一种烟酰胺核糖磷酸转移酶的封装工艺的制作方法

1.本发明涉及酶修饰领域，具体涉及一种烟酰胺核糖磷酸转移酶的封装工艺。


背景技术：

2.烟酰胺单核苷酸(nicotinamidemononucleotide，简称nmn)在人体细胞能量生成中扮演重要角色，它参与细胞内nad(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，细胞能量转化的重要辅酶)的合成，在医药领域具有巨大的应用价值。目前高纯度的β-nmn主要是通过生物酶法合成，其过程中因为要大量用到烟酰胺核糖磷酸转移酶(nnpt)，导致其生产成本较高。
3.固定化酶(immobilizedenzyme)是通过物理或化学方法将酶固定在特定的区域来保持其活性并降低其回收和重复利用难度的方法。根据酶和载体的结合形式，又可分为两类：表面固定与内部封装。由于经表面固定法处理的酶仍暴露在外界环境中，难以确保其稳定性，所以近年来人们更倾向于使用内部封装法固定化酶。但是，内部封装法存在两个主要的问题，一是载体的存在限制了底物扩散，在一定程度上会影响酶的催化活性；二是原位封装法在载体的选择上具有一定的局限性。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明提供了一种烟酰胺核糖磷酸转移酶的封装工艺。
5.本发明解决上述技术问题采用的技术方案为：
6.一种烟酰胺核糖磷酸转移酶的封装工艺，其所述封装工艺包括以下步骤：
7.(1)分别将单链dna(ssdna)与三(2-羧乙基)膦(tcep)、烟酰胺核糖磷酸转移酶(nnpt)与4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸-3-硫代-n-琥珀酰亚胺脂内盐(smcc)混合反应3h，分别记为id1与id2，离心超滤纯化后再
8.将id1与id2混合反应12h，然后离心超滤纯化。
9.(2)在十六烷基三甲基溴化铵(ctab)与2-甲基咪唑的水溶液中加入醋酸锌，搅拌溶解后加入步骤(1)中的ssdna-nnt复合物，搅拌均匀后静置3h。
10.(3)将步骤(2)中产物离心后收集固体，使用去离子水洗涤，重复2次后将固体涡旋分散均匀，得到混合液m1。
11.(4)将硝酸钴溶解于乙醇与水的混合溶液，搅拌的同时加入步骤(3)中的混合液m1，反应10min后离心收集固体，将其离心洗涤三次后加入hepes分散溶解，得到最终产物。
12.进一步的，所述步骤(1)中，nnpt与ssdna的质量比1:0.1-1：1.0，ssdna的长度为20-60base，nnpt与tcep的质量比为1:0.01-1:0.05，nnpt与smcc的质量比为1:0.1-1:1.0。
13.进一步的，所述步骤(1)中，离心超滤所用离心管的截留分子量为10k。
14.进一步的，所述步骤(2)中，ssdna-nnt复合物与ctab的质量比为1:0.01-1：0.05，复合物与2-甲基咪唑的质量比为1:5-1:20，复合物与醋酸锌的质量比为1:1-1:10。
15.进一步的，所述步骤(4)中，乙醇和水的体积比为1:1-1:5，硝酸钴的加入量为溶液质量的0.1％到1.0％。所用hepes的ph为7.4。
16.与现有技术相比，本发明具备的有益效果为：
17.本发明提供的烟酰胺核糖磷酸转移酶的封装工艺在保证酶催化性能的同时，合成的固定化酶具有较好的热稳定性与重复使用性，提高了nmn合成过程中的物料利用率，不仅降低了原料成本，而且降低了后续过程中的物料分离纯化难度，减少了排放，提高了综合效益。
附图说明
18.图1是本发明中表征酶固定到了ldhs内的谱线；
19.图2是本发明中时间对固定化酶的热稳定性的影响；
20.图3是本发明中表征固定化酶重复使用性能曲线。
具体实施方式
21.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
22.实例1
23.称取1.4mgtcep，6.0mgsmcc，5mgnnpt分别加入1.5ml、1.2ml和500μl的hepes(ph＝7.4)溶解，涡旋使其分散均匀。取1mgssdna(24base)，离心(12000rpm，6min)，加入300μlhepes(ph＝7.4)涡旋溶解。
24.取一支5ml离心管，加入上述300μlssdna和120μltcep；另取一支5ml离心管，加入500μlnnpt，500μlsmcc，混合均匀后，将上述溶液置于摇床反应3h(37℃，400rpm)。
25.使用3k超滤管将上述ssdna离心6次(15℃，8100xg，20min/次)，使用10k超滤管将上述nnpt离心6次(15℃，8100xg，10min/次)，超滤离心完成后反离心1次(15℃，6500rpm，6min)。将两组溶液在50ml管中混合，放入摇床反应12h(29℃，400rpm)。反应完成后使用10k超滤管对溶液进行6次超滤离心(15℃，8100xg，10min/次)，1次反离心(15℃，6500rpm，6min)。
26.称取0.0010gctab与0.32g2-甲基咪唑溶解于5ml水中；称取0.14gzn(no3)2·
6h2o溶于5ml水。移取1mlctab与2-甲基咪唑的水溶液置于50ml玻璃管中，磁力搅拌5min(500rpm)，然后移取1mlzn(no3)2的水溶液加入管中，注入ssdna-nnpt复合物。继续磁力搅拌5min(500rpm)后，停止搅拌，于室温下静置3h。离心清洗后将得到的固体用去离子水分散备用。
27.量取50ml去离子水与25ml无水乙醇混合，称取0.375gco(no3)2·
6h2o加入到上述乙醇与水的混合溶液。边搅拌边向co(no3)2溶液中加入前述分散后的液体，继续搅拌30min。离心清洗后得到最终产物。
28.实例2
