头孢菌素C的发酵方法与流程

头孢菌素c的发酵方法
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域。更具体地说，本发明涉及头孢菌素c的发酵方法。


背景技术：

2.头孢菌素c，其钠盐二水物为单斜晶体。溶于水，不溶于乙醇、乙醚。当水溶液ph为2.5-8时稳定。主要作为制备7-氨基头孢霉烷酸(7-aca)的中间体。
3.头孢菌素c在发酵过程中，需要补充足够的碳源，油脂是常用的碳源，其有利于头孢菌素c前体氨基酸的合成，进而可以促进头孢菌素c的合成，且同时兼作消沫剂，但其难溶于发酵液，过高浓度的油脂会导致发酵液供氧速率降低，因此会影响到菌体的生长，最终导致产物得率下降。且到发酵后期，液面容易产生泡沫，由于豆油消沫效果较差，需要补加较多的豆油才能有效的控制液面，同时由于菌体开始衰老自溶，对豆油的利用能力下降，残留在发酵液中过多的豆油会对头孢菌素c的提取造成影响。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供头孢菌素c的发酵方法，通过环糊精对植物油进行包合，能使植物油缓慢释放出来，进而避免油脂浓度过高导致发酵液供氧速率降低，且以纳米纤维素作为规整剂，能通过排空作用使环糊精包合物的界面膜由疏松变得紧实，从而明显提高界面膜的粘弹性和有效抑制乳液的絮凝，进而提高乳液的稳定性。
5.为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了头孢菌素c的发酵方法，包括：
6.步骤一、取顶头孢霉菌，制备一级种子、二级种子；
7.步骤二、取步骤一所得二级种子，接种至顶头孢霉菌发酵培养基中发酵，发酵时间为130h，0～40h的发酵温度为28℃，40～130h的发酵温度为25℃，ph为5.6；
8.其中，步骤二中，在发酵过程的以下时间段内补入葡萄糖溶液、植物油和环糊精/植物油乳液，工艺如下：
9.葡萄糖溶液：40～80h，连续流加4～11g/l
·
h；80～130h，连续流加9～20g/l
·
h；
10.植物油：50～90h，连续流加3～5g/l
·
h；90～120h，连续流加3～5g/l
·
h；
11.环糊精/植物油乳液：90～120h，连续流加1～3g/l
·
h；
12.其中，环糊精/植物油乳液的制备方法为：
13.步骤a、将0.72重量份的环糊精溶解于45重量份的水中，搅拌至完成溶解，得环糊精水溶液；
14.步骤b、向环糊精水溶液中加入10重量份的植物油，经混合、高速剪切乳化、高压均质，得环糊精初乳液；
15.步骤c、向环糊精初乳液中加入45重量份的浓度为0.3％的棉花纳米纤维素悬浮液，经高速剪切乳化、高压均质，得到环糊精/植物油乳液。
16.在另一种技术方案中，所述的头孢菌素c的发酵方法中，所述发酵培养基组成如下：
17.以去离子水为介质，花生粉28～38g/l、棉籽蛋白20～30g/l、谷朊粉35～45g/l、玉米浆40～60ml/l、葡萄糖6～8g/l、蔗糖16～18g/l、蛋氨酸11～15g/l、甲硫氨酸2～4g/l、大豆油80～100ml/l、消沫剂1～2ml/l、caso
4 12～16g/l、(nh4)2so
4 10～20g/l、caco
3 6～8g/l。
18.在另一种技术方案中，所述的头孢菌素c的发酵方法中，所述植物油为大豆油。
19.在另一种技术方案中，所述的头孢菌素c的发酵方法中，所述步骤b中，用高速剪切乳化剂在14000rpm下进行乳化处理2min，然后500bar高压均质8min。
20.在另一种技术方案中，所述的头孢菌素c的发酵方法中，所述步骤c中，用高速剪切乳化机在10000rpm下进行乳化处理4min，然后300bar高压均质5min。
21.在另一种技术方案中，所述的头孢菌素c的发酵方法中，所述二级种子按照20％的接种量接种至顶头孢霉菌发酵培养基中。
22.在另一种技术方案中，所述的头孢菌素c的发酵方法中，所述顶头孢霉菌为保藏号为atcc36225的顶头孢霉菌。
