最小化脱细胞组织的免疫原性的制作方法

最小化脱细胞组织的免疫原性
1.政府支持
2.本发明得到了美国国家过敏和传染病研究所资助号1r43ai114486-01a1 nih的全部或部分支持(标题：无冰冷冻保存后野生型猪组织在遗传工程改造的受者中的免疫原性)。政府对本发明拥有一定的权利。
3.相关申请的交叉引用
4.本正式申请要求2020年10月21日提交的美国临时申请号63/094,591的权益。在先申请的公开内容均通过引用其全部内容纳入本文。
技术领域
5.本公开一般涉及制备和/或保存组织以备日后使用(例如，用于在相同或不同哺乳动物中移植和/或用于进一步研究)的方法。在一些实施方式中，本公开涉及简单的直接方法，该方法使来自非人类来源的组织(如猪组织)能够在没有化学固定或抗-α-gal反应的情况下用于其他哺乳动物(如人)。本公开还提供了一种简单的直接过程，该过程使来自非人类来源的组织(例如猪供者组织，例如其中半乳糖-α(1,3)-半乳糖抗原(α-gal)表位初始可能存在或可能不存在于猪供者组织中)能够在人类中使用，并减少受者免疫反应(无化学固定或抗-α-gal反应)。


背景技术：

6.已经从来源于动物/非人类的组织(例如，来自猪或牛的来源)制备了许多植入式材料。一些可用的非人类替代组织选择，如用于心脏瓣膜(hv)和韧带置换的异种猪组织，当未经修饰时，或野生型(wt)，已知会引发超急性移植排斥反应、炎症和随后的结构恶化(mozzicato,2014；hawkins,2016)。例如，这些问题是由于受者预先形成的α-gal抗体所针对的替代组织上半乳糖-α(1,3)-半乳糖抗原(α-gal)表位的存在。与α-gal相关的并发症如此严重，以至于心血管外科医生甚至要求植入式异种移植材料的制造商通过提供不含α-gal的植入式材料，如不含α-gal的心脏瓣膜，来解决其产品中的α-gal问题(ankersmit,2017)。
7.α-gal的存在不仅限于表面结构(也是生物假体变性的原因之一)。konakci(2005)证明，α-gal包含在生物假体瓣膜的结缔组织中；mozzicato(2014)描述了三名疑似α-gal过敏的患者，其中两名患者因猪/牛主动脉瓣置换而出现免疫反应；hawkins(2016)在另外两名过敏发生后的患者中观察到生物假体过早变性。据信，由于α-gal的存在/分布，生物假体瓣膜会经历早期钙化和变性。
8.对在移植受者中α-gal反应的各种潜在触发因素的认识也在不断提高。这些潜在的触发因素可能包括给予哺乳动物来源的治疗方法(西妥昔单抗、肝素、明胶胶囊或止血剂、胶体、疫苗和hv)，或简单地吃哺乳动物的肉，如牛肉、猪肉、羊肉等(mullins,2012；chung,2008；platts-mills,2015；steineke,2015；van nunen,2018)。蜱虫叮咬引起的免疫反应也与α-gal ige滴度升高有关，其在通过食用哺乳动物食物(van nunen,2015；
commins2013)或植入生物假体hv等医疗产品(mozzicato,2014；hawkins,2016)的暴露后引发过敏反应(称为α-gal综合征(ags))—在美国东南部，多达37％的人口具有被认为过敏原阳性的抗-α-gal ige滴度(commins,2009；2011；olafson 2014)。
9.为了解决植入式产品中潜在的α-gal问题，mozzicato(2014)建议，可以考虑在具有对α-gal的ige的患者中使用脱细胞野生型心脏瓣膜(wt hv)。然而，已经证明α-gal甚至与胞外基质(ecm)结合，并且它具有化学和热稳定性。因此，仅脱细胞处理对于解决植入式产品中的α-gal问题是无效的(takahashi,2014；mullins 2012,apostolovic,2014,2016)。此外，任何强度足以从wt猪组织中去除α-gal的脱细胞策略都需要打破化学键，因而降解ecm并损害材料性质。
10.在解决潜在α-gal风险的其他策略中，用于形成植入式材料或修复受损组织的动物组织与戊二醛等试剂进行化学交联，尤其是与患者血液直接接触的动物组织组分。这种方法代表了植入式产品/材料(如生物假体瓣膜)的当前护理标准，并包括意在通过“隐藏”或“掩蔽”抗原(如α-gal)来降低免疫原性的处理步骤。这种处理被认为是防止受者排斥植入材料所必需的(例如，因为许多潜在的哺乳动物供者物种(包括，例如，新世界猴、奶牛、猪、小鼠等)在细胞和组织表面表达α-gal(joziasse,1989；larsen,1989；sandrin,1994))。虽然用戊二醛等试剂交联胶原蛋白基质可能会通过“隐藏”或“掩蔽”包括α-gal在内的抗原来降低抗原性，但不幸的是，此类处理(如戊二醛处理)可能会破坏移植物的天然再生性特性和保留残余α-ga(konakci,2005；bloch,2011；mangold,2009；2012)。
11.一些不同的研究小组还尝试使用较温和的组织洗涤方案，并在移植前消除戊二醛交联，以保持各种异种移植组织的天然和再生性特性。然而，临床结果从hv的灾难性和致命性(simon,2003；perri,2012)到血管移植物的严重性(sharp,2004；tolva,2007)和肩部修复的肌腱增大(malcarney,2005；reider,2005；walton,2007)。
12.当包括意在切割或去除α-gal的处理步骤(例如通过半乳糖苷酶)时，疝模型的临床结果得到了改善(xu,2008；2009；sandor,2008；daly,2009)。然而，通过半乳糖苷酶去除α-gal表位最多是一种表面处理，将其从厚组织基质中去除，特别是ecm，被证明是非常困难的。异种肌腱已被尝试用于恢复人acl，过去的结果主要是由于炎症反应或机械断裂而失败(van steensel,1987)。在一次尝试中，异种移植物先用半乳糖苷酶处理，然后用戊二醛处理，免疫反应较弱，但炎症持续存在，移植物失败(stone,2007a；2007b)。
13.因此，仍然需要用于组织的手术置换或修复的改进的组织，这是上述尝试所不能满足的。特别是，仍然需要使用新的、更有效的处理方法和组织来源进行改进，以消除与α-gal表位表达相关的风险，特别是在方法上的改进，这将显著增加适合用作软组织的非人类组织的数量，用于组织的外科替换或修复。


技术实现要素：

14.一种保存组织并在移植或植入保存的组织后减少免疫反应的方法，包括：从供者获得第一组织，该第一组织是野生型组织或经遗传修饰的组织；通过将第一组织浸入具有至少约75重量％的冷冻保护剂浓度的第一溶液中至少一小时以杀死和裂解第一组织的细胞来形成第二组织；通过使所述第二组织在生物反应器中经历脱细胞来去除所述第二组织的残余细胞材料，通过去除所述第二组织的所述残余细胞材料来形成第三组织；使所述第
三组织经历无冰冷冻保存，所述无冰冷冻保存包括：通过将所述第三组织和第二溶液放置在预定温度的容器中至少一小时，用冷冻保护剂浓度为至少约75重量％的所述第二溶液渗透第三组织，去除所述第二溶液并用具有至少约75重量％的冷冻保护剂浓度的第三溶液替代，在用所述第三溶液替代所述第二溶液之后密封所述容器，使得所述密封的容器包含所述第三溶液和第三组织，以及储存密封容器；和第三组织移植或植入受者，其中所述第三组织的移植或植入没有引起免疫反应，或所述受者发生的任何免疫反应都是不危及生命的。
15.附图简要说明
16.图1(即图1a和图1b)描述了关于外植体炎症的独立盲评获得的数据的说明，表明来自α-gal阴性受者的ifc玻璃化α-gal阴性和wt外植体始终具有比新鲜组织样品更低的平均值，具有许多统计学上显著的差异；图1a显示主动脉的结果，图1a显示体内2或4周后肌腱组织外植体的结果。红条表示通过t检验和单向方差分析，p＜0.05。黑条仅表示通过t检验p《0.05。如果没有显示，则没有显著差异。
17.图2(即图2a、图2b和图2c)描述了用于脱细胞的hv生物反应器的示意图；图2a是瓣膜安装系统的示意图；图2b是表示气室(1)、顺从(compliance)(2)、介质储器(3)、气滤器(4)、单向止回阀(5)、可变收缩阀(6)、压力换能器(7，9)和照相机(8)的系统的概述的图示；并且图2c是组装的生物反应器的示意图。
18.实施方式的详细说明
19.本公开一般涉及制备和/或保存组织以备日后使用(例如，用于在相同或不同哺乳动物中移植和/或用于进一步研究的目的)的方法。
