抗菌肽、表达载体及其应用

抗菌肽、表达载体及其应用
1.分案申请声明
2.本技术为2022年04月29日递交的申请号为202210468553.4发明名称为“松墨天牛抗菌肽及其编码基因和应用”的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
3.本发明涉及生物基因工程技术领域，尤其涉及抗菌肽、表达载体及其应用。


背景技术：

4.抗菌肽是宿主非特异性免疫防御系统产生的一类对抗外源性病原体的肽类活性物质，是天然免疫的效应分子。近些年来,随着传统抗生素的大量使用,耐药细菌的出现,为人类的健康带来了巨大的隐患。抗菌肽具有广谱抗细菌、真菌、病毒、寄生虫的活性,且不易产生耐药菌株的优点。目前作为抗生素的替代品或者与抗生素协同作用有望成为新的抗菌药物,具有广阔的应用价值和开发前景。
5.重组蛋白表达技术能够高效大量获得目的蛋白,与其他真核及原核表达系统相比,毕赤酵母表达系统具有易于操作,多种转录后修饰(如多肽折叠,酰化,糖基化,甲基化等),遗传系统稳定及蛋白可高水平表达等优点。
6.在现有技术中：尹娜等在毕赤酵母中表达了抗菌肽cecropin d(尹娜,中国生物制品学杂志,2008)；王珍等在毕赤酵母中表达了抗菌肽cecropin ad(王珍等,中国畜牧杂志,2010；金丰良等在毕赤酵母中克隆表达了家蝇防御素defensin(金丰良,中山大学学报,2006)；吴松泉等在毕赤酵母中表达了致倦库蚊防御素defensin(吴松泉,免疫学杂志,2013)；然而，松墨天牛抗菌肽基因家族不完整，其相应的研究也较少，因此，针对松墨天牛进行研究，丰富其抗菌肽基因家族是非常具有现实意义的研究课题。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明的目的在于提出一种抑菌效果佳、制备可靠稳定且具有积极应用前景的抗菌肽、表达载体及其应用。
8.为了实现上述的技术目的，本发明所采用的技术方案为：
9.一种松墨天牛抗菌肽，所述松墨天牛抗菌肽为松墨天牛抗菌肽maltcec、松墨天牛抗菌肽maltdef、松墨天牛抗菌肽maltatt-1或松墨天牛抗菌肽maltatt-2；
10.其中，
11.松墨天牛抗菌肽maltcec的氨基酸序列如seq id no.1所示，
12.松墨天牛抗菌肽maltdef的氨基酸序列如seq id no.2所示，
13.松墨天牛抗菌肽maltatt-1的氨基酸序列如seq id no.3所示，
14.松墨天牛抗菌肽maltatt-2的氨基酸序列如seq id no.4所示。
15.基于上述，本发明还提供编码上述所述松墨天牛抗菌肽的基因，其中，
16.编码松墨天牛抗菌肽maltcec的核苷酸序列如seq id no.5所示，
17.编码松墨天牛抗菌肽maltdef的核苷酸序列如seq id no.6所示，
18.编码松墨天牛抗菌肽maltatt-1的核苷酸序列如seq id no.7所示，
19.编码松墨天牛抗菌肽maltatt-2的核苷酸序列如seq id no.8所示。
20.基于上述，本发明还提供含有上述所述基因的表达载体。
21.作为一种可能的实施方式，进一步，所述表达载体为毕赤酵母菌。
22.基于上述，本发明还提供一种制备上述所述松墨天牛抗菌肽的方法，采用微生物表达获得所述松墨天牛抗菌肽，或采用人工合成的方式制备所述松墨天牛抗菌肽。
23.作为一种可能的实施方式，进一步，采用微生物表达获得所述松墨天牛抗菌肽的方法包括：筛选松墨天牛抗菌肽对应的基因序列，并在其5'端添加snabⅰ酶切位点和起始密码子，在其3'端添加终止密码子和notⅰ酶切位点，以完成对基因序列的合成，然后将其与ppic9k质粒分别经snabⅰ/notⅰ双酶切后,将合成的目的基因连接到毕赤酵母外泌表达载体ppic9k上,得到重组表达载体，继而再对重组表达载体进行诱导表达，获得所述松墨天牛抗菌肽。
24.基于上述，本发明还提供根据上述所述的松墨天牛抗菌肽在制备抑制松材线虫病的药物或试剂中的应用。
25.基于上述，本发明还提供一种农药，其包括上述所述的松墨天牛抗菌肽。
26.基于上述，本发明还提供一种抗菌药物，其包括上述所述的松墨天牛抗菌肽。