23.在另一种技术方案中，所述的头孢菌素c的发酵方法中，环糊精/植物油乳液：90～120h，连续流加2g/l
·
h。
24.本发明至少包括以下有益效果：
25.本发明通过环糊精对植物油进行包合，能使植物油缓慢释放出来，避免发酵后期过多的油脂残留在发酵液中，也能避免油脂浓度过高导致发酵液供氧速率降低，且以纳米纤维素作为规整剂，能通过排空作用使环糊精包合物的界面膜由疏松变得紧实，从而明显提高界面膜的粘弹性和有效抑制乳液的絮凝，进而提高乳液的稳定性。
26.本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
27.下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
28.需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
29.实施例1
30.头孢菌素c的发酵方法，包括：
31.步骤一、取顶头孢霉菌，制备一级种子、二级种子；
32.步骤二、取步骤一所得二级种子，接种至顶头孢霉菌发酵培养基中发酵，发酵时间为130h，0～40h的发酵温度为28℃，40～130h的发酵温度为25℃，ph为5.6；
33.其中，步骤二中，在发酵过程的以下时间段内补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为650g/l)、植物油、环糊精/植物油乳液，工艺如下：
34.葡萄糖溶液：40～80h，连续流加4g/l
·
h；80～130h，连续流加9g/l
·
h；
35.植物油：50～90h，连续流加3g/l
·
h；90～120h，连续流加3g/l
·
h；
36.环糊精/植物油乳液：90～120h，连续流加1g/l
·
h；
37.其中，环糊精/植物油乳液的制备方法为：
38.步骤a、将0.72重量份的环糊精溶解于45重量份的水中，搅拌至完成溶解，得环糊精水溶液；
39.步骤b、向环糊精水溶液中加入10重量份的植物油，经混合、高速剪切乳化、高压均质，得环糊精初乳液；将环糊精溶解于水中，配制成的水溶液作为水相，植物油作为油相，经混合、高速剪切乳化、高压均质成初乳液。环糊精与植物油能在油水界面自发形成包合物，并进一步组装成界面膜；
40.步骤c、向环糊精初乳液中加入45重量份的浓度为0.3％的棉花纳米纤维素悬浮液，经高速剪切乳化、高压均质，得到环糊精/植物油乳液。纳米纤维素规整剂通过排空力能够有效调控环糊精包合物在油水界面的吸附，使得界面膜由疏松变紧实，从而显著提高界面膜的机械强度。
41.本发明通过环糊精对植物油进行包合，能使植物油缓慢释放出来，避免发酵后期过多的油脂残留在发酵液中，也能避免油脂浓度过高导致发酵液供氧速率降低，且以纳米纤维素作为规整剂，能通过排空作用使环糊精包合物的界面膜由疏松变得紧实，从而明显提高界面膜的粘弹性和有效抑制乳液的絮凝，进而提高乳液的稳定性。
42.本发明在发酵过程中补入葡萄糖溶液、植物油、环糊精/植物油乳液，葡萄糖溶液、植物油能作为碳源被利用，环糊精/植物油乳液中的植物油缓慢释放出来被利用。
43.所述的头孢菌素c的发酵方法中，所述发酵培养基组成如下：
44.以去离子水为介质，花生粉28g/l、棉籽蛋白20g/l、谷朊粉35g/l、玉米浆40ml/l、葡萄糖6g/l、蔗糖16g/l、蛋氨酸11g/l、甲硫氨酸2g/l、大豆油80ml/l、消沫剂1ml/l、caso
4 12g/l、(nh4)2so
4 10g/l、caco
3 6g/l。
45.所述的头孢菌素c的发酵方法中，所述植物油为大豆油。
46.所述的头孢菌素c的发酵方法中，所述步骤b中，用高速剪切乳化剂在14000rpm下进行乳化处理2min，然后500bar高压均质8min。
47.所述的头孢菌素c的发酵方法中，所述步骤c中，用高速剪切乳化机在10000rpm下进行乳化处理4min，然后300bar高压均质5min。
48.所述的头孢菌素c的发酵方法中，所述二级种子按照20％的接种量接种至顶头孢霉菌发酵培养基中。