20.更具体地，在本公开的一些实施方式中，来自野生型和/或遗传修饰的猪(例如gal-安全型猪)的组织可以被解剖和抗生素处理(例如，通过已知方法)。此类组织的例子包括心脏瓣膜、心包、血管、韧带、肌腱、膀胱、肠和皮肤。然后，将组织随后置于预定温度的溶液(例如室温下的vs83溶液)中预定量的足以杀死和裂解组织中的细胞的时间(例如至少约30分钟、至少约60分钟、至少约120分钟或至少约180分钟以杀死基本上所有的细胞(例如，大于90％)存在的活细胞或所有存在的活细胞(例如，通过暴露于极端条件，例如严重的渗透胁迫和/或化学细胞毒性))。
21.在实施方式中，用于杀死和裂解组织中的细胞的溶液可以含有约75％至约99％w/v的冷冻保护剂。例如，用于杀死和裂解细胞的溶液可以在载剂溶液中包含二甲基亚砜(dmso)、甲酰胺和1,2丙二醇，例如euro-collins溶液。这种溶液可以含有约75％至约99％w/v的二甲基亚砜(dmso)、甲酰胺和1,2丙二醇。二甲基亚砜的量可以在20％w/v至50％w/v之间变化。类似地，1,2丙二醇和甲酰胺的量可以各自在约10％w/v至40％w/v之间变化。然而，在全强度溶液(或将组织置入和/或渗透其中的最终溶液)中的冷冻保护剂的总量应为约75wt％或更多冷冻保护剂，例如约80％至约99％冷冻保护剂或约83％至约95％冷冻保护剂。通常，对于较大分子量的冷冻保护剂，冷冻保护剂溶液的摩尔浓度应大于约6m(每升溶液6摩尔冷冻保护剂)，对于较低分子量的冷冻保护剂更高，例如冷冻保护剂的浓度为约8m至约25m，或冷冻保护剂浓度为约10m至约20m，或冷冻保护剂的浓度为约12m至约16m。
22.在一些实施方式中，用含有4.65m dmso、4.65m甲酰胺和3.31m 1,2丙二醇[丙二醇(pg)]的euro-collins(ec)溶液的83％ cpa溶液(例如vs83)渗透组织，在一个步骤中，通过将组织与例如10-80ml vs83的ec溶液一起置于在无菌包装中(取决于组织体积)，在振荡器
上以预定温度(例如室温)下持续足以杀死和裂解组织中的细胞的预定量的时间(例如上文讨论的那些)，例如至少一小时。
[0023]
然后，在生理流动和压力条件下，使用无菌技术在生物反应器中洗涤以去除细胞材料，以去除残余的细胞材料。所用的生物反应器可以是任何合适的生物反应器，该生物反应器经过高压灭菌、预洗并在合适的温度下(例如约37℃)填充无菌缓冲溶液(如磷酸盐缓冲盐水(pbs)和抗生素)。组织将被处理预定量的时间，例如0.5至10天的处理时间，例如约1至约5天，或2至8天的处理时间，例如约3至约6天，或更长时间。然后，可以将组织冷冻保存在合适的保存溶液中，例如在vs83中。
[0024]
冷冻保存可以是无冰冷冻保存，例如在一个步骤中，通过用合适的冷冻保存溶液(例如含有4.65m dmso、4.65m甲酰胺和3.31m 1,2丙二醇[丙二醇(pg)]的euro-collins(ec)溶液的83％ cpa溶液渗透以进行无冰冷冻保存，通过将组织置于无菌聚酯袋或小瓶中，室温下置于振荡器上至少一小时。然后，可以去除冷冻保存溶液并用新鲜的vs83 cpa溶液替换，袋子被热密封，并被冷却以在高达并包括室温的任何冷藏温度下储存。
[0025]
本公开的这种方法允许来自非人类来源的组织(例如，供者组织来源，其中半乳糖-α(1,3)-半乳糖抗原(α-gal)表位可能存在或可能不存在于供者组织中)在人类中使用，并减少受者免疫反应(如抗-α-gal反应)，任选地不进行用于隐藏或掩蔽抗原的常规化学固定处理步骤。
[0026]
在实施方式中，脱细胞可以包括无去污剂的生物反应器脱细胞方法和/或化学诱导的渗透性细胞破坏和动态生物反应器去除细胞碎片的组合。
[0027]
本公开的优选实施方式之一(用于制备本公开的组织产品，如异种移植物)组合了供者组织(如组织)中不存在半乳糖-α(1,3)-半乳糖抗原(α-gal)表位的供者组织和无冰冷冻保存制剂，其在动态流动生物反应器中与无去污剂脱细胞组合减少受者免疫反应并调节组织再生。
[0028]
本公开的上述方法显著降低和/消除对经处理的同种异体组织的免疫反应。也就是说，本公开的方法集中于通过使用供者组织(例如组织)中不存在半乳糖-α(1,3)-半乳糖抗原(α-gal)表位的供者组织，然后脱细胞和无冰冷冻保存，在从考虑中消除α-gal表位后，在体外和体内降低组织免疫反应。
[0029]
此处，当人和“经处理”的异种移植物支架的细胞被破坏，细胞碎片、细胞因子和其他炎症部分没有从ecm中彻底去除时，它们都是促炎的。rieder等(2005)证明，最低水平的刺激是完全“脱细胞”的人体组织。脱细胞的猪小叶比未脱细胞的人天然肺尖提取物刺激更大的巨噬细胞反应。这一观察结果，加上脱细胞猪异种移植物在患者中的不良性能(simon,2003)导致选择人同种异体移植物组织而非异种移植物作为脱细胞技术的组织来源。美国主要的同种异体移植物hv处理者lifenet health和cryolife正在专注于脱细胞方法的开发，正在积累临床经验。
[0030]
传统的组织处理者要么用冷冻保护剂(cpa)冷冻，要么在没有cpa的情况下冷冻，脱细胞或将冷冻方法与脱细胞相结合。相反，近年来，本技术主题的发明人已经鉴定了一种在体外和体内降低组织免疫原性的cpa制剂(83％)。本发明人的各种研究结合起来提出了cpa诱导的组织免疫原性修饰的作用机制。
[0031]
本技术主题的发明人通过这些研究和附加研究发现，用冷冻保护剂溶液(例如
vs83)的组织处理可以替代基于去污剂的对于同种异体移植物的脱细胞，并且对于供者组织(例如组织)中不存在半乳糖-α(1,3)-半乳糖抗原(α-gal)表位的供者组织，这两种方法应该结合使用，这使得发明人评估猪组织在无冰冷冻保存后的炎症反应、重塑和免疫原性。
[0032]
发明人发现，在无冰冷冻保存的外植体(玻璃化-wt和玻璃化-组织)中，主动脉和肌腱中观察到的炎症显著减少(如图1所示)。图1a和1b显示了对外植体炎症的独立盲评，表明来自α-gal阴性受者的ifc玻璃化α-gal阳性和wt外植体始终具有比新鲜组织样品更低的平均值，具有许多统计学上显著的差异。主动脉(图1a)和肌腱(图1b)在体内2或4周后的组织外植体。红条表示通过t检验和单向方差分析，p＜0.05。黑条仅表示通过t检验p《0.05。如果没有显示，则没有显著差异。
[0033]
与wt主动脉外植体相比，无冰冷冻保存和衍生的主动脉的组合也导致了炎症细胞频率的显著差异。
[0034]
因此，关于本公开的方法(用于制备以后使用的组织，如异种移植物)的一个重大创新是组合了供者组织(例如供者组织中不存在半乳糖-α(1,3)-半乳糖抗原(α-gal)表位的组织(如组织))与无冰冷冻保存制剂的概念，其在动态流动生物反应器中与无去污剂脱细胞组合减少受者免疫反应并调节组织再生。
[0035]
在一些实施方式中，用于本公开的脱细胞和无冰组织保存方法的原组织/材料(例如，用于制造成无细胞支架-没有活细胞的组织移植物)可以是从经过工程改造和/或遗传修饰的动物收获的组织，例如缺乏任何功能性α-1,3-半乳糖基转移酶表达的动物。
[0036]
虽然有某些哺乳动物，如狭鼻猿(catarrhine)(人、猿和旧世界猴)，其不具有功能性ggta1基因，相应地不表达α-gal，这可以与本公开的方法组合使用，本公开的脱细胞和无冰组织保存方法的优选应用是工程改造的生物组织，例如从具有ggta1非活性(α-gal ko)的两个等位基因和在这些ge猪中检测不到α-gal的遗传工程改造(ge)的猪收获的组织。例如，这些工程改造组织可以从任何已知来源获得，例如来自revivicor股份有限公司，该公司开发了一系列α-gal ko，猪，与非工程改造的野生型(wt)猪相比，其除了遗传工程改造的性状之外的表型正常(liang,2011；fischer,2012)。此类猪可能产生抗α-gal的igm和igg(fang,2012)。
[0037]
在一些实施方式中，遗传工程改造(ge)猪可能具有ggta1非活性(α-gal ko)的两个等位基因并且α-gal不可检测(dai,2002；phelps,2003)。revivicor通过美国食品药品监督管理局兽医中心(fda,2015)基本上完成了猪的监管批准的所有必要步骤，证明了其安全性和有效性。猪的预期用途是作为各种原材料的来源，用于制造无细胞支架(无活细胞的组织移植物)，以供进一步使用(如作为植入式人用医疗产品分销)或进一步测试。来源于猪的任何组织，包括hv、心包、血管导管、血管、韧带、肌腱、膀胱、肠、皮肤和其他组织和器官，如心脏，都可以用作本公开方法中使用的材料。
