一种烤烟粉末全基因组提取方法及提取试剂盒与流程

1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种烤烟粉末全基因组提取方法及提取试剂盒。


背景技术：

2.植物样本本身存在较多杂质，如多糖、多酚、色素、蛋白等，因此在提取植物全基因组dna时常受到以上杂质的影响，进而使得提取到的基因组dna质量降低，产量减少。常见的植物全基因组dna提取方法有ctab法、sds法、氯化节法、果胶酶法及高盐低ph法。
3.烘烤后的烟叶粉末作为一种极其特殊的植物样本，由于其经过高温处理，基因组dna会发生严重降解，除上述提到的植物样本常见杂质以外，同时伴有许多副产物产生，包括烟碱、焦油等，进一步提高了烟末全基因组dna的分离纯化难度，尤其是对于保存时间较长的烟末样本，常见植物dna提取方法极难提取到主带单一的全基因组dna。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术中的不足，本发明的目的一在于提供一种烤烟粉末全基因组提取方法。
5.本发明的再一目的是提供一种烤烟粉末全基因组提取试剂盒。
6.本发明的另一目的是提供上述提取试剂盒在烤烟粉末全基因组提取方面的应用。
7.为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：一种烤烟粉末全基因组提取方法，包括以下步骤：步骤一、取烟末50~70mg，粉碎后转移至ep管中，加入450μl裂解液和10μl蛋白酶k，混合均匀；所述裂解液中包含0.2~4m ctab、1~50mm sds、0.01%~2% peg500、15~100mm tris-hcl和10~110mm edta；步骤二、将ep管置于恒温水箱中65℃温育30~60min后取出，加入500μl离心缓冲液，12000rpm离心10min；所述离心缓冲液中包含0.1~0.5m磷酸二氢钾、0.1~0.5m磷酸氢二钠、0.5~2%氯化钠、0.5~2%氯化钾和0.1~0.5%吐温-20；步骤三、取100μl经步骤二离心后的上清液于新的ep管中，加入100~300
µ
l提取缓冲液，室温反应5min后，再向其中加入10
µ
l振荡混匀的磁珠a和300
µ
l异丙醇，颠倒混匀，将ep管置于磁力架上，静置至磁珠全部吸附至管壁，吸弃管内液体；所述提取缓冲液中包含1~4m 乙酸钾、85~120mm tris-hcl、80~150mmedta和1%~5% sds；步骤四、移去磁力架，加入1ml洗涤液1，振荡混匀；将ep管置于磁力架上，静置至磁珠全部吸附至管壁，吸弃管内液体；所述洗涤液1中包含30%~80%异丙醇、0.01%~2% peg500和0.1%~2% nacl；
步骤五、 移去磁力架，加入1ml洗涤液2，振荡混匀；将ep管置于磁力架上，静置至磁珠全部吸附至管壁，吸弃管内液体；所述洗涤液2为80%乙醇；步骤六、重复步骤五，打开管盖晾干5min；步骤七、移去磁力架，加入100
µ
l洗脱液a，轻弹ep管使磁珠全部浸润在液体中，40℃水浴10min，每隔2-3min轻摇ep管混匀；所述洗脱液为超纯水，其内包含15~100mm tris-hcl和10~110mm edta；步骤八、将ep管置于磁力架上，静置至磁珠全部吸附至管壁，吸取上清至一新的ep管，即得到基因组dna。
8.作为对上述提取方法的进一步优化，步骤二中，所述离心缓冲液中包含0.5m磷酸二氢钾、0.1m磷酸氢二钠、0.9%氯化钠、1.2%氯化钾和0.2%吐温-20。
9.作为对上述提取方法的进一步优化， 步骤三中，所述提取缓冲液中包含4m 乙酸钾、120mm tris-hcl、80mm edta和1% sds。