49.所述的头孢菌素c的发酵方法中，所述顶头孢霉菌为保藏号为atcc36225的顶头孢霉菌。
50.实施例2
51.头孢菌素c的发酵方法，包括：
52.步骤一、取顶头孢霉菌，制备一级种子、二级种子；
53.步骤二、取步骤一所得二级种子，接种至顶头孢霉菌发酵培养基中发酵，发酵时间为130h，0～40h的发酵温度为28℃，40～130h的发酵温度为25℃，ph为5.6；
54.其中，步骤二中，在发酵过程的以下时间段内补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为650g/l)、植物油、环糊精/植物油乳液，工艺如下：
55.葡萄糖溶液：40～80h，连续流加8g/l
·
h；80～130h，连续流加15g/l
·
h；
56.植物油：50～90h，连续流加4g/l
·
h；90～120h，连续流加4g/l
·
h；
57.环糊精/植物油乳液：90～120h，连续流加2g/l
·
h；
58.其中，环糊精/植物油乳液的制备方法为：
59.步骤a、将0.72重量份的环糊精溶解于45重量份的水中，搅拌至完成溶解，得环糊精水溶液；
60.步骤b、向环糊精水溶液中加入10重量份的植物油，经混合、高速剪切乳化、高压均质，得环糊精初乳液；将环糊精溶解于水中，配制成的水溶液作为水相，植物油作为油相，经混合、高速剪切乳化、高压均质成初乳液。环糊精与植物油能在油水界面自发形成包合物，并进一步组装成界面膜；
61.步骤c、向环糊精初乳液中加入45重量份的浓度为0.3％的棉花纳米纤维素悬浮液，经高速剪切乳化、高压均质，得到环糊精/植物油乳液。纳米纤维素规整剂通过排空力能够有效调控环糊精包合物在油水界面的吸附，使得界面膜由疏松变紧实，从而显著提高界面膜的机械强度。
62.本发明通过环糊精对植物油进行包合，能使植物油缓慢释放出来，避免发酵后期过多的油脂残留在发酵液中，也能避免油脂浓度过高导致发酵液供氧速率降低，且以纳米纤维素作为规整剂，能通过排空作用使环糊精包合物的界面膜由疏松变得紧实，从而明显提高界面膜的粘弹性和有效抑制乳液的絮凝，进而提高乳液的稳定性。
63.本发明在发酵过程中补入葡萄糖溶液、植物油、环糊精/植物油乳液，葡萄糖溶液、植物油能作为碳源被利用，环糊精/植物油乳液中的植物油缓慢释放出来被利用。
64.所述的头孢菌素c的发酵方法中，所述发酵培养基组成如下：
65.以去离子水为介质，花生粉33g/l、棉籽蛋白25g/l、谷朊粉40g/l、玉米浆50ml/l、葡萄糖7g/l、蔗糖17g/l、蛋氨酸13g/l、甲硫氨酸3g/l、大豆油90ml/l、消沫剂1.5ml/l、caso
4 14g/l、(nh4)2so
4 15g/l、caco
3 7g/l。
66.所述的头孢菌素c的发酵方法中，所述植物油为大豆油。
67.所述的头孢菌素c的发酵方法中，所述步骤b中，用高速剪切乳化剂在14000rpm下进行乳化处理2min，然后500bar高压均质8min。
68.所述的头孢菌素c的发酵方法中，所述步骤c中，用高速剪切乳化机在10000rpm下进行乳化处理4min，然后300bar高压均质5min。
69.所述的头孢菌素c的发酵方法中，所述二级种子按照20％的接种量接种至顶头孢霉菌发酵培养基中。
70.所述的头孢菌素c的发酵方法中，所述顶头孢霉菌为保藏号为atcc36225的顶头孢霉菌。
71.实施例3
72.头孢菌素c的发酵方法，包括：
73.步骤一、取顶头孢霉菌，制备一级种子、二级种子；
74.步骤二、取步骤一所得二级种子，接种至顶头孢霉菌发酵培养基中发酵，发酵时间为130h，0～40h的发酵温度为28℃，40～130h的发酵温度为25℃，ph为5.6；
75.其中，步骤二中，在发酵过程的以下时间段内补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为650g/l)、植物油、环糊精/植物油乳液，工艺如下：
76.葡萄糖溶液：40～80h，连续流加11g/l
·
h；80～130h，连续流加20g/l
·
h；