[0038]
也可以在本公开的方法中使用可能已被或未被工程改造和/或遗传修饰的其他动物，例如缺乏任何功能性α-1,3-半乳糖基转移酶表达的动物，这是本领域普通技术人员已知的，并且例如描述于美国专利号7,795,493；美国申请号10/646,970、11/083,393、12/835,026、13/334,194、14/281,464、14/449,969、15/905,249、16/169,180；和
wo2014066505a1，其整体内容通过引用全文纳入此处。
[0039]
简言之，动物供者来源可以是任何动物，例如反刍动物或有蹄类动物，例如牛、猪或绵羊。在一些实施方式中，所述动物是猪。来自缺乏ggta1基因的任何功能性表达的动物的原材料/组织可以从产前、新生的、未成熟或完全成熟的动物，例如猪、牛或绵羊获得。
[0040]
在实施方式中，用于与本公开的脱细胞和无冰组织保存方法一起使用的用于制造成无细胞支架(没有活细胞的组织移植物)的原材料/组织是从其中ggta1基因的等位基因变为无活性的动物中收获的那些，使得所得ggta1酶不再能产生半乳糖α1,3-半乳糖(即在细胞表面或其他地方)。例如，用于与本公开的脱细胞和无冰组织保存方法一起使用的制造成无细胞支架(没有活细胞的组织移植物)的原材料/组织可以是从缺乏α-1,3-半乳糖基转移酶的任何功能性表达的动物中收获的那些，其中动物选自猪，牛和绵羊。
[0041]
在一些实施方式中，用于制造成与本公开的脱细胞和无冰组织保存方法一起使用的无细胞支架(没有活细胞的组织移植物)的原材料/组织可以是从其中ggta1基因的一个等位基因通过遗传靶向事件失活的动物中收获的那些原材料/组织。在本公开的另一个方面，提供了动物，其中ggta1基因的两个等位基因通过遗传靶向事件失活。在一些实施方式中，可以通过同源重组靶向基因。在其他实施方式中，基因可以被破坏，即遗传密码的一部分可以被改变，从而影响该基因区段的转录和/或翻译。例如，基因的破坏可以通过取代、缺失(“敲除”)或插入(“敲入”)技术发生。可以插入用于调节现有序列转录的所需蛋白质或调节序列的其他基因。
[0042]
在一些实施方式中，用于制造成与本公开的脱细胞和无冰组织保存方法一起使用的无细胞支架(没有活细胞的组织移植物)的原材料/组织可以是从其中ggta1基因通过至少一个点突变而变得无活性的动物中收获的那些原材料/组织。在一些实施方式中，ggta1基因的一个等位基因可以通过至少一个点突变而变得无活性。在实施方式中，ggta1基因的两个等位基因可以通过至少一个点突变而变得无活性。在实施方式中，该点突变可以通过遗传靶向事件发生。在实施方式中，该点突变可以是天然存在的。在一些实施方式中，点突变可以是ggta1基因外显子9的第二碱基处的t-至-g突变。在一些实施方式中，可以存在至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少十个或至少二十个点突变以使ggta1基因失活。
[0043]
上述来自缺乏ggta1基因的任何功能性表达的动物的原材料/组织可以从产前、新生的、未成熟或完全成熟的动物，例如猪、牛或绵羊获得。在一些实施方式中，可以对原组织进行进一步的处理或修饰。
[0044]
在一些实施方式中，用于制造成与本公开的脱细胞和无冰组织保存方法一起使用的无细胞支架(没有活细胞的组织移植物)的原材料/组织可以是从缺乏α-gal表位的任何表达的动物中提取的心脏材料/组织，其可以在没有意在隐藏或掩蔽抗原的常规化学固定处理步骤的情况下使用(目前超过一半的心脏瓣膜市场使用化学交联的猪和牛组织)。例如，来自缺乏α-gal表位任何功能性表达的动物的牛、绵羊或猪的心脏可以作为心脏材料/组织的来源。这种原心脏材料/组织的类型包括，例如，具有lpa和rpa的肺非瓣膜管、二尖瓣、主动脉瓣(也称为心房瓣)、三尖瓣、肺动脉瓣、肺补片、胸降主动脉、主动脉非瓣膜管，具有或不具有完整尖瓣的右或左肺半动脉、隐静脉、主髂动脉、股静脉、股动脉和/或半月形瓣膜。根据本公开制备的心脏瓣膜异种移植物可以具有天然心脏瓣膜异种移植的一般外观。
心脏瓣膜异种移植物也可以是瓣膜区段，例如单独的叶，每个叶都可以植入受者心脏。或者，猪心包可用于形成本公开的心脏瓣膜异种移植物，其适用于心脏开放手术或经导管瓣膜植入方法。
[0045]
在本公开的方法中，可以对上述原材料/组织进行无去污剂的生物反应器脱细胞方法和/或化学诱导的渗透性细胞破坏和细胞碎片的动态生物反应器去除的组合。
[0046]
例如，本公开的方法可以包括有效杀死和裂解组织中的细胞的方法，例如：将原(例如，解剖的和抗生素处理的)组织浸入具有至少75重量％的冷冻保护剂浓度的溶液(即，单一溶液)中，或者将脱细胞组织浸入一系列溶液中，其具有至少75质量％的冷冻保护剂浓度的最终溶液；其中将所述原组织保持预定量的足以杀死和裂解组织中的细胞的时间(例如至少约30分钟、至少约60分钟、至少约120分钟或至少约180分钟以杀死基本上所有的存在的活细胞(例如，大于90％)或所有存在的活细胞(例如，通过暴露于极端条件，例如严重的渗透胁迫和/或化学细胞毒性))。用于杀死和裂解细胞的溶液可能与以下关于组织无冰冷冻保存(ifc)所讨论的溶液相同，但需要注意的是，分子必须能够有效渗透原组织(例如，非穿透性化学品和/或不可渗透性冷冻保护剂可能无效，例如聚乙烯吡咯烷酮或羟乙基淀粉，因为大小限制阻碍了一些高分子量cpa在这方面的有效使用)。
[0047]
在一些实施方式中，通过使用冷冻保护剂浓度的单一、逐步或梯度增加来操纵冷冻保护剂的浓度升高的幅度，可以杀死原组织的大部分、基本上全部(例如，大于90％)或全部细胞。冷冻保护剂溶液的细胞毒性也可能杀死组织的细胞。冷冻保护剂溶液的细胞毒性随着组织(和溶液)温度接近37℃而增加。在实施方式中，由于冷冻保护剂溶液的细胞毒性水平增加，在这样的温度下将组织暴露于冷冻保护剂可以杀死组织的大部分、基本上全部(例如，大于90％)或全部细胞。在实施方式中，组织可以被保持和暴露于冷冻保护剂和/或溶液的温度，其在冷冻保护剂浓度中发生单次、逐步或梯度增加，以进行组织细胞的杀伤/裂解，其可以在约0℃至约37℃的范围内，例如约10℃至约37℃，或约25℃至约37℃。组织可以被浸入这种具有增加的冷冻保护剂浓度的溶液中的持续时间将是原组织质量的函数，并且可以是至少约30分钟、至少约60分钟、至少约120分钟、或至少约180分钟，或在30分钟至600分钟的范围内，在60分钟至300分钟的范围中，或在90分钟至150分钟的范围内。
[0048]
所使用的溶液的体积可以有很大的变化，例如约1至约100毫升(ml)或需要更大的，或约10至约80ml，或约10至约40ml，或约15至约25ml，基于浸入溶液中的组织的大小。
[0049]
然后，在实施方式中，这些其中所有或基本上所有(例如，大于90％)活细胞都被杀死或裂解的原组织，可以使用无菌技术被置于在生理流动和压力条件下的生物反应器中。生物反应器可以进行高压灭菌、预清洗，并填充无菌剂，如含有抗生素的pbs(例如，在37℃下)。
[0050]
本公开的方法还可以包括无冰冷冻保存(ifc)过程，该过程包括：将脱细胞组织(其中上述原组织已经脱细胞)浸入具有至少75重量％的冷冻保护剂浓度的溶液中，或者将脱细胞的组织浸入一系列溶液中，其具有冷冻保护剂浓度至少为75重量％的最终溶液；以及单一、梯度或逐步冷却步骤，其中将脱细胞组织冷却至低于第一溶液的玻璃化转变温度和-20℃之间的温度；储存步骤，其中所述脱细胞组织在低于所述冷冻保护剂溶液的玻璃化转变温度和20℃之间的温度下储存；任选的复温步骤，其中所述脱细胞组织在单个、梯度或逐步复温步骤中被升温；以及在复温步骤期间或之后发生的浸渍或洗涤步骤，其中在单个、
梯度或多个步骤中将冷冻保护剂从脱细胞组织中洗出。
[0051]
本公开的方法的简单性、多功能性和可扩展性允许具有成本效益的治疗产品的长期存储和运输、快速临床转化和市场渗透。本发明的这种方法通过提供前所未有的低成本组织获取途径，在最大程度降低免疫原性的同时保留结构和机械性质，对手术修复产生深远的临床影响。
[0052]