29.称取1.2mgtcep，5.0mgsmcc，5mgnnpt分别加入1.5ml、1.2ml和500μl的hepes(ph＝7.4)溶解，涡旋使其分散均匀。取1mgssdna(24base)，离心(12000rpm，6min)，加入300μlhepes(ph＝7.4)涡旋溶解。
30.取一支5ml离心管，加入上述300μlssdna和120μltcep；另取一支5ml离心管，加入500μlnnpt，500μlsmcc，混合均匀后，将上述溶液置于摇床反应3h(37℃，400rpm)。
31.使用3k超滤管将上述ssdna离心6次(15℃，8100xg，20min/次)，使用10k超滤管将上述nnpt离心6次(15℃，8100xg，10min/次)，超滤离心完成后反离心1次(15℃，6500rpm，6min)。将两组溶液在50ml管中混合，放入摇床反应12h(29℃，400rpm)。反应完成后使用10k超滤管对溶液进行6次超滤离心(15℃，8100xg，10min/次)，1次反离心(15℃，6500rpm，6min)。
32.称取0.0012gctab与0.30g2-甲基咪唑溶解于5ml水中；称取0.145gzn(no3)2·
6h2o溶于5ml水。移取1mlctab与2-甲基咪唑的水溶液置于50ml玻璃管中，磁力搅拌5min(500rpm)，然后移取1mlzn(no3)2的水溶液加入管中，注入ssdna-nnpt复合物。继续磁力搅拌5min(500rpm)后，停止搅拌，于室温下静置3h。离心清洗后将得到的固体用去离子水分散备用。
33.量取50ml去离子水与25ml无水乙醇混合，称取0.35gco(no3)2·
6h2o加入到上述乙醇与水的混合溶液。边搅拌边向co(no3)2溶液中加入前述分散后的液体，继续搅拌30min。离心清洗后得到最终产物。
34.实例3
35.称取1.5mgtcep，5.0mgsmcc，5mgnnpt分别加入1.5ml、1.2ml和500μl
36.的hepes(ph＝7.4)溶解，涡旋使其分散均匀。取1mgssdna(24base)，离心(12000rpm，6min)，加入300μlhepes(ph＝7.4)涡旋溶解。
37.取一支5ml离心管，加入上述300μlssdna和120μltcep；另取一支5ml离心管，加入500μlnnpt，500μlsmcc，混合均匀后，将上述溶液置于摇床反应3h(37℃，400rpm)。
38.使用3k超滤管将上述ssdna离心6次(15℃，8100xg，20min/次)，使用10k超滤管将上述nnpt离心6次(15℃，8100xg，10min/次)，超滤离心完成后反离心1次(15℃，6500rpm，6min)。将两组溶液在50ml管中混合，放入摇床反应12h(29℃，400rpm)。反应完成后使用10k超滤管对溶液进行6次超滤离心(15℃，8100xg，10min/次)，1次反离心(15℃，6500rpm，6min)。
39.称取0.0015gctab与0.35g2-甲基咪唑溶解于5ml水中；称取0.12gzn(no3)2·
6h2o溶于5ml水。移取1mlctab与2-甲基咪唑的水溶液置于50ml玻璃管中，磁力搅拌5min(500rpm)，然后移取1mlzn(no3)2的水溶液加入管中，注入ssdna-nnpt复合物。继续磁力搅拌5min(500rpm)后，停止搅拌，于室温下静置3h。离心清洗后将得到的固体用去离子水分散备用。
40.量取50ml去离子水与25ml无水乙醇混合，称取0.35gco(no3)2·
6h2o加入到上述乙醇与水的混合溶液。边搅拌边向co(no3)2溶液中加入前述分散后的液体，继续搅拌30min。离心清洗后得到最终产物。
41.实验结果
42.通过实施例1的方法制备固定化的nnpt后，采用红外光谱对制备的材料与固定化酶进行表征，其结果如图1所示。可以看到，在ldhs@ssdna@nnpt的谱线中nnpt蛋白的酰胺ⅰ谱带(c＝o拉伸振动)和酰胺ⅱ谱带(c-n拉伸振动和n-h弯曲振动)分别在1640-1660cm-1
和1510-1560cm-1
附近。通过与材料ldhs的谱线进行对比，表明实验中成功地将酶固定到了
ldhs内。
43.通常情况下，高温会引起使酶的空间结构的改变，从而使其活性降低甚
44.至失去活性。本发明比较了固定化nnpt和游离nnpt在50℃下的热稳定性，其结果如图2所示。随着固定化酶在50℃的环境中放置时间的增加，游离酶的相对活性迅速下降，而固定化酶在90min时总体的活性仍保持初始活性的60％以上，这表明制备的固定化酶有着相对较好的热稳定性。
45.将酶固定化不仅可以提高它的稳定性，还能降低其回收的成本与难度从而提高它的重复使用性，所以固定化酶的重复使用性也是一项需要重点考察的酶学性质。如图3所示，在重复使用了12次之后，固定化酶仍保持了60％以上的相对活性。这表明制备的固定化酶重复使用性良好，在一定程度上能够节约酶的使用成本、提高酶的利用效率。
46.本发明解决上述技术问题采用的技术方案为：本发明采用层状双金属氢氧化物(ldhs)作为封装酶的载体，ldhs是由两种或两种以上金属元素组成的具有水滑石层状晶体结构的氢氧化物。这类材料因其层间和层板阴阳离子可调而具有丰富的性质，如较大的表面积、可调控的孔径以及较好的生物相容性，目前已被广泛用于催化、生物学和医学等领域。同时它允许快速的质量、电子传输，有利于提高酶促效率；它的亲水性与温度耐受性也有利于提高酶的稳定性。
47.以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
48.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起
49.见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

