人源广谱抗菌肽及其应用

1.本发明涉及生物技术领域，特别是涉及人源广谱抗菌肽及其应用。


背景技术：

2.抗菌肽是一类对多种病原体(细菌、真菌、病毒和寄生虫等)有防御抑制作用的碱性小分子物质。与传统的抗生素相比，抗菌肽的作用更稳定，产生耐药性的倾向更低。尽管抗菌肽具有很高的应用价值，但抗菌肽氨基酸链的长短及复杂性导致了其合成成本较高，且提取过程繁琐，这限制了其在食品工业的应用及科学研究。为了解决这些问题，急需开发出新型的抗菌肽作为抗生素的替代品来对抗超级细菌，以促进人类健康。
3.cathelicidins抗菌肽家族中人源抗菌肽ll-37是人类先天免疫中必不可少的宿主防御分子。对抗菌肽ll-37的研究中，片段kr-12(ll-37的第18-29位残基)是ll-37中氨基酸链最短、分子量最小的抗菌肽。然而kr-12的抑菌谱较窄，对金黄色葡萄球菌没有抑制作用。因此，筛选具有广谱抑菌活性的短链抗菌肽对于解决现存技术问题非常重要。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供人源广谱抗菌肽及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明以截取于人源抗菌肽ll-37的短肽kr-12为模板，根据短肽kr-12的抑菌谱较窄等特性进行设计与改造，筛选出了具有广谱抑菌活性的短链抗菌肽。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供抗菌肽，所述抗菌肽的氨基酸序列为seq id no：1所示的人源抗菌肽的短肽序列，其中，该短肽序列的第5位的谷氨酰胺替换为丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸或异亮氨酸中的任意一种，且第9位天冬氨酸替换为赖氨酸或精氨酸。
7.优选的是，所述抗菌肽的氨基酸序列如seq id no：2-13所示的任意一条。具体序列为：krivarikkflr(kk-a，seq id no：2)、krivlrikkflr(kk-l，seq id no：3)、krivfrikkflr(kk-f，seq id no：4)、krivwrikkflr(kk-w，seq id no：5)、krivvrikkflr(kk-v，seq id no：6)、krivirikkflr(kk-i，seq id no：7)、krivarikrflr(kr-a，seq id no：8)、krivlrikrflr(kr-l，seq id no：9)、krivfrikrflr(kr-f，seq id no：10)、krivwrikrflr(kr-w，seq id no：11)、krivvrikrflr(kr-v，seq id no：12)及krivirikrflr(kr-i，seq id no：13)。
8.本发明还提供所述的抗菌肽在制备抑菌剂中的应用，所述抑菌剂包括抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的菌剂，所述革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、沙门氏菌和坂崎肠杆菌，所述革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌。
9.本发明还提供所述的抗菌肽在制备治疗腹膜炎感染的药物中的应用。
10.本发明还提供一种抑菌剂，包括所述的抗菌肽。
11.本发明还提供一种治疗腹膜炎感染的药物，包括所述的抗菌肽。
12.本发明公开了以下技术效果：
13.本发明所设计的抗菌肽，是在母肽kr-12(krivqrikdflr)的基础上进行定点突变得到了12种新的抗菌肽，经试验发现，12种新的抗菌肽具有广谱抑菌活性并且均显著高于母肽，且基本无细胞毒性。其中，最小抑菌浓度的几何平均数(gm)为6.25，所得到肽的治疗指数(ti)为40.99。在体外实验中，最佳生物活性的目标肽为kk-i，kk-i在生理盐浓度和蛋白酶环境中仍保持良好的抗菌活性，并具有一定血清稳定性，具有较高应用价值；在体内实验中，kk-i表现出了抑制大肠杆菌生长并减轻炎症的作用。本发明为人源抗菌肽的设计提供了新的思路，短链的选择也节约了抗菌肽的合成成本，也为研制新型的抗菌药物提供了有效候选肽。
附图说明