虽然下文的讨论主要将异种猪组织(从具有ggta1非活性(α-gal ko)的两个等位基因和在这些ge猪中不可检测到α-gal的ge猪获得)确定为通过本公开的方法作用的组织，其他器官和组织，例如，从其他ge哺乳动物收获，或甚至其它某些哺乳动物，例如狭鼻猿(人、猿和旧世界猴)，其不具有功能性ggta1基因和相应地不表达α-gal，也可以与本公开的方法使用。
[0053]
在实施方式中，本公开提供了一种简单的直接过程，其允许从ge猪收获的猪组织在人中使用，并减少受者免疫反应(例如，在没有化学固定和/或抗-α-gal反应的情况下)。例如，在一些实施方式中，本公开的方法将无冰冷冻保存(ifc)技术应用于α-gal敲除猪组织(从经遗传修饰猪中收获的)，以在没有化学固定的情况下获得用于组织置换的合适支架。
[0054]
将ifc方法与组织组合的益处提供了改进的异种组织方法，其导致组织产品的免疫原性显著降低，特别是当与无去污剂脱细胞相结合以去除残余细胞材料时(例如，在异种移植物心脏瓣膜产品的生产中)。在此种的实施方式中，工程改造的生物组织，例如从猪获得的那些生物组织，可以用作各种原材料的来源，用于制造成无细胞支架(没有活细胞的组织移植物)，用于本公开的脱细胞和无冰组织保存方法。
[0055]
在实施方式中，可以使用本领域普通技术人员已知的任何合适的生物反应器。例如，在实施方式中，可以使用图2中所示的hv生物反应器(由tedder开发，2003；2009；sierad，2010)。这是如图2a-c所示的hv生物反应器，或者类似的生物反应器可以用于脱细胞。图2a示出了示例性的瓣膜安装系统。图2b示出了表示气室(1)、顺从(compliance)(2)、介质储器(3)、气滤器(4)、单向止回阀(5)、可变收缩阀(6)、压力换能器(7,9)和照相机(8)的系统的概述。并且，图2c示出了组装的生物反应器。
[0056]
这种生物反应器由外部气泵提供动力，隔膜膨胀到泵送室中，并将驻留介质通过hv推入室。一旦循环完成，泵就释放气室中的压力，从而允许介质的静水压力向下推动膜，并在泵送室中产生较低的压力以关闭hv。所有腔室都有多个端口，便于接近压力换能器、介质采样和其他探测仪。单向阀确保介质单向流动。生物反应器可包含约800ml液体，并在系统压力和可变冲程速率下产生生理脉动流。在一个标准尺寸的细胞培养箱中可以运行多达4个生物反应器。主动脉室清晰平坦的顶部便于使用相机无阻碍地记录叶运动，从而允许通过任何数字设备不间断地远程监测hv。该系统持续测量和控制频率(bpm)、打开/关闭时间(占空比)、搏出量(stroke volume)(流速)、收缩压/舒张压、粘度、温度和气体(如果需要)。可以操作生物反应器，使得其可以通过每周手动更换培养基而保持无菌长达4周。这种生物反应器允许完全控制生理性肺或主动脉瓣状况。在涉及这种生物反应器的实施方式中，hv可以暴露于生理压力和流动条件下1-7天以进行脱细胞，或者如果需要的话更长时间，例如以实现大于99％的无dna的目标(这可以通过dna分析、组织maldi、蛋白质组学和ags患者抗体结合研究来评估(apostolovic,2014)。在一些实施方式中，脱细胞组织可以基本上无核
酸，例如90、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％无核酸。在一些实施方式中，核酸是rna。在一些实施方式中，核酸是dna。在一些实施方式中，该组织具有小于0.5ng/mg(组织的干重)的dna。在一些实施方式中，脱细胞组织具有小于0.5ng/mg(组织干重)的dna，如通过任何合适的试验测量的，例如dna试验。
[0057]
本公开的心脏瓣膜异种移植物或其区段可以由本领域技术人员使用已知的外科技术(例如，通过心脏开放手术)或微创技术(例如经导管内窥镜手术和经腔植入)植入受损的人或动物心脏中。本领域技术人员已知用于进行这种手术技术的特定仪器，其确保心脏瓣膜植入物的准确和可重复的放置。
[0058]
在一些实施方式中，本公开中使用的脱细胞过程可以是无去污剂的。在实施方式中，无去污剂的脱细胞可以包括基于物理的过程、基于化学的过程或基于生物化学的过程，前提是供者组织变成无细胞的或基本上无细胞的(即，大于99％无dna)。如有必要，还可以使用多种化学处理来完成脱细胞，包括在某些盐或酶中孵育。
[0059]
在一些实施方式中，蛋白酶抑制剂(如苯基甲磺酰氟(pmsf)、抑肽酶、亮抑酶肽和乙二胺四乙酸(edta))可与其他试剂组合使用(例如，在供者组织在动态流动生物反应器中经历无去污剂脱细胞之前、期间或之后)，以防止胞外基质降解。基于胶原蛋白的结缔组织含有蛋白酶和胶原酶作为胞外蛋白质基质中的内源性酶。此外，某些细胞类型，包括平滑肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞，在称为溶酶体的囊泡中含有许多这种酶。当这些细胞因缺氧等事件而受损时，溶酶体破裂，其内含物被释放。因此，胞外基质会受到蛋白质、蛋白聚糖和胶原蛋白分解的严重损伤。这种损伤可能是严重的，正如心脏缺血的临床病例所证明的那样，其中氧气的减少不足以导致细胞死亡，从而导致胶原基质的明显损伤。此外，胞外分解的后果是释放化学引诱剂，将包括多形核白细胞和巨噬细胞在内的炎症细胞吸引到移植物上，其意在去除死亡或受损的组织。然而，这些细胞也通过非特异性炎症反应使胞外基质破坏永久化。因此，本公开的方法可以含有一种或多种蛋白酶抑制剂，所述蛋白酶抑制剂选自n-乙基马来酰亚胺(nem)、苯甲基磺酰氟(pmsf)乙二胺四乙酸(edta)、乙二醇-双-(2-氨基乙基(醚)nnn
′n′‑
四乙酸、氯化铵、升高的ph、抑肽酶和亮抑酶肽，以防止这种损伤。
[0060]
在一些实施方式中，物理处理和化学或生物化学处理的组合可以用于生物反应器中的组织脱细胞。例如，可以使用渗透梯度、机械压缩/按摩或冻融循环来物理裂解细胞。高渗和低渗处理在水性环境中对细胞膜施加静水压力，导致细胞膜破裂并释放细胞内容物。随后细胞的内容物更容易通过等渗冲洗程序进行处理。可以使用机械压缩或按摩来促进膜降解，并逐渐使更多的细胞膜暴露于提取溶液中。如有必要，可使用冻融循环杀死细胞，然后使其细胞膜断裂，以便随后的冲洗程序可以接触到内部细胞内容物和破碎的细胞膜。
[0061]
在实施方式中，本公开中使用的脱细胞过程可以是无去污剂的。去污剂是指当它们以足够的浓度加入时形成胶束的化学物质。胶束是去污剂单体的簇，通常是球形的，其取向使得去污剂分子的非极性结构域在内部相互作用，而极性结构域在外部与水分子相互作用。去污剂可以分类为三种名称之一：离子型、非离子型和两性离子型。离子去污剂是阴离子或阳离子的。离子去污剂的亚组是胆酸盐，存在于肠道中溶解脂肪。非离子去污剂，如triton具有中性极性头基团，对蛋白质不变性。两性离子去污剂，如chaps，具有离子和非离子去污剂的特性。两性离子去污剂通常比离子去污剂温和，对蛋白质的变性比非离子去污剂更强。
[0062]
根据本发明的方法，可以使用各种溶剂用于本公开中使用的无去污剂脱细胞过程。在这方面中，可以使用任何表现出良好脱细胞性能且对胞外基质的损伤非常小的溶剂。
[0063]
本公开的用于应用于组织或脱细胞组织(以下统称为“组织”)的无冰冷冻保存(ifc)方法可包括：将组织浸入冷冻保护剂浓度至少为75重量％的溶液中，或将组织浸入一系列溶液中，最终溶液具有冷冻保护剂浓度至少为75重量％；以及单一、梯度或逐步冷却步骤，其中将组织冷却至第一溶液的玻璃化转变温度至-20℃之间的温度；储存步骤，其中将所述组织储存在所述冷冻保护剂溶液的玻璃化转变温度至-20℃之间的温度下；任选的复温步骤，其中所述组织在单个、梯度或逐步复温步骤中被升温；以及在复温步骤期间或之后发生的浸渍或洗涤步骤，其中冷冻保护剂以单个、梯度或多个步骤从组织中洗出。
[0064]“组织”在本文中是指不需要活的、有活力的细胞的任何天然或工程改造的生物胞外组织基质，包括血管化组织和无血管组织的胞外组织基质，包括血管组织，如血管，肌肉骨骼组织，如软骨、半月板、肌肉、韧带和肌腱、皮肤、心血管组织，如心脏瓣膜和心肌、牙周组织、外周神经、膀胱、胃肠道组织、输尿管和尿道。“血管”在本文中是指任何输送血液的生物管。因此，该短语指，尤其是，动脉、毛细血管、静脉、窦或工程改造的结构。
[0065]
如本文所用，术语“移植”是指任何类型的移植或植入，无论是否自体、同源或异源，是否直接进行或在组织的进一步加工后进行。
[0066]
如本文所用，术语“不危及生命”是指免疫反应，其中该反应或与其相关的并发症/情形/情况很有可能(如大于95％或大于99％)不会在预定的时间内杀死他们，如在一个月内，或在1年内或5年内。
