml盐酸并剧烈搅拌，盐酸浓度为36 wt%，形成均匀的牛奶状溶液，移入反应釜中180 ℃加热12 h，冷却后，所得的沉淀经离心、洗涤、冻干成粉末，得到氧化钼纳米线。6.根据权利要求5所述的氧化钼纳米线复合骨植入体的制备方法，其特征在于，所述步骤1中离心转速为：先500 rpm/min，10 min去除白色沉淀；再20000 rpm/min离心洗涤两次，每次20 min；最后所得蓝色溶液用液氮冷冻10 min，移入真空冷冻干燥机中干燥成粉末。7.根据权利要求4所述的氧化钼纳米线复合骨植入体的制备方法，其特征在于，所述步骤2具体为：将生物活性玻璃粉末与聚乙烯醇溶胶混匀，得到打印墨水；通过挤出式3d打印机打印出植入坯体，经高温煅烧以去除聚乙烯醇。8.根据权利要求7所述的氧化钼纳米线复合骨植入体的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯醇溶胶的制备方法为：将聚乙烯醇粉末按照10 wt%的浓度溶于去离子水中，加热到90 ℃，再以转速200~400 rpm/min搅拌10~12 h，得到聚乙烯醇溶胶；所述步骤2中，生物活性玻璃粉末与聚乙烯醇溶胶的质量比为1.2~1.3:1；3d打印机的打印参数为：压力0.4~0.6 mpa，喷头移动速度2~5 mm/s，煅烧温度为1060 ℃，煅烧时间为3~4 h。9.根据权利要求4所述的氧化钼纳米线复合骨植入体的制备方法，其特征在于，所述步骤3具体为：将植入主体在氧化钼纳米线分散液中浸泡两次以上，氧化钼纳米线分散液的浓度为2~50 mg/ml，每次浸泡后在烘箱中干燥，每次浸泡时间为10~30 min，每次烘干时间为10~30 min，获得氧化钼纳米线复合骨植入体。

技术总结
本发明公开了一种氧化钼纳米线复合骨植入体及其制备方法。本发明的氧化钼纳米线复合骨植入体，植入主体表面负载氧化钼纳米线，其中氧化钼纳米线具有良好的光热增强化学动力学性能，能够产生毒性活性氧用于种植牙过程中的抗菌治疗；本发明将氧化钼纳米线与植入主体复合而成的复合植入体具备一定的孔隙、应力强度和可降解性，有利于骨髓间充质干细胞粘附，增殖和分化，能够促进牙缺损的修复；本发明的氧化钼纳米线复合骨植入体的制备方法，工艺简单、反应条件温和、成本低廉，可大规模生产。可大规模生产。可大规模生产。


技术研发人员：冯炜 方颖 蒋晓燕 于洋 陈雨
受保护的技术使用者：上海大学
技术研发日：2023.02.01
技术公布日：2023/7/19