14.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
15.图1为模板肽与目标肽α-螺旋轮结构图；kr-12代表母肽，1-12分别代表kk-a、kk-l、kk-f、kk-w、kk-v、kk-i、kr-a、kr-l、kr-f、kr-w、kr-v和kr-i；
16.图2a-图2m分别为母肽kr-12以及目标肽kk-a、kk-l、kk-f、kk-w、kk-v、kk-i、kr-a、kr-l、kr-f、kr-w、kr-v和kr-i的色谱图；
17.图3a-图3m分别为模板肽kr-12以及目标肽kk-a、kk-l、kk-f、kk-w、kk-v、kk-i、kr-a、kr-l、kr-f、kr-w、kr-v和kr-i的质谱图；
18.图4为模板肽与目标肽在三种不同环境中的圆二色谱图；kr-12代表母肽，1-12分别代表kk-a、kk-l、kk-f、kk-w、kk-v、kk-i、kr-a、kr-l、kr-f、kr-w、kr-v和kr-i；
19.图5为经fitc标记的肽kk-i处理后的e.coli atcc 25922和s.aureus atcc 29213激光共聚焦和超高分辨荧光显微图像；a(1)-a(4)、b(1)-b(3)分别为e.coli atcc 25922的激光共聚焦和超高分辨荧光显微图像，a(5)-a(8)、b(4)-b(6)分别s.aureus atcc 29213激光共聚焦和超高分辨荧光显微图像；
20.图6为肽kk-i处理后e.coli atcc 25922和s.aureus atcc 29213的sem及tem图像；a-a3为e.coliatcc25922的sem图；b-b3为e.coliatcc25922的tem图；c-c3为s.aureus atcc 29213的sem图；d-d3为s.aureus atcc 29213的tem图；
21.图7为小鼠血清中天冬氨酸转氨酶(ast)、丙氨酸氨基转移酶(alt)、碱性磷酸酶(alp)和血尿素氮(bun)的浓度；
22.图8为小鼠各组织菌落数；
23.图9为抗菌肽对小鼠血清肿瘤坏死因子tnf-α、il-6和il-1β水平的影响。
具体实施方式
24.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
25.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发
明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
26.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
27.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
28.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
29.实施例1广谱抗菌肽的序列设计
30.以人源短肽kr-12为模板肽，根据抗菌肽kr-12氨基酸序列(krivqrikdflr)特点，用带正电荷的赖氨酸(lys)替换负电荷天冬氨酸(asp)，同时，将亲水氨基酸谷氨酰胺(gln)替换为疏水性氨基酸异亮氨酸(ile)，设计得到12条抗菌肽。模板肽和目标肽kk-i的氨基酸序列及理化参数如表1所示。肽序列的两亲性用α-螺旋轮图表示，如图1所示。
31.表1目标肽的氨基酸序列及理化参数
[0032][0033][0034]
注：a：通过质谱仪测定；b：疏水性；c：平均疏水力矩
[0035]
从模板肽kr-12分子的α-螺旋轮图可以看出，kr-12形成了两亲性α螺旋结构，亲水残基在螺旋轮的一侧，疏水残基聚合到螺旋轮的另一侧；经氨基酸替换后的设计肽的α-螺旋结构是亲水氨基酸的一侧中含有疏水性氨基酸，另一侧全部是疏水性氨基酸，从而形成
了非完美两亲性结构。为了保证肽段的高抗菌活性和稳定性，所有短肽的c末端均被酰胺化。
[0036]
实施例2固相合成法制备抗菌肽
[0037]
1、抗菌肽的合成
[0038]