[0067]
如本文所用，术语“玻璃化”是指没有冰晶形成的凝固。如本文所用，当组织达到玻璃化转变温度(tg)时，组织被玻璃化。玻璃化过程包括冷冻保护剂溶液的粘度随着温度的降低而显著增加，从而抑制了冰的成核和生长。在实践中，即使在少量或有限量的冰的存在下，也可以实现玻璃化或玻璃体冷冻保存，该量小于对组织造成损伤的量。
[0068]
如本文所用，“玻璃化转变温度”是指在进行该过程的条件下，溶液或制剂的玻璃化转化温度。通常，本发明的过程是在生理压力下进行的。然而，可以使用更高的压力，只要组织不会因此受到显著损伤。
[0069]
如本文所用，“生理压力”是指组织在正常功能过程中所承受的压力。因此，术语“生理压力”包括正常的大气条件，以及各种组织，如血管化组织，在舒张和收缩条件下承受的更高压力。
[0070]
如本文所用，术语“灌注”是指流体在组织中的流动。用于灌注器官和组织的技术描述于，例如，fahy等的美国专利号5,723,282，其全文纳入本文。
[0071]
如本文所用，术语“冷冻保护剂”是指化学物质，与没有冷冻保护剂的冷冻效果相比，当组织冷却至零下温度时该化学物质使组织中的冰晶形成最小化并且在升温后基本上不对组织造成损伤。
[0072]
如本文所用，术语“基本上无冷冻保护剂的组织”是指其中基本上无冷冻保护剂的组织，例如具有低于2重量％的冷冻保护剂、或具有低于1重量％的冷冻保护剂或具有低于0.1重量％的冷冻保护剂的组织。如本文所用，术语“无冷冻保护剂组织”是指其中无冷冻保护剂的组织。
[0073]
如本文所用，术语“基本上无冷冻保护剂的溶液”是指其中基本上无冷冻保护剂的
溶液，例如具有低于1重量％的冷冻保护剂的溶液、或具有低于0.5重量％的冷冻保护剂的溶液或具有低于0.1重量％的冷冻保护剂的溶液。如本文所用，术语“无冷冻保护剂溶液”是指其中无冷冻保护剂的溶液。
[0074]
如本文所用，“近似渗透平衡”是指胞内和胞外溶质浓度之间的差异不超过10％，例如胞内和胞外溶质浓度之差不超过5％。不超过10％的差异意味着，例如，如果胞外浓度为4m，则胞内溶质浓度在3.6和4.4m之间。
[0075]
可以使用各种冷冻保护剂混合物和冷却/升温条件来实现玻璃化。关键变量应针对各种特定的胞外组织基质类型和样本量进行优化。冷冻保护剂混合物的选择以及在没有过度渗透冲击的情况下添加和去除冷冻保护剂所需的平衡步骤应基于组织样品中冷冻保护剂渗透的测量动力学进行优化。冷冻取代也可以用来验证对于给定的方案已经实现了无冰保存。
[0076]
实施方式可包括单一或逐步冷却过程，例如，当组织在含有冷冻保护剂的第一溶液中在第一溶液的玻璃化转变温度和-20℃之间的温度下冷却(以恒定速率)时；以及储存步骤，其中所述组织在所述第一溶液的玻璃化转变温度和-20℃之间的温度下储存。
[0077]
单个冷却步骤也可以在降低组织温度的单一步骤中执行，其中冷却速率保持恒定，或者通过增加或减少而改变。或者，可以在逐步冷却过程中冷却组织，其中在含有冷冻保护剂的第一溶液中，在第一溶液的玻璃化转变温度和-20℃之间的第一温度下，将组织的温度降低到第一温度，然后在含有冷冻保护剂的第二溶液中进一步降低至第二温度，温度在第一溶液的玻璃化转变温度和-20℃之间，并且可以用第三、第四、第五、第六、第七等溶液重复该过程，直到达到所需温度。
[0078]
在实施方式中，第一溶液(冷冻保护剂溶液制剂)的玻璃化转变温度在约-100℃至约-140℃的范围内，例如约-110℃至约-130℃，或-115℃至约-130℃，例如约-124℃。在实施方式中，可将组织冷却并随后储存在玻璃化转变温度与约-20℃之间的温度下，例如约-120℃至约-20℃，例如约-110℃至约-30℃，或约-90℃至约-60℃。
[0079]
在冷却步骤和储存步骤期间，重要的是防止组织玻璃破裂和结冰。与其他冷冻保存方法相比，保存组织(如哺乳动物组织)的方法仅聚焦于基质保存，并且该方法不需要专门设计为将细胞保存在存活状态。
[0080]
在实施方式中，单个冷却步骤；以规律的增加或减少的间隔进行的逐步冷却过程；或在冷却过程中增加或降低冷却速率的梯度冷却步骤，可用于将组织冷却至约-60℃至约-100℃范围内的温度，例如-70℃至-90℃，例如约-80℃。
[0081]
通过使用高浓度冷冻保存溶液制剂，可以在冷冻保护剂制剂的玻璃化转变温度和约-20℃之间的温度下进行冷却和储存，而不会出现组织玻璃破裂和冰成核。在实施方式中，第一溶液包含约75重量％或更多的冷冻保护剂，例如约80％至约99％的冷冻保护剂，或约83％至约95％的冷冻保护剂。
[0082]
在浸入不含冷冻保护剂的溶液中后，可以将组织浸入含有冷冻保护剂(有灌注或无灌注)的溶液中。最终的冷冻保护剂浓度可以在逐步冷却过程中达到，在该逐步冷却过程中将组织浸入含有第一冷冻保护剂的第一溶液中，然后将组织浸入含有第二冷冻保护剂浓度(其高于第一冷冻保护剂浓度)的第二溶液中，用第三、第四、第五、第六、第七等溶液重复该过程，直到溶液达到所需浓度。冷冻保护剂溶液可以包含冷冻保护剂的任何组合。冷冻保
护剂包括，例如二甲基亚砜、1,2-丙二醇、乙二醇、n-二甲基甲酰胺和1,3-丙二醇，以及下面表1中列出的那些。
[0083]
表1
[0084][0085][0086]
不可渗透的冷冻保护剂，如聚乙烯吡咯烷酮或羟乙基淀粉，在保护快速冷却的生物系统方面可能更有效。这种试剂通常是大分子，其对溶液特性的影响比渗透压的预期影响更大。这些非渗透性冷冻保护剂中的一些对细胞膜具有直接的保护作用。然而，主要的作用机制似乎是诱导胞外玻璃化的形成。当这种冷冻保护剂以极高的浓度使用时，在冷却到低温和从低温升温的过程中可以完全消除结冰。具有已证的冷冻保护活性的不可渗透化学物质包括琼脂糖、葡聚糖、葡萄糖、羟乙基淀粉、肌醇、乳糖、甲基葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮、山梨醇、蔗糖和尿素。
[0087]
在实施方式中，冷冻保护剂溶液在载剂溶液中包含二甲基亚砜、甲酰胺和1,2-丙二醇，例如euro-collins溶液。这种溶液可以含有约75％至约99％w/v的冷冻保护剂。二甲
基亚砜的量可以在20％w/v至50％w/v之间变化。类似地，1,2丙二醇和甲酰胺的量可以各自在约10％w/v至40％w/v之间变化。然而，在全强度溶液(或将组织储存其中的最终溶液)中的冷冻保护剂的总量应为约75wt％或更多冷冻保护剂，例如约80％至约99％冷冻保护剂或约83％至约95％冷冻保护剂。冷冻保护剂在75wt％或更多的冷冻保护剂溶液(即储存组织的最终溶液)中的摩尔浓度将取决于冷冻保护剂的分子量。通常，对于较大分子量的冷冻保护剂，冷冻保护剂溶液的摩尔浓度应大于约6m(每升溶液6摩尔冷冻保护剂)，对于较低分子量的冷冻保护剂更高，例如冷冻保护剂的浓度为约8m至约25m，或冷冻保护剂浓度为约10m至约20m，或冷冻保护剂的浓度为约12m至约16m。
[0088]
冷冻保护剂溶液也可以用常规冷冻保护剂和/或天然或合成的阻冰分子修饰，例如，乙酰胺，琼脂糖，藻酸盐，丙氨酸，白蛋白，乙酸铵，抗冻蛋白，丁二醇，硫酸软骨素，氯仿，胆碱，环己二醇，环己二酮，环己三醇，葡聚糖，二乙二醇，二甲基乙酰胺，二甲基甲酰胺，赤藓糖醇，乙醇，乙二醇，乙二醇单甲醚，葡萄糖，甘油，甘油磷酸酯，单乙酸甘油酯，甘氨酸，糖蛋白，羟乙基淀粉，肌醇，乳糖，氯化镁，硫酸镁，麦芽糖，甘露醇，甘露糖，甲醇，甲氧基丙二醇，甲基乙酰胺，甲基甲酰胺，甲基脲，甲基葡萄糖，甲基甘油，苯酚，复合多元醇，聚乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮，脯氨酸，吡啶n-氧化物，棉子糖，核糖，丝氨酸，溴化钠，氯化钠，碘化钠，硝酸钠，亚硝酸钠，硫酸钠，山梨糖醇，蔗糖，海藻糖，三甘醇，乙酸三甲胺，尿素，缬氨酸和/或木糖。
[0089]
此外，在本发明的进一步实施方式中，1,2-丙二醇可以用类似浓度的2,3-丁二醇替代。类似地，二甲基亚砜可以用类似浓度的甘油或乙二醇或其组合代替。
[0090]
在实施方式中，冷冻保护剂溶液制剂可包含至少一种或多种冷冻保护剂，所述冷冻保护剂为乙酰胺、环己二醇、甲酰胺、聚乙二醇、甘油、二糖和丙二醇。
[0091]