10.一种烤烟粉末全基因组提取试剂盒，包含裂解液、离心缓冲液、提取缓冲液、洗涤液1、洗涤液2和洗脱液；所述裂解液中包含0.2~4m ctab、1~50mm sds、0.01%~2% peg500、15~100mm tris-hcl和10~110mm edta；所述离心缓冲液中包含0.1~0.5m磷酸二氢钾、0.1~0.5m磷酸氢二钠、0.5~2%氯化钠、0.5~2%氯化钾和0.1~0.5%吐温-20；所述提取缓冲液中包含1~4m 乙酸钾、85~120mm tris-hcl、80~150mmedta和1%~5% sds；所述洗涤液1中包含30%~80%异丙醇、0.01%~2% peg500和0.1%~2% nacl；所述洗涤液2为80%乙醇；所述洗脱液为超纯水，内含15~100mm tris-hcl和10~110mm edta。
11.上述提取试剂盒在烤烟粉末全基因组提取方面的应用。
12.有益效果：本发明是基于ctab法，通过增加对样本的预处理步骤（包括离心预处理及提取预处理），改善烤烟粉末的dna提取效果。其中，离心预处理是通过配制特定配方的离心缓冲液，利用核酸与杂质密度梯度的存在，使得样品中的不同组分在离心过程中沉降到不同的密度梯度层中，从而去除杂质，以得到纯净核酸。提取预处理是通过配制特定配方的提取缓冲液，对残余的杂质进行萃取，以得到纯净核酸。
附图说明
13.图1是采用不同离心缓冲液提取所得基因组的凝胶对比图。
具体实施方式
14.本发明所用试剂的组成粉分别如下：裂解液：0.2~4m ctab，1~50mm sds，0.01%~2% peg500，15~100mm tris-hcl，10~110mm edta；提取缓冲液：1~4m 乙酸钾，85~120mm tris-hcl，80~150mmedta，1%~5% sds；
离心缓冲液：0.1~0.5m磷酸二氢钾、0.1~0.5m磷酸氢二钠、0.5~2%氯化钠、0.5~2%氯化钾和0.1~0.5%吐温-20；洗涤液1：30%~80%异丙醇，0.01%~2% peg500，0.1%~2% nacl；洗涤液2：80%乙醇；洗脱液：超纯水，15~100mm tris-hcl，10~110mm edta。
15.除上述外，若无特别说明，本技术所用试剂均为常规市售试剂，所用操作均为常规技术手段。
16.提取烤烟全基因组的操作方法如下，以下操作步骤是以从50mg～70mg烤烟粉末中提取全基因组dna为例：1. 取烟末50mg～70mg，粉碎后转移至1.5ml ep管中，加入450
µ
l裂解液和10
µ
l蛋白酶k，混合均匀（可用漩涡振荡器，1200～1800rpm）。
17.2. 将ep管置于恒温水箱中65℃温育30~60min。将ep管从温育设备中取出，向其中加入500μl离心缓冲液，12,000rpm离心10min。
18.3. 取100
µ
l上清液于新的ep管内，加入100~300
µ
l提取缓冲液，室温反应5min后，再向其中加入10
µ
l振荡混匀的磁珠a和300
µ
l异丙醇，颠倒混匀5min。将ep管置于磁力架上，静置至磁珠全部吸附至管壁，吸弃管内液体。
19.4. 移去磁力架，加入1ml洗涤液1，振荡混匀2min，若有团状或丝状物可增加震荡时间及力度。
20.5. 将ep管置于磁力架上，静置至磁珠全部吸附至管壁，吸弃管内液体。
21.6. 移去磁力架，加入1ml洗涤液2，振荡混匀2min，若有团状或丝状物可增加震荡时间及力度。
22.7. 将ep管置于磁力架上，静置至磁珠全部吸附至管壁，吸弃管内液体。
23.8. 重复步骤6和7一次，打开管盖晾干5min。
24.9. 移去磁力架，加入100
µ
l洗脱液，轻弹ep管使磁珠全部浸润在液体中，40℃水浴10min，每隔2-3min轻摇ep管混匀。其中，40℃水浴可提高核酸洗脱效率。
25.10. 将ep管置于磁力架上，静置至磁珠全部吸附至管壁，吸取上清至一新的ep管，即得到基因组dna。
26.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
27.实施例1 一种烤烟粉末全基因组提取方法1. 取烟末60mg，粉碎后转移至1.5ml ep管中，加入450
µ
l裂解液和10
µ
l蛋白酶k，混合均匀（可用漩涡振荡器，1200～1800rpm）。