称取适量树脂，加入二氯甲烷浸泡5min，n,n-二甲基甲酰胺清洗之后抽掉二氯甲烷，然后用配制好的去保护剂去除树脂上的fmoc保护基团(脱帽)，脱帽时间20min；称取c端第二个氨基酸，加缩合剂，n,n-二甲基甲酰胺，放入反应柱中反应(鼓气)；利用茚三酮法进行检测，检测结果为溶液亮黄，树脂透明，无杂色；用去保护液去除第2个氨基酸上面的fmoc保护基团，n,n-二甲基甲酰胺清洗6次，重复操作剩下的氨基酸直到最后一个氨基酸；用去保护液，去除最后一个上面的fmoc保护基团，然后用n,n-二甲基甲酰胺清洗；反应结束后分别用二氯甲烷，甲醇洗涤收缩；用裂解液切多肽，用乙醚析出液体；用质谱仪(ms)和高效液相色谱仪(hplc)分析，进行纯化。
[0039]
2、抗菌肽的纯化
[0040]
(1)预分析：取适量样品放入0.5ml管中，用超纯水溶解。用0.45μm膜过滤样品，然后用快速梯度高效液相色谱(10～100％)分析样品进样分析；
[0041]
(2)样品处理：在20ml烧杯中加入200mg样品，再加入15ml h2o和5ml甲醇(methanol)。超声样品直至样品完全溶解，然后用0.45μm膜过滤溶液；
[0042]
(3)高效液相色谱(hplc)：0～25min收集样品，a泵是100％乙腈(acetonitrile)加0.1％三氟乙酸(trifluoroacetic acid)，b泵100％水加0.1％三氟乙酸(trifluoroacetic acid)。用高效液相色谱(hplc)分析收集的组分，检查纯度。
[0043]
模板肽与目标肽纯化后色谱图如图2a-图2m所示。图2a-图2m表明每条设计肽均有明显的吸收峰。纯化后的肽纯度达到95％以上。
[0044]
3、抗菌肽的鉴定
[0045]
通过lc 6000型反相制备色谱仪、waters 2000质谱仪对纯化后的多肽进行收集以及目标峰的鉴定，最后分析实际肽分子量及纯度。纯化后肽的质谱分析如图3a-图3m所示。
[0046]
实施例3抗菌肽kk-i二级结构及生物活性测定
[0047]
1、抗菌肽二级结构的测定
[0048]
采用圆二色光谱法(cd)分别测定抗菌肽二级结构。
[0049]
在模拟的三种不同的溶液环境(水环境，原核细胞的细胞膜环境和生物膜的疏水环境)中的结构。将多肽分别溶于ph＝7.4的10mm pbs缓冲溶液，30mm十二烷基硫酸钠(sds)和50％三氟乙醇(tfe)中，配制成终浓度150μm的肽溶液备用。将配制完成的多肽溶液加入比色皿(光径：1mm)中，室温条件用圆二色光谱仪在波长范围190nm～250nm内扫描，测定多肽的椭圆率(分辨率0.5nm，带宽1.0nm，扫描速度为每分钟10nm，石英样品池的光程为0.1cm)，重复三遍读取最后取平均值。按如下公式转换并计算其平均椭圆率：
[0050][0051]
其中θm：平均残基椭圆率(deg.m2.dmol-1)，θ
obs
：实际测得的椭圆率(mdeg)，c：肽样品浓度(mm)，l：光径长度(mm)，n：肽的氨基酸个数。
[0052]
α-螺旋率的计算公式如下：
[0053][0054]
其中θ
222
是肽样品在222nm处的平均残基椭圆率；θ
100
是肽样品在222nm处，100％螺旋率时的平均残基椭圆率；θ0是肽样品在222nm处，无螺旋结构时的平均椭圆率。结果如图4及表2所示。
[0055]
表2肽在三种不同溶液环境下的螺旋率
[0056][0057][0058]
在pbs条件下模板肽和12条目标肽均表现为无规则卷曲结构。在sds条件下，肽kk-f、肽kk-w、肽kr-l、肽kr-f、肽kr-v和肽kr-i，在222nm处没有明显的负吸收峰出现，所以这6条肽为无规则卷曲。其余6条短肽在195nm和198nm处出现正吸收峰，在205nm和222nm时均有负吸收峰出现，所以这6条肽在模拟的带负电荷原核细胞环境中均为α-螺旋结构。在tfe条件下，12条设计肽均出现α-螺旋结构特征的吸收峰，说明这12条肽在模拟的疏水环境中均为α-螺旋结构，符合螺旋轮结构设计要求。
[0059]
2、抗菌活性的测定
[0060]
最小抑菌浓度(mic)的确定：采用微量二倍稀释法进行抗菌活性的测定，首先将冻存的细菌划线，挑取单菌落，纯化后接种在mhb培养基，置于摇床(168rpm，37℃)孵育至对数生长期，调整菌液浓度大约1
×