技术特征：
1.一种烟酰胺核糖磷酸转移酶的封装工艺，其特征在于：所述封装工艺包括以下步骤：(1)分别将单链dna(ssdna)与三(2-羧乙基)膦(tcep)、烟酰胺核糖磷酸转移酶(nnpt)与4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸-3-硫代-n-琥珀酰亚胺脂内盐(smcc)混合反应3h，分别记为id1与id2，离心超滤纯化后再将id1与id2混合反应12h，然后离心超滤纯化；(2)在十六烷基三甲基溴化铵(ctab)与2-甲基咪唑的水溶液中加入醋酸锌，搅拌溶解后加入步骤(1)中的ssdna-nnt复合物，搅拌均匀后静置3h；(3)将步骤(2)中产物离心后收集固体，使用去离子水洗涤，重复2次后将固体涡旋分散均匀，得到混合液m1；(4)将硝酸钴溶解于乙醇与水的混合溶液，搅拌的同时加入步骤(3)中的混合液m1，反应10min后离心收集固体，将其离心洗涤三次后加入hepes分散溶解，得到最终产物。2.根据权利要求1所述的烟酰胺核糖磷酸转移酶的封装工艺，其特征在于：所述步骤(1)中，nnpt与ssdna的质量比1:0.1-1：1.0，ssdna的长度为20-60base，nnpt与tcep的质量比为1:0.01-1:0.05，nnpt与smcc的质量比为1:0.1-1:1.0。3.根据权利要求1所述的烟酰胺核糖磷酸转移酶的封装工艺，其特征在于：所述步骤(1)中，离心超滤所用离心管的截留分子量为10k。4.根据权利要求1所述的烟酰胺核糖磷酸转移酶的封装工艺，其特征在于：所述步骤(2)中，ssdna-nnt复合物与ctab的质量比为1:0.01-1：0.05，复合物与2-甲基咪唑的质量比为1:5-1:20，复合物与醋酸锌的质量比为1:1-1:10。5.根据权利要求1所述的烟酰胺核糖磷酸转移酶的封装工艺，其特征在于：所述步骤(4)中，乙醇和水的体积比为1:1-1:5，硝酸钴的加入量为溶液质量的0.1％到1.0％。所用hepes的ph为7.4。

技术总结
一种烟酰胺核糖磷酸转移酶的封装工艺，包括步骤：(1)将单链DNA(ssDNA)与三(2-羧乙基)膦(TCEP)、烟酰胺核糖磷酸转移酶(NNPT)与4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸-3-硫代-N-琥珀酰亚胺脂内盐(SMCC)混合反应3h，记为ID1与ID2，离心超滤纯化再将ID1与ID2混合反应12h并离心超滤纯化。(2)在十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)与2-甲基咪唑水溶液中加醋酸锌，搅拌溶解加入(1)中ssDNA-NNT复合物静置3h。(3)将(2)中产物离心收集固体，去离子水洗涤，重复2次得混合液M1。(4)硝酸钴溶解于乙醇与水的混合溶液，搅拌并加入混合液M1，反应10min离心收集固体，将其离心洗涤三次后加入HEPES分散溶解。合成的固定化酶具有较好的热稳定性与重复使用性，提高NMN合成过程中物料利用率。提高NMN合成过程中物料利用率。提高NMN合成过程中物料利用率。


技术研发人员：陆致贤 陈鑫
受保护的技术使用者：浙江维泰生物技术有限公司
技术研发日：2022.12.20
技术公布日：2023/7/11