28.其中，裂解液为2m ctab，30mm sds，1% peg500，50mm tris-hcl，80mm edta。
29.2. 将ep管置于恒温水箱中65℃温育45min。将ep管从温育设备中取出，向其中加入500μl离心缓冲液，12,000rpm离心10min。
30.其中，离心缓冲液为0.5m磷酸二氢钾、0.1m磷酸氢二钠、0.9%氯化钠、0.9%氯化钾和0.2%吐温-20。
31.3. 取100
µ
l上清液于新的ep管内，加入200
µ
l提取缓冲液，室温反应5min后，再向其中加入10
µ
l振荡混匀的磁珠a和300
µ
l异丙醇，颠倒混匀5min。将ep管置于磁力架上，静置至磁珠全部吸附至管壁，吸弃管内液体。
32.其中，提取缓冲液为4m 乙酸钾， 120mm tris-hcl，80mm edta，1% sds。
33.4. 移去磁力架，加入1ml洗涤液1，振荡混匀2min，若有团状或丝状物可增加震荡时间及力度。其中，洗涤液1为50%异丙醇，1% peg500，1% nacl。
34.5. 将ep管置于磁力架上，静置至磁珠全部吸附至管壁，吸弃管内液体。
35.6. 移去磁力架，加入1ml洗涤液2，振荡混匀2min，若有团状或丝状物可增加震荡时间及力度。其中，洗涤液2：80%乙醇。
36.7. 将ep管置于磁力架上，静置至磁珠全部吸附至管壁，吸弃管内液体。
37.8. 重复步骤6和7一次，打开管盖晾干5min。
38.9. 移去磁力架，加入100
µ
l洗脱液，轻弹ep管使磁珠全部浸润在液体中，40℃水浴10min，每隔2-3min轻摇ep管混匀。其中，洗脱液：超纯水，50mm tris-hcl，50mm edta。
39.10. 将ep管置于磁力架上，静置至磁珠全部吸附至管壁，吸取上清至一新的ep管，即得到基因组dna。
40.试验例1 不同提取缓冲液对比。
41.设置5组，每组分别采用不同的提取缓冲液，其余操作手段与实施例1相同。结果如下表1。
42.组1：冰乙酸。
43.组2（最优）：4m 乙酸钾，120mm tris-hcl，80mm edta，1% sds。
44.组3：3m乙酸钾，85mm tris-hcl，100mm edta，2% sds。
45.组4：2m 乙酸钾，100mm tris-hcl，150mm edta，3% sds。
46.组5：1m 乙酸钾，120mm tris-hcl，150mm edta，5% sds。
47.表1：不同提取缓冲液所得基因组的结果对比。
48.由上表1可知，采用冰乙酸为提取缓冲液，提取效果不太理想，提取纯度和浓度均明显低于本技术所述的提取缓冲液配方。而在本技术的配方下，组分的浓度不同，其结果也存在差异，而尤以组2效果最佳。
49.试验例2 不同离心缓冲液对比。
50.除离心缓冲液外，其余组分及操作与实施例1相同。
51.组1：生理盐水。
52.组2：1
×
pbs。
53.组3：0.1m磷酸二氢钾，0.5m磷酸氢二钠，1.5%氯化钠，1%氯化钾，0.1%吐温-20。
54.组4：0.3m磷酸二氢钾，0.3m磷酸氢二钠，2%氯化钠，0.5%氯化钾，0.3%吐温-20。
55.组5：0.4m磷酸二氢钾，0.2m磷酸氢二钠，0.5%氯化钠，2%氯化钾，0.5%吐温-20。
56.组6（最优）：0.5m磷酸二氢钾，0.1m磷酸氢二钠，0.9%氯化钠，1.2%氯化钾，0.2%吐温-20。
57.结果如下表2和图1所示。
58.表2：不同离心缓冲液所得基因组的结果对比。
59.由上表2可知，不同配方的离心缓冲液提取所得基因组在纯度和浓度方面有明显差异，尤以组6所述配方，在浓度和纯度方面表现均较好。