105cfu/ml左右。然后在96孔板的第1列孔中加入90μlbsa溶液，其余7列每孔加入50μlbsa溶液，第1列孔中再加入10μl的肽储备液(2.56mm)，用移液枪微型枪头搅拌均匀。将第1列的混合液吸取50μl加入到第2列孔中，再将第2列混合液混匀吸取50μl，加入第3列孔中，以此类推，直至加到第10列孔中，混匀吸取50μl弃至废液瓶中。接着在第1至第11列孔加入50μl对数成长期的菌液，在第12列加入50μlmhb，将96孔板1-12列液体搅拌混匀。此时从第1列至第10列，将抗菌肽浓度依次稀释为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μm。第11列加菌液，未加抗菌肽为阳性对照组；第12列未加菌液和抗菌肽为阴性对照组。每个肽样品测试至少重复3-4次。注意，在整个试验操作过程中，第12列孔，阳性对照组若保持澄清，则未受细菌污染；若浑浊，则受细菌污染，应重新进行上述操作步骤。抗菌肽
对受试菌的最小抑菌浓度值为孔(第1列-第10列)中无肉眼可见混浊或沉淀的临界孔所对应的浓度值。
[0061]
最小杀菌浓度(mbc)的确定：在mic测定结束后从无肉眼可见培养液混浊孔取10μl样品，涂布mha培养基，37℃孵育培养18h后，进行菌落计数。杀死99.9％细菌的最小肽浓度为该肽的最小杀细菌浓度。以上试验独立重复三遍。结果如表3，表4所示。
[0062]
表3短肽对革兰氏阴性细菌的mic(mbc)值(μm)
[0063][0064]
表4短肽对革兰氏阳性细菌的mic(mbc)值(μm)
[0065][0066]
短肽kr-12对革兰氏阴性菌的抑菌活性比对革兰氏阳性菌强。通过替换阳离子氨基酸和疏水性氨基酸设计的12条目标太对革兰氏阴性菌和阳性菌均表现出比模板肽强的抑菌活力，且12条设计肽所测定的mbc值是其mic值的1～4倍。说明短肽的疏水性和电荷数
的适当增加提高短肽的杀菌性能和抑菌广谱性。
[0067]
3、溶血活性的测定
[0068]
取健康的人血液1～2ml保存于肝素钠管中，1000g，4℃条件下，离心10min后弃去上清，收集血红细胞。继续用pbs洗涤3遍后，重悬，备用。将抗菌肽液倍比稀释后与等体积的血红细胞混合于96孔细胞板中置于37℃恒温培养4h后，96孔板离心机离心(1000g，15min)，将上清液转移至新的96孔板中后，用酶标仪od
570nm
测定吸光度。阴性对照为未处理的血细胞，阳性对照为0.1％triton x-100处理的血细胞，最小溶血浓度(mhc)定义为引起10％溶血活性所对应的最小多肽浓度。
[0069]
表5短肽的mhc、gm(μm)和ti值
[0070][0071]
注：a：引起10％溶血的肽浓度为最小溶血浓度，当溶血浓度＞128μm时，用256μm计算；b：肽的mic值的几何平均数，当＞64μm时，用128μm计算；c：ti＝mhc/gm，治疗指数(ti)越大说明细胞选择性越强。
[0072]
12条设计肽的gm值均小于短肽kr-12，说明含有6个正电荷的短肽的抗菌活性要明显优于含有4个正电荷的短肽，非完美两亲性的结构也不同程度上提高了短肽的抑菌能力。肽kk-i的gm(gm＝6.25)值最小，治疗指数ti(ti＝40.99)最大，治疗指数越大说明细胞选择性越强。所以筛选出具有强抑菌活性的肽kk-i作为具有临床应用潜力的短肽进行深入的抑菌机理的研究。
[0073]
4、抗菌肽稳定性研究
[0074]
(1)盐离子稳定性
[0075]
用bsa稀释液按不同浓度配制盐离子溶液，盐离子浓度分别为150mm nacl，4.5mm kcl，1mm mgcl2，6μm nh4cl，8mm zncl2，4mm fecl3和2.5mm cacl2，空白对照为未经盐离子处理的抗菌肽，以此检测抗菌肽在不同盐离子浓度下的稳定性。结果如表6，表7所示。
[0076]
表6在盐离子处理下短肽对e.coilatcc25922的mic值(μm)
[0077][0078]
表7盐离子处理下短肽对s.aureus atcc29213的mic值(μm)
[0079][0080]
(2)血清稳定性
[0081]
同上述盐离子稳定性的方法来测定抗菌肽在血清中的稳定性，用bsa稀释液制备不同浓度的胎牛血清，最终血清浓度为50％、25％和12.5％。空白对照为未经血清处理的肽，以此检测抗菌肽在不同血清浓度下的稳定性。结果如表8、表9所示。
[0082]
表8血清环境中肽对e.coilatcc25922的mic值(μm)
[0083][0084][0085]
表9血清环境中肽对s.aureus atcc29213的mic值(μm)
[0086][0087]
(3)酶稳定性
[0088]