27.采用上述的技术方案，本发明与现有技术相比，其具有的有益效果为：本发明方案针对目前松墨天牛抗菌肽基因家族不完整的问题，提出了四种松墨天牛抗菌肽maltcec、maltdef、maltatt-1、maltatt-2及其对应的抗菌肽基因和对应的外源表达载体及产物，同时，还揭示了对应诱导表达和纯化方法，本方案丰富了松墨天牛抗菌肽基因家族,实现了松墨天牛抗菌肽基因maltcec、maltdef、maltatt-1、maltatt-2的外源表达；本发明方案还成功的利用毕赤酵母将松墨天牛抗菌肽maltcec、maltdef、maltatt-1、maltatt-2基因表达，同时证明其具有抑菌活性，本方案的松墨天牛抗菌肽抑菌效果佳、其制备可靠稳定且具有积极应用前景。
附图说明
28.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
29.图1为本发明方案在毕赤酵母高效重组表达maltcec、maltdef、maltatt-1、maltatt-2抗菌肽的技术路线图；
30.图2为本发明方案maltcec、maltdef、maltatt-1、maltatt-2的诱导表达结果表征示意图；
31.图3为本发明方案重组抗菌肽maltcec、maltdef、maltatt-1、maltatt-2的抑菌活性鉴定表征图；
32.图4为本发明实施例方案中0.3mg
·
ml-1
松墨天牛抗菌肽蛋白的杀线活性表征曲线图；
33.图5为本发明实施例方案中0.6mg
·
ml-1
松墨天牛抗菌肽蛋白的杀线活性表征曲线图。
34.图6为本发明实施例方案中1.0mg
·
ml-1
松墨天牛抗菌肽蛋白的杀线活性表征曲线图。
具体实施方式
35.下面结合附图和实施例，对本发明作进一步的详细描述。特别指出的是，以下实施例仅用于说明本发明，但不对本发明的范围进行限定。同样的，以下实施例仅为本发明的部分实施例而非全部实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
36.实施例1
37.结合图1所示，本实施例提供松墨天牛抗菌肽基因maltcec、maltdef、maltatt-1、maltatt-2的外源表达及产物的诱导表达和纯化方法，其包括以下步骤：
38.(1)抗菌肽基因合成与表达载体构建
39.从松墨天牛幼虫的转录组数据中筛选出抗菌肽maltcec、maltdef、maltatt-1、maltatt-2基因序列，分别在各抗菌肽基因序列的5'端添加snabⅰ酶切位点和起始密码子，在其3'端添加终止密码子和notⅰ酶切位点；最终，该目的基因被命名为maltcec、maltdef、maltatt-1、maltatt-2，序列由武汉金开瑞有限公司合成。
40.其中，编码松墨天牛抗菌肽maltcec的核苷酸序列如seq id no.5所示，编码松墨天牛抗菌肽maltdef的核苷酸序列如seq id no.6所示，编码松墨天牛抗菌肽maltatt-1的核苷酸序列如seq id no.7所示，编码松墨天牛抗菌肽maltatt-2的核苷酸序列如seq id no.8所示。
41.将合成的基因序列及ppic9k质粒分别经ecorⅰ/notⅰ双酶切，将合成的目的基因连接到毕赤酵母外泌表达载体ppic9k上，得到重组表达载体ppic9k-maltcec、ppic9k-maltdef、ppic9k-maltatt-1、ppic9k-maltatt-2。
42.(2)重组表达载体ppic9k-maltcec、ppic9k-maltdef、ppic9k-maltatt-1、ppic9k-maltatt-2的验证
43.获取含有重组表达载体ppic9k-maltcec、ppic9k-maltdef、ppic9k-maltatt-1、ppic9k-maltatt-2的穿刺菌，将其分别挑取至lb液体培养基中，培养12h后用诺唯赞试剂盒提取质粒，提取出的质粒经1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
44.(21)测序验证
45.双酶切结果仅能初步验证重组载体构建成功和大小正确，不能确定碱基序列中是否会发生缺失、突变，因此委托福州铂尚生物技术公司对重组质粒进行测序。