60.需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种烤烟粉末全基因组提取方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、取烟末50~70mg，粉碎后转移至ep管中，加入450μl裂解液和10μl蛋白酶k，混合均匀；所述裂解液中包含0.2~4m ctab、1~50mm sds、0.01%~2% peg500、15~100mm tris-hcl和10~110mm edta；步骤二、将ep管置于恒温水箱中65℃温育30~60min后取出，加入500μl离心缓冲液，12000rpm离心10min；所述离心缓冲液中包含0.1~0.5m磷酸二氢钾、0.1~0.5m磷酸氢二钠、0.5~2%氯化钠、0.5~2%氯化钾和0.1~0.5%吐温-20；步骤三、取100μl经步骤二离心后的上清液于新的ep管中，加入100~300
µ
l提取缓冲液，室温反应5min后，再向其中加入10
µ
l振荡混匀的磁珠a和300
µ
l异丙醇，颠倒混匀，将ep管置于磁力架上，静置至磁珠全部吸附至管壁，吸弃管内液体；所述提取缓冲液中包含1~4m 乙酸钾、85~120mm tris-hcl、80~150mm edta和1%~5% sds；步骤四、移去磁力架，加入1ml洗涤液1，振荡混匀；将ep管置于磁力架上，静置至磁珠全部吸附至管壁，吸弃管内液体；所述洗涤液1中包含30%~80%异丙醇、0.01%~2% peg500和0.1%~2% nacl；步骤五、 移去磁力架，加入1ml洗涤液2，振荡混匀；将ep管置于磁力架上，静置至磁珠全部吸附至管壁，吸弃管内液体；所述洗涤液2为80%乙醇；步骤六、重复步骤五，打开管盖晾干5min；步骤七、移去磁力架，加入100
µ
l洗脱液a，轻弹ep管使磁珠全部浸润在液体中，40℃水浴10min，每隔2-3min轻摇ep管混匀；所述洗脱液为超纯水，其内包含15~100mm tris-hcl和10~110mm edta；步骤八、将ep管置于磁力架上，静置至磁珠全部吸附至管壁，吸取上清至一新的ep管，即得到基因组dna。2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤二中，所述离心缓冲液中包含0.5m磷酸二氢钾、0.1m磷酸氢二钠、0.9%氯化钠、1.2%氯化钾和0.2%吐温-20。3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤三中，所述提取缓冲液中包含4m 乙酸钾、120mm tris-hcl、80mm edta和1% sds。4.一种烤烟粉末全基因组提取试剂盒，包含裂解液、离心缓冲液、提取缓冲液、洗涤液1、洗涤液2和洗脱液；其特征在于：所述裂解液中包含0.2~4m ctab、1~50mm sds、0.01%~2% peg500、15~100mm tris-hcl和10~110mm edta；所述离心缓冲液中包含0.1~0.5m磷酸二氢钾、0.1~0.5m磷酸氢二钠、0.5~2%氯化钠、0.5~2%氯化钾和0.1~0.5%吐温-20；所述提取缓冲液中包含1~4m 乙酸钾、85~120mm tris-hcl、80~150mm edta和1%~5% sds；所述洗涤液1中包含30%~80%异丙醇、0.01%~2% peg500和0.1%~2% nacl；
所述洗涤液2为80%乙醇；所述洗脱液为超纯水，内含15~100mm tris-hcl和10~110mm edta。5.根据权利要求4所述的提取试剂盒在烤烟粉末全基因组提取方面的应用。

技术总结
本发明提供一种烤烟粉末全基因组提取方法及提取试剂盒，属于基因工程技术领域，本发明是基于CTAB法，通过优化和改进，使其更好地适用于烤烟粉末的基因组提取。在常规方法的基础上增加了对样本的预处理步骤，主要包括离心预处理和提取预处理，所述离心预处理是通过配制特定配方的离心缓冲液，利用核酸与杂质密度梯度的存在，使得样品中的不同组分在离心过程中沉降到不同的密度梯度层中，从而去除杂质，以得到纯净核酸。提取预处理是通过配制特定配方的提取缓冲液，对残余的杂质进行萃取，以得到纯净核酸。到纯净核酸。到纯净核酸。


技术研发人员：高阁 张璐 林博楠
受保护的技术使用者：洛阳仁初医疗科技有限公司
技术研发日：2023.08.28
技术公布日：2023/10/15