为了测定抗菌肽在酶处理下的稳定性，配制终浓度为1mg/ml的胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶k的酶-抗菌肽反应液，两者作用1h后，按照盐离子和血清稳定性的测定方法进行试验，空白对照为未经蛋白酶处理抗菌肽。以此检测抗菌肽在不同酶处理下的稳定性。结果如表10所示。
[0089]
表10不同酶处理下肽的最小抑菌浓度
[0090][0091]
以上结果表明，12条目标肽在生理浓度盐离子及高浓度血清环境中仍具有良好的抗菌活性，表明其具有较高的盐离子和血清稳定性。此外，在不同酶处理条件下基本能保持抗菌活性。盐离子溶液处理下肽kk-i对e.coli atcc25922和s.aureus atcc29213的抑菌性比其他设计肽稳定，具有较好的耐盐离子的稳定性，具有一定临床应用潜力。
[0092]
实例4抗菌肽的抑菌机理
[0093]
1、fitc标记多肽定位试验
[0094]
将1
×
mbc浓度的fitc标记肽与菌液混合在37℃条件下孵育15min，6000～8000g离心5min，弃去上清。用pbs洗涤三遍后重悬，加入终浓度为10μg/ml碘化丙啶(pi)在4℃条件下孵育15min后，离心洗去游离的pi。上述操作完毕后，制片。4℃过夜备用，在激发波长488nm和535nm条件下用激光共聚焦显微镜和超高分辨荧光显微镜观察。对照为未处理细胞作为。结果如图5所示。
[0095]
如图5所示，经fitc标记的抗菌肽kk-i和覆盖大肠杆菌和金黄色葡萄球菌表面的荧光绿色信号和碘化丙啶(pi)产生的红色荧光信号重叠，说明肽kk-i是通过破坏细菌膜的
完整性从而杀灭细菌。
[0096]
2、细胞膜完整性的观测
[0097]
利用扫描电镜(sem)和透射电镜(tem)对试验菌株e.coli atcc25922和s.aureus atcc29213的细胞外膜形态进行观察来研究抗菌肽对细菌细胞外膜的破坏程度。实验操作如下：
[0098]
(1)菌体制备：将冻存得细菌传至二代，培养至对数生长期，离心收集菌泥，无菌pbs冲洗三遍后重悬至od
600nm
＝0.15；(2)短肽-菌反应液处理：将短肽分别加入菌悬液中使其终浓度为1
×
mic，置于摇床37℃反应1h，未处理的菌液作为空白对照组。反应结束后，将菌液离心并弃去上清，收集细菌沉淀并用pbs(ph7.2)冲洗3～4次；(3)固定、脱水：将2.5％戊二醛(1ml)加入细菌沉淀，4℃冰箱固定12h。12h后收集菌泥，用50％、70％、90％和100％的乙醇溶液按梯度洗脱菌泥，10min/次。将100％的乙醇与叔丁醇溶液等体积混合，处理30min后离心(8000～10000g，5min)，再用纯叔丁醇处理1h于-20℃贮存；(4)干燥、镀膜：样品用冷冻干燥机冷冻干燥后在样品表面镀一层金属膜。(5)观察：用场发式扫描电镜(透射电镜)观察菌体表面变化情况。结果如图6所示。
[0099]
结果如图6所示。空白对照组图(sem：a、c图；tem：b、d图)：大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的状态完整饱满，表面平滑；细胞内部充盈丰满，结构完整。用1
×
mic的目标肽处理时，阴性和阳性细菌表面均出现孔洞；随着处理时间增加两种细菌表面孔洞加深，褶皱出现凹凸不平，大肠杆菌有断裂的迹象，金黄色葡萄球菌球状破裂；最终两种细菌均不在完整，出现细胞断裂及破碎的状态。
[0100]
实例5抗菌肽体内生物活性测定
[0101]
1、小鼠体内相容试验
[0102]
试验动物为40只6周龄雌性icr小鼠(体重24.09
±
2.648g)，购买于辽宁长生生物技术股份有限公司。适应性饲养一周，标准饲料喂养。将小鼠随机分为4组，每组10只，试验分组如表11所示。分别对小鼠进行腹腔注射10mg/kg、20mg/kg和40mg/kg的多肽溶液，每次间隔12h，注射3d。对照组为只用生理盐水处理组。在此期间不间断的观察动物的生存活力和状态。3d后，对所有小鼠进行眼球取血，随后1000g，离心10min收集血清，用试剂盒分析血清中的谷草转氨酶(ast)、谷丙转氨酶(alt)、碱性磷酸酶(alp)和血尿素氮(bun)含量。结果如图7所示。
[0103]
表11小鼠体内相容性实验
[0104][0105]