46.(3)将重组表达载体ppic9k-maltcec、ppic9k-maltdef、ppic9k-maltatt-1、ppic9k-maltatt-2转入毕赤酵母
47.(31)重组表达载体线性化及去磷酸化
48.环形的质粒在线性化处理后,载体的两端都可以与酵母的同源序列发生同源重组，使其整合到酵母基因组的效率会大大提高。因此为了提高目的基因插入酵母基因组的几率，在电击转化前需要使用限制性内切酶sal i对重组表达质粒ppic9k-maltcec、
ppic9k-maltdef、ppic9k-maltatt-1、ppic9k-maltatt-2进行线性化及去磷酸化处理。同时酶切ppic9k空载体作为以后表达的对照。sal i酶切体系如表1所示
[0049][0050]
以上溶液经瞬时离心混匀，37℃酶切数小时或过夜，期间0.8％琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，以没有酶切的质粒作对照。完全酶切后，加去磷酸化酶caip(1u/ul)1ul 37℃温浴1-2h进行去磷酸化处理。然后用酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)进行抽提，3mol/lnaac(ph5.2)溶液和无水乙醇进行线性质粒的沉淀浓缩，-20℃暂存备用。
[0051]
(32)毕赤酵母感受态细胞的制备
[0052]
a.活化毕赤酵母菌株km71
[0053]
取50ul在-80℃冻存菌株km71涂布于ypd固体平板，30℃培养36h。挑同一个单菌落分别划线接种于md和mdh固体平板。筛选在md平板上不能生长，但在mdh平板上能生长的氨酸缺陷型菌株。再划线接种于新鲜ypd平板上，30℃培养2天，至单菌落出现。
[0054]
b.制备km71感受态细胞
[0055]
a.活化的ypd平板上挑取一个单菌落，将其接种于5ml ypd液体培养基，28℃、250rpm过夜培养。
[0056]
b.4℃、1500
×
g离心5min，收菌。加入100ml冰冷无菌水重悬菌体细胞,并重复本步操作一遍。
[0057]
c.4℃、1500
×
g离心5min,收菌。加入50ml冰冷1mol/l山梨醇重悬菌体细胞。
[0058]
d.4℃、1500
×
g离心5min，收菌。加入1ml冰冷1mol/l山梨醇重悬菌体细胞,置于冰上备用(可将此感受态细胞分装80ul于离心管中冻存，但其转化效率会大大降低)。
[0059]
(33)毕赤酵母感受态细胞的电击转化及高拷贝转化子的筛选
[0060]
a.毕赤酵母的电击转化
[0061]
bio-ead gene pulse电转仪上转化，电压1500v、电容25uf、电阻200ω
[0062]
a.毕赤酵母感受态细胞80ul和约10ug线性化重组表达质粒ppic9k-maltcec、ppic9k-maltdef、ppic9k-maltatt-1、ppic9k-maltatt-2，在1.5ml离心管中混匀，插入冰浴中预冷。同时80ul毕赤酵母感受态细胞和约10ug线性化ppic9k空载体在另一离心管混匀，插入冰中预冷，作为对照，同时0.2cm电转化杯置于冰上预冷10min。
[0063]
b.预冷的质粒和感受态细胞混匀物转入冰冷的0.2cm电极杯内,再次冰浴5min,擦干电转化杯表面水分，迅速置于电转仪上电击1次，立即向杯中加入1ml预冷1mol/l山梨醇，混匀，转入1.5ml离心管，置于冰上。
[0064]
c.取0.4ml电转化物涂布于rpb平板上，以空质粒ppic9k转化菌株km71作阴性对照。30℃培养至转化子出现。
[0065]
b.高拷贝转化子的筛选
[0066]
待md平板上长出ppic9k-maltcec、ppic9k-maltdef、ppic9k-maltatt-1、ppic9k-maltatt-2和ppic9k转化子后,分别用无菌水重悬菌体，测定浓度使得od600＝1，将菌液涂布于不同浓度(0～4mg/ml)遗传霉素(g-418)的ypd平板上，含ppic9k空载质粒的菌液只需涂在无抗性的ypd平板上，放置30℃培养箱培养。等到ypd平板上长出菌落后，挑取部分菌落，划线培养于对应浓度ypd平板上。用一对引物(a-factor/5’aox(ppic9k-f)和3’aox(ppic9k-r)进行菌落pcr验证。在浓度高的g-418平板上长出的阳性菌落，即插入高拷贝的转化子。