可用于本公开的其他冷冻保护剂描述于fahy等的美国专利号6,395,467；wowk等的美国专利号6,274,303；khirabadi等的美国专利号6,194,137；fahy等的美国专利号6,187,529；fahy等的美国专利号5,962,214；calaco等的美国专利号5,955,448；meryman的美国专利号5,629,145；和/或wo 02/32225a2，其对应于khirabadi等的美国专利号6,740,484，其公开内容通过引用全文纳入本文。
[0092]
所使用的溶液的体积可以根据被保存的组织片的大小或被浸没在溶液中的组织的大小而显著变化，例如从约1至约100毫升或更大。
[0093]
在实施方式中，溶液包括水性溶液中的冷冻保护剂，例如euro-collins溶液、无菌水、盐溶液、培养基和任何生理溶液。euro-collins溶液(ec溶液)是如下表2中所述的水性溶液。
[0094]
表2
[0095][0096]
*ph＝7.4
[0097]
*毫渗量(milliosmolality)＝350-365毫渗(milliosmolal)
[0098]
合适的水性溶液的其他实例在下面的表3和表4中进行了讨论。
[0099]
表3
[0100][0101]
(注：rps-2
tm
溶液是没有cac12和也没有mgcl2的修饰的rps-2)
[0102]
表4
[0103][0104]
(注意：修饰的uw溶液#2不含hes，但
[0105]
含有比修饰的uw溶液#1更多的葡萄糖)
[0106]
冷冻保护剂溶液的载剂可以是在体外条件下保持基质完整性的任何类型的溶液。在实施方式中，载剂通常包含缓慢渗透的溶质。在实施方式中，载剂溶液是含有10mm hepes的euro-collins溶液。hepes作为缓冲剂被包括在内，并且可以以任何有效量被包括在内。此外，可以使用其他缓冲剂，也可以不使用缓冲剂。例如，替代载剂包括上面表2和表3中讨论的溶液。
[0107]
用于组织保存的冷冻保护剂溶液的最终浓度为至少75重量％的冷冻保护剂。在实施方式中，待保存的组织，例如无冷冻保护剂的组织或基本上无冷冻防护剂的组织，其可能先前暴露于或可能先前未暴露于冷冻保护剂，可以在单一步骤中浸入(或暴露于)具有至少75％(按重量计)的冷冻保护剂浓度的单个溶液中。在实施方式中，这样的单一步骤可以将组织浸入其中的溶液中的冷冻保护剂的浓度从小于1m增加到大于12m，从而将组织浸入其中的溶液中的低温保护剂浓度从小于0.5m增加到大于15m。在实施方式中，这样的单一步骤可以杀死存在的大多数活细胞或所有存在的活细胞(例如，通过暴露于极端条件，例如严重的渗透胁迫和/或化学细胞毒性)。在实施方式中，可以将组织浸入具有至少75％(按重量计)的冷冻保护剂浓度的溶液中，持续足以使冷冻保护剂渗透组织的时间，例如至少15分钟、或至少60分钟或至少120分钟。
[0108]
在将组织浸入含有足以达到至少75重量％冷冻保护剂的所需浓度的冷冻保护剂浓度的溶液中之后，将组织保持在含有至少75重量％冷冻保护剂浓度的溶液中，可以在高
达并包括室温的任何冷藏温度下冷却和储存。在一些实施方式中，维持在含有至少75重量％冷冻保护剂浓度的冷冻保护剂的溶液中的组织可以冷却和储存在-20℃和低于溶液玻璃化转变温度之间的温度下。冷却速率可为约-0.5至约-100℃每分钟。
[0109]
在实施方式中，冷却速率(用于单步骤或多步骤冷却过程)包括，例如，在约0.5至约10℃/分钟的范围内的冷却速率，例如，约2至约8℃/分子，或约4至约6℃/分钟。在实施方式中，只要避免结冰，该过程与冷却速率无关。
[0110]
组织可以在所需温度下储存一段时间，而不会破裂和结冰。
[0111]
在储存后，可以在有或没有灌注的情况下从至少75重量％的冷冻保护剂溶液中取出组织。从至少75重量％的冷冻保护剂溶液中去除组织的方法可以包括将至少75重量％的冷冻保护剂溶液中的组织缓慢升温到更高的温度。低于每分钟50℃的缓慢升温速度可用于在至少75重量％的冷冻保护剂溶液中升温组织。在实施方式中，该阶段期间的平均升温速率可以为约10-40℃每分钟，例如约25-35℃每分钟。
[0112]
在组织经过该升温过程之后，可以将组织升温到任何期望的温度，该温度足够高，使得溶液足够流动，从而可以从中去除组织。升温过程可以以任何期望的速率进行。在实施方式中，可以将组织升温到高于约-20℃、例如高于约-10℃、或达到高于约-5℃的温度，例如在约-5℃和约5℃之间。在实施方式中，只要避免结冰，该过程与升温速率无关。
[0113]
在实施方式中，可以通过改变放置含有溶液的容器(例如无菌聚酯袋或小瓶)的环境来实现升温速率。在实施方式中，可以通过将容器(例如，无菌聚酯袋或小瓶)放置在高于组织的储存温度的温度下的气体环境中来实现缓慢的升温速率。然后，为了实现快速升温速率，可以将容器(例如无菌聚酯袋或小瓶)放置在温度高于-75℃，例如大于0℃、或者在正常的大气温度下的液体中，例如二甲基亚砜(dmso)的水性溶液中。
[0114]
在实施方式中，在组织已经被升温到-65℃以上的温度之后，溶液中冷冻保护剂的浓度可以以单一、梯度或逐步的方式降低。在实施方式中，其中要降低冷冻保护剂浓度的组织(例如已经浸入至少75重量％的冷冻保护剂溶液中的组织)可以在单一步骤中浸入(或暴露于)无冷冻保护剂的溶液或基本上无冷冻保护剂的溶液中。在实施方式中，这样的单一步骤可以降低初始溶液中冷冻保护剂的浓度并形成基本上无冷冻保护剂的溶液；例如，组织浸入其中的溶液的浓度可以在单一步骤(或多个步骤)中从大于12m降低到小于1m，例如在单一步骤(或多个步骤)中从大于15m降低到小于0.1m。在实施方式中，可以将组织浸入无冷冻保护剂的溶液或基本上无冷冻防护剂的溶液中，持续足以使冷冻保护剂离开组织的时间，例如至少15分钟、或至少60分钟或至少120分钟。
[0115]
在实施方式中，可以将其中要降低冷冻保护剂浓度的组织浸入(或暴露于)溶液中，在该溶液中可以逐渐降低溶液的冷冻保护剂的浓度，例如通过使用线性或非线性浓度梯度，以实现基本上无冷冻保护剂溶液或无冷冻保护剂溶液。在实施方式中，浓度梯度是线性或非线性浓度梯度，其中具有至少75重量％的冷冻保护剂浓度的溶液逐渐被无冷冻保护剂的溶液替代。例如，具有至少75重量％的冷冻保护剂浓度的溶液可以在少于约30分钟，例如少于约10分钟，或少于约5分钟，或小于约1分钟内基本上(至少99重量％)被无冷冻保护剂的溶液代替。在实施方式中，梯度过程中的浓度变化足够慢以实现近似的渗透平衡。
[0116]
在实施方式中，以逐步的方式降低冷冻保护剂的浓度。在实施方式中，可以通过将组织浸入一系列降低冷冻保护剂浓度的溶液中以促进冷冻保护剂从组织中洗脱来实现降
低组织的冷冻保护剂的浓度。组织也可以用该溶液进行灌注。溶液的温度通常在约-15℃以上，例如在约-15℃至37℃之间，或约0℃和25℃之间。
[0117]
在实施方式中，可以降低冷冻保护剂浓度以实现特定的平台，该平台可以维持足够的时间以实现近似的渗透平衡，例如至少约10分钟，例如约15分钟。然后，冷冻保护剂浓度可以进一步降低，这可以提供也可以不提供无冷冻保护剂的溶液。如果不是，在保持该浓度足够长的时间以实现近似渗透平衡之后，可以在一个或多个步骤中再次进一步降低冷冻保护剂浓度，以最终提供无冷冻保护剂的溶液。在实施方式中，组织可以在每种溶液中浸泡至少15分钟，或长于一小时。
[0118]
为了降低冷冻保护剂浓度，冷冻保护剂溶液可以与一种类型的溶液混合，该类型的溶液类似于在向组织添加冷冻保护剂时使用的无冷冻保护剂的溶液。该溶液还可以包括至少一种渗透缓冲剂。
[0119]
如本文所用，“渗透缓冲剂”是指一种低分子量或高分子量的非渗透性胞外溶质，它在冷冻保护剂排出过程中抵消胞内浓度大于胞外浓度的冷冻保护剂的渗透效应。如本文所用，术语“非渗透性”是指这种化学物质的绝大多数分子不渗透到组织的细胞中，而是留在组织的胞外液中。
[0120]
如本文所用，“低分子量”是指例如1000道尔顿或更低的相对分子量。如本文所用，“低分子量渗透缓冲剂”的相对分子质量为1000道尔顿或更低。低分子量渗透缓冲剂包括，例如，麦芽糖、果糖1,6-二磷酸钾和钠、乳糖酸钾和钠，甘油磷酸钾和钠盐、麦芽戊糖、水苏糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、麦芽三糖、葡萄糖酸钠和钾、葡萄糖6磷酸钠和钾以及棉子糖。在实施方式中，低分子量渗透缓冲剂是甘露醇、蔗糖和棉子糖中的至少一种。
[0121]