如图7所示，处理组天冬氨酸转氨酶(ast)、丙氨酸氨基转移酶(alt)和血尿素氮(bun)在肽剂量10mg/kg时与对照组相比酶水平无显著差异(p＞0.05)，肽剂量增加到20mg/kg和40mg/kg时与对照组相比，丙氨酸转氨酶(alt)水平显著性升高(p＜0.01)。随着短肽剂量的增加四种酶水平降低，最后趋于平稳，说明肽kk-i短期内在小鼠的体内有应激反应，但没有引起肝肾毒性，具有较高的生物体内相容性。从以上结果表明肽kk-i在小鼠体内表现出较好的稳定性和安全性，临床应用前景广阔。
[0106]
2、小鼠腹膜炎实验
[0107]
该试验32只6周龄雌性icr小鼠(体重：24.88
±
1.43g)购买于辽宁长生生物技术股份有限公司。每个处理组8只小鼠。适应性饲养一周后，
[0108]
对小鼠进行腹腔注射，健康组只注射生理盐水，对照组为接种100μl的1.5
×
108cfu/ml e.coliatcc25922进行腹膜炎感染。在感染0.5h、2h、6h后，分别继续用生理盐水、10mg/kg目标肽、5mg/kg庆大霉素对小鼠进行腹腔注射。观察小鼠腹腔注射后活动状态，是否在24h后继续存活。随后对所有存活小鼠进行处理，并对腹腔注射5ml无菌生理盐水溶液采集小鼠的腹膜液，同时也采集脾脏和肝脏用于菌落数分析。实验分组如表12所示。
[0109]
表12小鼠腹膜炎实验
[0110][0111]
图8表明，与对照组相比，肽kk-i处理组的各组织菌落数极显著降低(p＜0.0001)，庆大霉素组的菌落数比肽处理组显著性降低。腹腔的菌落数极显著性降低约4-log(p＜0.0001)。肝脏、脾脏、肺、肾的菌落数分别降低了2-log(p＜0.0001)，说明肽kk-i在小鼠体内的活性较稳定并保留一定的杀灭能力，从而提高了小鼠存活率。
[0112]
不同处理组小鼠血清中各炎症因子表达水平结果如图9所示。与健康组(生理盐水)相比，致病菌感染组小鼠血清中促炎因子il-1β、il-6和tnf-α表达水平较高。通过建立小鼠腹膜炎模型，对小鼠腹腔注射肽kk-i后，发现注射肽kk-i组小鼠中il-1β、il-6、tnf-α水平均显著低于致病组小鼠(p＜0.01)，说明目标肽kk-i对小鼠腹膜炎症具有一定缓解作用。
[0113]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列为seq id no：1所示的人源抗菌肽的短肽序列，其中，该短肽序列的第5位的谷氨酰胺替换为丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸或异亮氨酸中的任意一种，且第9位天冬氨酸替换为赖氨酸或精氨酸。2.如权利要求1所述的抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列如seq id no：2-13所示的任意一条。3.如权利要求1或2所述的抗菌肽在制备抑菌剂中的应用，其特征在于，所述抑菌剂包括抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的菌剂，所述革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、沙门氏菌和坂崎肠杆菌，所述革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌。4.如权利要求1或2所述的抗菌肽在制备治疗腹膜炎感染的药物中的应用。5.一种抑菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的抗菌肽。6.一种治疗腹膜炎感染的药物，其特征在于，包括权利要求1所述的抗菌肽。

技术总结
本发明公开了人源广谱抗菌肽及其应用，属于生物技术领域。本发明选择人源抗菌肽LL-37的短肽KR-12为模板肽，根据短肽KR-12的抑菌谱较窄等特性进行设计与改造，所得到的12条目标肽，氨基酸序列如SEQ ID NO：2-13，经实验验证发现12条目标肽均具有广谱的抑菌活性，基本无细胞毒性，其中，体外抗菌效果最佳的肽段(KK-I)在体内表现出了抑制大肠杆菌生长并减轻炎症的作用。本发明为人源抗菌肽的设计提供了新的思路，短链的选择也节约了抗菌肽的合成成本，也为研制新型的抗菌药物提供了有效候选肽。肽。肽。


技术研发人员：侯俊财 姜瞻梅 马月 顾丽雅 张静
受保护的技术使用者：东北农业大学
技术研发日：2023.08.24
技术公布日：2023/10/15