[0067]
(4)蛋白的表达、纯化及活性检测
[0068]
(41)蛋白的表达
[0069]
挑取ppic9k-maltcec、ppic9k-maltdef、ppic9k-maltatt-1、ppic9k-maltatt-2和ppic9k转化子接种于bmgy培养基中，30℃、250～300r/min过夜培养，od600＝4-6时收集菌液，于4℃，3000g/min,离心5min，收集菌体，重悬于bmmy培养基中；每24h添加一次100％的甲醇,使得甲醇终浓度为0.5％；连续诱导96h后，49℃，6500r/min,离心10min，收集上清；将收集的发酵液上清冷冻抽干,将浓缩后的上清液进行硫酸铵沉淀。
[0070]
利用tricine-sds-page和western-blot对沉淀后的蛋白进行检测，验证是否含有目的蛋白maltcec、maltdef、maltatt-1、maltatt-2，结果如图2所示。
[0071]
(42)抑菌圈实验
[0072]
为了验证抗菌肽maltcec、maltdef、maltatt-1、maltatt-2是否具有抑菌活性，本实施例进行抑菌圈实验以进行验证。选择大肠杆菌(因为它是一种模式菌)和沙雷氏菌作为实验菌株，具体方法为：将大肠杆菌和沙雷氏菌过夜培养,次日按1％的接种量转接至od600＝0.2,取100pul与lb固体培养基混匀倒平板,培养基凝固后用打孔器打孔,每孔加入100μl maltcec发酵液上清(maltdef、maltatt-1、maltatt-2也是如此),用水(或者ppic9k发酵液上清)作为阴性对照,8μum ampicillin为阳性对照,于37℃培养,观察生长情况，结果如图3所示。
[0073]
(43)蛋白的纯化
[0074]
按照南京金斯瑞his标签纯化试剂盒的方法,对抗菌肽maltcec、maltdef、maltatt-1、maltatt-2的蛋白粗品进行纯化,tricine-sds-page检测蛋白的纯化效果。
[0075]
实施例2
[0076]
松墨天牛气管抗菌肽对松材线虫的杀线活性测定
[0077]
为了验证菌肽maltcec、maltdef、maltatt-1、maltatt-2对松材线虫的生命活动是否有影响，本实施例方案采用浸虫法进行松墨天牛气管抗菌肽对松材线虫杀线活性的测定。
[0078]
(1)供试线虫的处理
[0079]
a.在pda培养基上接种盘多毛孢菌；
[0080]
b.盘多毛孢菌落上接种松材线虫,28℃恒温箱培养,至将菌落取食完；
[0081]
c.berman漏斗法分离线虫液,5-8h后转移至15ml离心管,体视镜下观察线虫的活性较强；
[0082]
d.将收集到的新鲜试验线虫置于1.5ml离心管内,室温4000rpm离心处理5min；
[0083]
e.移液枪移去.上清液,加入0.5ml的无菌水,室温4000rpm离心处理5min,重复两次；
[0084]
f.移液枪移去上清液,加入0.5ml的depc-h2o,室温4000rpm离心处理5min,重复两次；
[0085]
g.快速离心去水,备用后续试验。
[0086]
(2)药剂处理松材线虫
[0087]
a.用无菌水将每种浓度的抗菌肽蛋白maltcec、maltdef、maltatt-1、maltatt-2稀释为为0.3mg
·
l-1
、0.6mg
·
l-1
、1mg
·
l-1
；
[0088]
b.将稀释后的蛋白和线虫悬液(约100头)以1∶9配比置于24孔培养板中，用移液枪吹打混匀。每个浓度为1个处理，每个处理重复6组，以无菌水作为空白对照；
[0089]
c.将培养板置于26
±
2℃恒温培养箱中，于3h、6h、12h、24h在显微镜下观察并统计松材线虫的存活数和死亡数，用abbott公式校正处理组死亡率，死亡率公式如下且：
[0090]
校正死亡率(％)＝(处理死亡率-对照死亡率)/(1-对照组死亡率)
×
100％
[0091]