77.植物油：50～90h，连续流加5g/l
·
h；90～120h，连续流加5g/l
·
h；
78.环糊精/植物油乳液：90～120h，连续流加3g/l
·
h；
79.其中，环糊精/植物油乳液的制备方法为：
80.步骤a、将0.72重量份的环糊精溶解于45重量份的水中，搅拌至完成溶解，得环糊精水溶液；
81.步骤b、向环糊精水溶液中加入10重量份的植物油，经混合、高速剪切乳化、高压均质，得环糊精初乳液；将环糊精溶解于水中，配制成的水溶液作为水相，植物油作为油相，经混合、高速剪切乳化、高压均质成初乳液。环糊精与植物油能在油水界面自发形成包合物，并进一步组装成界面膜；
82.步骤c、向环糊精初乳液中加入45重量份的浓度为0.3％的棉花纳米纤维素悬浮液，经高速剪切乳化、高压均质，得到环糊精/植物油乳液。纳米纤维素规整剂通过排空力能够有效调控环糊精包合物在油水界面的吸附，使得界面膜由疏松变紧实，从而显著提高界面膜的机械强度。
83.本发明通过环糊精对植物油进行包合，能使植物油缓慢释放出来，避免发酵后期过多的油脂残留在发酵液中，也能避免油脂浓度过高导致发酵液供氧速率降低，且以纳米纤维素作为规整剂，能通过排空作用使环糊精包合物的界面膜由疏松变得紧实，从而明显提高界面膜的粘弹性和有效抑制乳液的絮凝，进而提高乳液的稳定性。
84.本发明在发酵过程中补入葡萄糖溶液、植物油、环糊精/植物油乳液，葡萄糖溶液、植物油能作为碳源被利用，环糊精/植物油乳液中的植物油缓慢释放出来被利用。
85.所述的头孢菌素c的发酵方法中，所述发酵培养基组成如下：
86.以去离子水为介质，花生粉38g/l、棉籽蛋白30g/l、谷朊粉45g/l、玉米浆60ml/l、葡萄糖8g/l、蔗糖18g/l、蛋氨酸15g/l、甲硫氨酸4g/l、大豆油100ml/l、消沫剂2ml/l、caso
4 16g/l、(nh4)2so
4 20g/l、caco
3 8g/l。
87.所述的头孢菌素c的发酵方法中，所述植物油为大豆油。
88.所述的头孢菌素c的发酵方法中，所述步骤b中，用高速剪切乳化剂在14000rpm下进行乳化处理2min，然后500bar高压均质8min。
89.所述的头孢菌素c的发酵方法中，所述步骤c中，用高速剪切乳化机在10000rpm下进行乳化处理4min，然后300bar高压均质5min。
90.所述的头孢菌素c的发酵方法中，所述二级种子按照20％的接种量接种至顶头孢霉菌发酵培养基中。
91.所述的头孢菌素c的发酵方法中，所述顶头孢霉菌为保藏号为atcc36225的顶头孢霉菌。
92.对比例1
93.与实施例2不同的是，不制备环糊精/植物油乳液，用同等量的植物油代替环糊精/植物油乳液，植物油：50～90h，连续流加4g/l
·
h；90～120h，连续流加6g/l
·
h。其他与实施例2相同。
94.对比例2
95.与实施例2不同的是，环糊精/植物油乳液：90～120h，连续流加1.8g/l
·
h；其他与实施例2相同。
96.对比例3
97.与实施例2不同的是，环糊精/植物油乳液：90～120h，连续流加2.2g/l
·
h；其他与实施例2相同。
98.实验
99.实施例2和对比例1-3均参考申请号为201610837322.0一种头孢菌素c的发酵方法实施例1中的方法制备一级种子、二级种子，二级种子按照18％(v/v)接种量接种于发酵培养基中。期间，根据需要补加硫酸铵和消沫剂。
100.发酵结束后，取发酵罐发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。
101.效价检测：取1ml发酵液于50ml的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素c混合液，取制得的头孢菌素c，分别检测效价。
102.色谱条件如下：色谱柱：hypersil ods5um
×
4.6mm
×
250mm，波长：254nm，流速：1ml/min，进样量：20ul。
103.放罐总十亿为头孢菌素c的产量单位。发酵罐容积为500m3。