如本文所用，“高分子量”是指，例如，大于1,000至500,000道尔顿的相对分子量。如本文所用，“高分子量冷冻保护剂和渗透缓冲剂”通常具有大于1,000至500,000道尔顿的相对分子量。高分子量渗透缓冲剂包括，例如，羟乙基淀粉(hes)、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、棉子糖十一乙酸钾(》1,000道尔顿)和ficoll(大于1,000至100,000道尔顿)。在实施方式中，高分子量渗透缓冲剂是hes，例如具有约450,000的分子量的hes。
[0122]
不含冷冻保护剂的溶液可以含有小于约500mm的渗透缓冲剂，例如约200至400mm的渗透缓冲剂。作为渗透缓冲剂，可以使用低分子量的渗透缓冲剂。在实施方式中，低分子量渗透缓冲剂是甘露醇。
[0123]
在实施方式中，冷冻保护剂可以在一系列步骤中去除，例如三个、四个、五个、六个、七个等步骤。在实施方式中，冷冻保护剂可以在一系列七个步骤中去除，其中在步骤1中，组织可以暴露于可具有所使用的最高冷冻保护剂浓度的约40％至约80％，例如约55％至约75％的浓度的冷冻保护剂溶液；在步骤2中，可以将组织暴露于可具有所使用的最高冷冻保护剂浓度的约30％至约45％，例如约35％至约40％的冷冻保护剂浓度；在步骤3中，组织可以暴露于可具有所使用的最高冷冻保护剂剂量的约15％至约35％，例如约20％至约30％的冷冻保护剂浓度；在步骤4中，组织可以暴露于可具有所使用的冷冻保护剂浓度的约5％至约20％，例如约10％至约15％的冷冻保护剂浓度；并且在步骤5中，组织可以暴露于可具有所使用的冷冻保护剂浓度的约2.5％至约10％，例如约5％至约7.5％的冷冻保护剂浓度。在上述步骤中，溶液的剩余部分可以是含有渗透缓冲剂的无冷冻保护剂的溶液。在步骤6中，基本上所有的冷冻保护剂都可以被去除并且渗透缓冲剂可以被保留。在步骤7中，可以
去除渗透缓冲剂。在实施方式中，步骤6和7可以组合在单一步骤中。例如，渗透缓冲剂可以与冷冻保护剂的剩余部分同时去除。在实施方式中，如果不使用渗透缓冲剂或者如果不去除渗透缓冲剂，则可以消除步骤7。这些浓度步骤中的每一个可以维持足够的时间以实现近似的渗透平衡，例如约10至30分钟，或15至25分钟。在实施方式中，使用无冷冻保护剂的溶液在一次或多次洗涤中去除冷冻保护剂。
[0124]
用于从组织中去除冷冻保护剂的一系列溶液的温度可以高于约-15℃，例如在约-15℃至约15℃之间、或介于约0℃至约37℃或更高温度之间，条件是该组织不暴露于变性条件下。在实施方式中，当组织处于高于约-75℃的温度时，例如高于-65℃，可以开始步骤1。在实施方式中，组织的温度可以低于在步骤1中将其浸入其中的溶液的温度，并且在冷冻保护剂去除的步骤1期间组织可以被进一步升温到高于约-15℃。
[0125]
用于洗涤组织的无冷冻保护剂的溶液可以是无菌水、生理盐水溶液(例如盐水、汉克斯平衡盐溶液、乳酸林格氏溶液或科氏溶液(krebs-henseliet solution))或组织培养基(例如洛斯维公园纪念研究所培养基、达氏改良的伊氏培养基(dmem)，伊氏培养基或培养基199)，用于组织，如哺乳动物细胞。
[0126]
洗涤次数、每次洗涤的体积和每次洗涤的持续时间可以根据组织质量和所需的最终残留化学浓度而变化。在实施方式中，最后一次洗涤(漂洗)可以在常用的医用盐溶液中，例如盐水或林格氏溶液。
[0127]
该组织可以在储存之后被进一步处理。例如，在储存之后，可以用患者细胞接种组织。因此，这些无冰保存的组织可以为制造用于医疗应用的更复杂的组织工程改造植入物提供材料。
[0128]
在第一方面，本公开涉及一种保存组织并在移植或植入保存的组织后减少免疫反应的方法，包括：从供者获得第一组织，该第一组织是野生型组织或经遗传修饰的组织；通过将第一组织浸入具有至少约75重量％的冷冻保护剂浓度的第一溶液中至少一小时以杀死和裂解第一组织的细胞来形成第二组织；通过使所述第二组织在生物反应器中经历脱细胞来去除所述第二组织的残余细胞材料，通过去除所述第二组织的所述残余细胞材料来形成第三组织；以及使所述第三组织经历无冰冷冻保存，所述无冰冷冻保存包括：通过将所述第三组织和第二溶液放置在预定温度的容器中至少一小时，用冷冻保护剂浓度为至少约75重量％的所述第二溶液渗透第三组织，
[0129]
去除所述第二溶液并用具有至少约75重量％的冷冻保护剂浓度的第三溶液替代，在用所述第三溶液替代所述第二溶液之后密封所述容器，使得所述密封的容器包含所述第三溶液和第三组织，以及储存密封容器；和第三组织移植或植入受者，其中所述第三组织的移植或植入没有引起免疫反应，或所述受者发生的任何免疫反应都是不危及生命的。在第二方面，本公开进一步涉及第一方面的方法，其中所述第一组织的来源是经遗传工程改造的猪来源。在第三方面，本公开进一步涉及前述方面中任一方面的方法，其中所述野生型组织或经遗传修饰的组织选自心脏瓣膜、心包、血管、韧带、肌腱、膀胱、肠和皮肤。在第四方面，本公开进一步涉及前述方面中任一方面的方法，其中所述第一组织、所述第二组织和所述第三组织不与戊二醛交联。在第五方面，本公开进一步涉及前述方面中任一方面的方法，其中，通过将无菌包装中的第一组织在室温下放置在振荡器上的10至80ml第一溶液中，持续足以杀死第一组织的所有活细胞的时间，在一个步骤中形成第二组织。在第六方面，本公
开进一步涉及前述方面中任一方面的方法，其中在1至5天或大于5天的时间段内，由所述第二组织形成所述第三组织，通过在生理流动和压力条件下用无菌溶液在无菌生物反应器中洗涤来去除所述第二组织的残余细胞材料。在第七方面中，本公开进一步涉及前述方面中任一方面的方法，其中所述无冰冷冻保存包括将所述第三组织和第二溶液在无菌聚酯袋或无菌聚酯小瓶中在室温下置于振荡器上至少一小时。在第八方面中，本公开进一步涉及前述方面中任一方面的方法，其中，所述无冰冷冻保存包括将所述第三组织和第二溶液在室温下在无菌聚酯袋中置于振荡器上至少一小时，然后，在用所述第三溶液替换所述第二溶液之后，对所述聚酯袋进行热密封和储存。在第九方面，本公开进一步涉及前述方面中任一方面的方法，其中所述第一组织、所述第二组织和所述第三组织各自是其中不存在半乳糖-α(1,3)-半乳糖抗原(α-gal)表位的组织。在第十方面，本公开进一步涉及前述方面中任一方面的方法，其中所述第三组织是在动态流动生物反应器中通过无洗涤剂脱细胞形成的。在第十一方面，本公开进一步涉及前述方面中任一方面的方法，其中所述第三组织99％无dna。在第十二方面，本公开进一步涉及前述方面中任一方面的方法，前述权利要求中任一项的方法，其中冷冻保护剂包含至少一种选自乙酰胺、环己二醇、甲酰胺、二甲基亚砜、乙二醇、聚乙二醇、甘油、二糖和丙二醇的分子。在第十三方面，本公开进一步涉及前述方面中任一方面的方法，其中所述冷冻保护剂溶液包含选自下组的至少一个成员：乙酰胺，琼脂糖，藻酸盐，丙氨酸，白蛋白，乙酸铵，抗冻蛋白，丁二醇，硫酸软骨素，氯仿，胆碱，环己二醇，葡聚糖，二乙二醇，二甲基乙酰胺，二甲基甲酰胺，二甲基亚砜，赤藓糖醇，乙醇，乙二醇，乙二醇单甲醚，甲酰胺，葡萄糖，甘油，甘油磷酸酯，单乙酸甘油酯，甘氨酸，糖蛋白，羟乙基淀粉，肌醇，乳糖，氯化镁，硫酸镁，麦芽糖，甘露醇，甘露糖，甲醇，甲氧基丙二醇，甲基乙酰胺，甲基甲酰胺，甲基脲，甲基葡萄糖，甲基甘油，苯酚，复合多元醇，聚乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮，脯氨酸，1,2-丙二醇，吡啶n-氧化物，棉子糖，核糖，丝氨酸，溴化钠，氯化钠，碘化钠，硝酸钠，亚硝酸钠，硫酸钠，山梨糖醇，蔗糖，海藻糖，三甘醇，乙酸三甲胺，尿素，缬氨酸和木糖。
[0130]
在第十四方面，本公开进一步涉及前十一个方面中任一方面的方法，其中所述第一溶液、所述第二溶液和所述第三溶液各自为83％的冷冻保护剂溶液，所述冷冻保护剂溶液在euro-collins溶液中含有4.65m dmso、4.65m甲酰胺和3.31m 1,2丙二醇。在第十五方面，本公开进一步涉及前述方面中任一方面的方法，其中所述野生型组织或经遗传修饰的组织是心脏瓣膜。在第十六方面，本公开进一步涉及前述方面中任一方面的方法，其中所述野生型组织或经遗传修饰的组织是肺动脉瓣。在第十七方面，本公开进一步涉及前述方面中任一方面的方法，其中所述野生型组织或经遗传修饰的组织是动脉。在第十八方面，本公开进一步涉及前述方面中任一方面的方法，其中其中密封容器在受控温度下储存。在第十九方面，本公开进一步涉及前述方面中任一方面的方法，其中其中密封容器在室温下储存。在第二十方面，本公开进一步涉及前述方面中任一方面的方法，其中其中所述密封容器在约+40℃与低于所述第三溶液的玻璃化转变温度之间的温度下储存。在第二十一方面，本公开进一步涉及前述方面中任一方面的方法，其中与从同一供者获得的相应野生型组织或经遗传修饰的组织相比，所述第三组织在人中具有降低的免疫原性，所述从同一供者获得的相应的野生型组织或经遗传修饰的组织是：仅经历脱细胞或冷冻保护剂暴露的组织，通过隐藏或掩蔽抗原实现的具有降低的免疫原性的组织，未经历脱细胞和/或冷冻保护剂暴露的组织，或未修饰的组织。