活虫认定：凡虫体摆动均为活虫；假死：呈“s”形或卷曲、螺旋形需经昆虫针微刺验证是否为假死线虫：死虫认定：凡不运动且虫体呈“j”形或“c”形，或虫体僵直、体壁不完整的均判断为死虫。
[0092]
松材线虫经0.3mg
·
ml-1
、0.6mg
·
ml-1
、1mg
·
ml-1
的4种抗菌肽处理下发现，松墨天牛抗菌肽对松材线虫均有良好的毒杀效果。对比相同浓度下氟吡菌酰胺(90.0％)和阿维菌素(63.7％)药剂处理24h后，杀线活性显著。通过对比发现松墨天牛抗菌肽在处理松材线虫3h后均达到了lc50；处理松材线虫24h后的致死率均达到lc90，并且抗菌肽maltatt-1在低浓度0.3mg
·
ml-1下仍具有较好的杀线活性，于6h达到了(98.7％)。其次为maltdef(83.4％)、maltatt-2(82.9％)和maltcec(80.9％)。
[0093]
本方案提供了四种松墨天牛抗菌肽maltcec、maltdef、maltatt-1、maltatt-2及其编码基因和外源表达、产物的诱导表达和纯化方法，其丰富了松墨天牛抗菌肽基因家族,实现了松墨天牛抗菌肽基因maltcec、maltdef、maltatt-1、maltatt-2的外源表达。发现经序列改造后的重组抗菌肽对松材线虫具有良好的杀线活性,鉴于此抗菌肽作为一种绿色农药在抑制松材线虫病上显示出巨大的应用潜力。
[0094]
以上所述仅为本发明的部分实施例，并非因此限制本发明的保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效装置或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

技术特征：
1.一种抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽为松墨天牛抗菌肽maltdef；其中，松墨天牛抗菌肽maltdef的氨基酸序列如seq id no.2所示。2.编码权利要求1所述抗菌肽的基因，其特征在于，编码松墨天牛抗菌肽maltdef的核苷酸序列如seq id no.6所示。3.含有权利要求2所述基因的表达载体。4.根据权利要求3所述表达载体，其特征在于，所述表达载体为毕赤酵母菌。5.一种制备权利要求1所述抗菌肽的方法，其特征在于：采用微生物表达获得所述抗菌肽，或采用人工合成的方式制备所述抗菌肽。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：采用微生物表达获得所述抗菌肽的方法包括：筛选松墨天牛抗菌肽maltdef对应的基因序列，并在其5'端添加snabⅰ酶切位点和起始密码子，在其3'端添加终止密码子和notⅰ酶切位点，以完成对基因序列的合成，然后将其与ppic9k质粒分别经snabⅰ/notⅰ双酶切后，将合成的目的基因连接到毕赤酵母外泌表达载体ppic9k上，得到重组表达载体，继而再对重组表达载体进行诱导表达，获得所述抗菌肽。7.根据权利要求1所述的抗菌肽在制备抑制松材线虫病的药物或试剂中的应用。8.一种农药，其特征在于：其包括权利要求1所述的抗菌肽。9.一种抗菌药物，其特征在于：其包括权利要求1所述的抗菌肽。

技术总结
本发明公开了抗菌肽、表达载体及其应用，本发明方案针对目前松墨天牛抗菌肽基因家族不完整的问题，提出了四种松墨天牛抗菌肽MaltCec、MaltDef、MaltAtt-1、MaltAtt-2及其对应的抗菌肽基因和对应的外源表达载体及产物，同时，还揭示了对应诱导表达和纯化方法，本方案丰富了松墨天牛抗菌肽基因家族,实现了松墨天牛抗菌肽基因MaltCec、MaltDef、MaltAtt-1、MaltAtt-2的外源表达；本发明方案还成功的利用毕赤酵母将松墨天牛抗菌肽MaltCec、MaltDef、MaltAtt-1、MaltAtt-2基因表达，同时证明其具有抑菌活性，本方案的松墨天牛抗菌肽抑菌效果佳、其制备可靠稳定且具有积极应用前景。景。景。


技术研发人员：胡霞 余璐 初旭 李国强 杨梅娇 蒋迪 王泽光 张飞萍 吴松青 王荣
受保护的技术使用者：福建农林大学
技术研发日：2022.04.29
技术公布日：2023/7/12