104.放罐总十亿的计算方式为：十亿＝效价(μg/ml)*体积(m3)/1000
105.发酵实验结果见表1。
106.表1发酵实验结果
107.项目效价(u/ml)docpc组分(％)实施例2429120.58对比例1362390.98对比例2396930.72对比例3412870.63
108.由表1可知，采用实施例2的发酵方法制备的头孢菌素c的效价最高，杂质docpc的含量最低，说明通过环糊精对植物油进行包合，能使植物油缓慢释放出来，避免发酵后期过多的油脂残留在发酵液中，也能避免油脂浓度过高导致发酵液供氧速率降低，因而能提高头孢菌素c的效价。且由实施例2和对比例2和3比较可知，环糊精/植物油乳液：90～120h，连续流加2g/l
·
h效果最好。
109.尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

技术特征：
1.头孢菌素c的发酵方法，其特征在于，包括：步骤一、取顶头孢霉菌，制备一级种子、二级种子；步骤二、取步骤一所得二级种子，接种至顶头孢霉菌发酵培养基中发酵，发酵时间为130h，0～40h的发酵温度为28℃，40～130h的发酵温度为25℃，ph为5.6；其中，步骤二中，在发酵过程的以下时间段内补入葡萄糖溶液、植物油和环糊精/植物油乳液，工艺如下：葡萄糖溶液：40～80h，连续流加4～11g/l
·
h；80～130h，连续流加9～20g/l
·
h；植物油：50～90h，连续流加3～5g/l
·
h；90～120h，连续流加3～5g/l
·
h；环糊精/植物油乳液：90～120h，连续流加1～3g/l
·
h；其中，环糊精/植物油乳液的制备方法为：步骤a、将0.72重量份的环糊精溶解于45重量份的水中，搅拌至完成溶解，得环糊精水溶液；步骤b、向环糊精水溶液中加入10重量份的植物油，经混合、高速剪切乳化、高压均质，得环糊精初乳液；步骤c、向环糊精初乳液中加入45重量份的浓度为0.3％的棉花纳米纤维素悬浮液，经高速剪切乳化、高压均质，得到环糊精/植物油乳液。2.如权利要求1所述的头孢菌素c的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基组成如下：以去离子水为介质，花生粉28～38g/l、棉籽蛋白20～30g/l、谷朊粉35～45g/l、玉米浆40～60ml/l、葡萄糖6～8g/l、蔗糖16～18g/l、蛋氨酸11～15g/l、甲硫氨酸2～4g/l、大豆油80～100ml/l、消沫剂1～2ml/l、caso
4 12～16g/l、(nh4)2so
4 10～20g/l、caco
3 6～8g/l。3.如权利要求1所述的头孢菌素c的发酵方法，其特征在于，所述植物油为大豆油。4.如权利要求1所述的头孢菌素c的发酵方法，其特征在于，所述步骤b中，用高速剪切乳化剂在14000rpm下进行乳化处理2min，然后500bar高压均质8min。5.如权利要求1所述的头孢菌素c的发酵方法，其特征在于，所述步骤c中，用高速剪切乳化机在10000rpm下进行乳化处理4min，然后300bar高压均质5min。6.如权利要求1所述的头孢菌素c的发酵方法，其特征在于，所述二级种子按照20％的接种量接种至顶头孢霉菌发酵培养基中。7.如权利要求1所述的头孢菌素c的发酵方法，其特征在于，所述顶头孢霉菌为保藏号为atcc36225的顶头孢霉菌。8.如权利要求1所述的头孢菌素c的发酵方法，其特征在于，环糊精/植物油乳液：90～120h，连续流加2g/l
·
h。

技术总结
本发明公开了头孢菌素C的发酵方法，包括：步骤一、取顶头孢霉菌，制备一级种子、二级种子；步骤二、取步骤一所得二级种子，接种至顶头孢霉菌发酵培养基中发酵；其中，步骤二中，在发酵过程的以下时间段内补入葡萄糖溶液、植物油和环糊精/植物油乳液，工艺如下：葡萄糖溶液：40～80h，连续流加4～11g/L


技术研发人员：王福清 王福华 许荔新
受保护的技术使用者：中科医药行业生产力促进中心有限公司
技术研发日：2023.01.17
技术公布日：2023/7/19