[0131]
在第二十二方面，本公开进一步涉及前述方面中任一方面的方法，与从同一供者获得的相应野生型组织或经遗传修饰的组织相比，所述第三组织在人中具有降低的免疫原性，所述从同一供者获得的相应的野生型组织或经遗传修饰的组织具有通过与戊二醛交联实现的降低的免疫原性。在第二十三方面，本公开还涉及一种降低组织免疫原性的方法，包括：从供者获得第一组织，该第一组织是野生型组织或经遗传修饰的组织；通过将第一组织浸入具有至少约75重量％的冷冻保护剂浓度的第一溶液中至少一小时以杀死和裂解第一组织的细胞来形成第二组织；通过使所述第二组织在生物反应器中经历脱细胞来去除所述第二组织的残余细胞材料，通过去除所述第二组织的所述残余细胞材料来形成第三组织；其中在被移植了预定的时间后，例如1天、1周或1年，与获取自同一供者的相应的野生型组织或经遗传修饰的组织相比，所述第三组织在人中刺激较小的免疫反应，所述获取自同一供者的相应的野生型组织或经遗传修饰的组织是：仅经历脱细胞或冷冻保护剂暴露的组织，通过隐藏或掩蔽抗原实现的具有降低的免疫原性的组织，未经历脱细胞和/或冷冻保护剂暴露的组织，或未修饰的组织。
[0132]
在第二十四方面，本公开进一步涉及前述方面的方法，其中根据炎症介质浓度来评估免疫反应，所述炎症介质是选自细胞因子、组胺、缓激肽、前列腺素和白三烯的一种或多种成员；并且人对第三组织的免疫反应导致炎症介质浓度为：不大于从相同供者获得的相应野生型组织或经遗传修饰的组织的1/3、不大于从相同供者获得的相应野生型组织和经遗传修饰的组织的1/10，或比从相同供者获得的相应野生型组织或经遗传修饰的组织低至少两个数量级。在第二十五方面，本公开进一步涉及一种保存组织的方法，包括：从供者获得第一组织，该第一组织是野生型组织或经遗传修饰的组织；通过将第一组织的细胞暴露于足以杀死和裂解第一组织的所述细胞的冷冻保护剂浓度来形成第二组织；通过使所述第二组织在生物反应器中经历脱细胞来去除所述第二组织的残余细胞材料，通过去除所述第二组织的所述残余细胞材料来形成第三组织；以及使所述第三组织经历无冰冷冻保存，所述无冰冷冻保存包括：通过将所述第三组织和第二溶液放置在预定温度的容器中至少一小时，用冷冻保护剂浓度为至少约75重量％的所述第二溶液渗透第三组织，去除所述第二溶液并用具有至少约75重量％的冷冻保护剂浓度的第三溶液替代，在用所述第三溶液替代所述第二溶液之后密封所述容器，使得所述密封的容器包含所述第三溶液和第三组织，以及储存所述密封容器。在第二十六方面，本公开进一步涉及一种保存组织的方法，包括：从供者获得第一组织，该第一组织是野生型组织或经遗传修饰的组织；通过将第一组织的细胞暴露于足以杀死和裂解第一组织的所述细胞的冷冻保护剂浓度来形成第二组织；通过使所述第二组织在生物反应器中经历脱细胞来去除所述第二组织的残余细胞材料，通过去除所述第二组织的所述残余细胞材料来形成第三组织；以及将第三组织和第二溶液放置在容器中，并存储密封的容器；其中所述第三组织在被移植之前不经历无冰冷冻保存。在第二十七方面，本公开进一步涉及前述方面中任一方面的方法，一种保存组织的方法，包括：获得第一组织，该第一组织是野生型组织或经遗传修饰的组织；通过将第一组织浸入具有至少约75重量％的冷冻保护剂浓度的第一溶液中至少一小时以杀死和裂解第一组织的细胞来形成第二组织；通过使所述第二组织在生物反应器中经历脱细胞来去除所述第二组织的残余细胞材料，通过去除所述第二组织的所述残余细胞材料来形成第三组织；以及使所述第三组织经历无冰冷冻保存，所述无冰冷冻保存包括：通过将所述第三组织和第二溶液放置
在预定温度的容器中至少一小时，用冷冻保护剂浓度为至少约75重量％的所述第二溶液渗透第三组织，去除所述第二溶液并用具有至少约75重量％的冷冻保护剂浓度的第三溶液替代，在用所述第三溶液替代所述第二溶液之后密封所述容器，使得所述密封的容器包含所述第三溶液和第三组织，并存储所述密封的容器。在第二十八方面，本公开进一步涉及前述方面的方法，其中第一组织的来源是经遗传工程改造的猪来源。在第三十方面，本公开进一步涉及第二十七方面和/或第二十八方面的方法，其中野生型组织或经遗传修饰的组织选自心脏瓣膜、心包、血管、韧带、肌腱、膀胱、肠和皮肤。在第二十九方面，本公开进一步涉及第二十七方面和/或第二十九方面的方法，其中第一组织、第二组织和第三组织不与戊二醛交联。在第三十一方面中，本公开还涉及从第二十七方面到第三十方面的任何前述方面的方法，其中，通过将无菌包装中的第一组织在室温下放置在振荡器上的10至80ml第一溶液中，持续足以杀死第一组织的所有活细胞的时间，在一个步骤中形成第二组织。在第三十二方面中，本公开还涉及从第二十七方面到第三十一方面的前述方面中任一方面的方法，其中在1至5天或大于5天的时间段内，由所述第二组织形成所述第三组织，通过在生理流动和压力条件下用无菌溶液在无菌生物反应器中洗涤来去除所述第二组织的残余细胞材料。在第三十三方面中，本公开进一步涉及从第二十七方面到第三十一方面的前述方面中的任一方面的方法，其中所述无冰冷冻保存包括将所述第三组织和第二溶液在无菌聚酯袋或无菌聚酯小瓶中在室温下置于振荡器上至少一小时。通过以下实施例可以更好地理解上述内容，提供以下实施例仅是为了说明目的，而非旨在限制本发明的范围。
实施例
[0133]
进行试验以确定vs83冷冻保存后猪组织的炎症反应、重塑和免疫原性。在α-gal敲除猪中通过皮下移植比较新鲜组织(f-wt和f-ko)和ifc组织(v-wt和v-ko)。在brockbank博士和kris helke博士(dvm，phd)的护理和指导下，将来自四窝不同产仔的10头猪交付给南卡罗来纳医科大学(musc)。运输前，从每只猪身上采集血液，以确认基因型和表型。通过lr-pcr对ggta1的两个等位基因上的遗传插入物的存在进行基因型确认。在麻醉下，8只猪对照和处理组织(主动脉和肌腱)沿着背部肌肉皮下植入，2只猪和2只wt猪提供组织样本。植入物在2或4周后与周围组织一起被取出。将外植体切成两半并用福尔马林固定。在固定24小时后，冲洗组织并将其置于缓冲溶液中。将组织送往服务实验室进行包埋、切片和h&e染色。对外植体的半定量组织病理学盲评还表明，wt和无冰玻璃化肌腱和主动脉外植体中的炎症细胞浸润减少，与未经处理的新鲜对照相比有许多显著差异(结果如图1所示)。
[0134]
还将使用来自当地食品加工厂的wt猪肺hv进行进一步的测试。将使用从revivicor的猪养殖和维护服务提供商处获得的组织进行验证性实验。将采用两个体外测试系统。在第一个测试系统中，从10％dmso冷冻保存的组织冲头(punch)中获得的条件培养基将用eurocollins溶液中的剂量增加的丙二醇、甲酰胺和dmso处理，最高可达50％(v/v)。条件培养基将使用elisa对不同激活的tgf-β同种型进行表征。在冷冻(cfc)条件培养基中，激活的tgf-β同种型释放将以潜伏性tgf-β的％表示。该测试系统将确定激活tgf-β同种型释放的各种cpa的浓度以及以何种组合。在第二个测试系统中，组织冲头将用
实验性vs83 cpa制剂+脱细胞进行冷冻保存，并与未经处理的新鲜和10％ dmso冷冻动脉冲头作为阴性对照和vs83处理的冲头进行比较。将在源自实验和对照组织的条件培养基中评估细胞因子，包括潜伏性和活性tgf-β同种型。发明人先前已经证明，vs83处理的猪组织(没有脱细胞)具有与vs83处理人组织类似的结果，导致hpbmc增殖减少，包括t记忆细胞(seifert,2015)。
[0135]
预计使用两种测试系统的结果比较将表明vs83中三种cpa的浓度和组合会影响免疫反应。与tgf-β1和β2同种型相比，tgf-β-3介导抗纤维化作用，可能影响组织重塑。因此，将对tgf-β3和-β2同种型以及tgf-β1进行测试。tgf-β同种型在哺乳动物物种间高度保守。所使用的测试系统有望发挥作用，因为cdna克隆已显示出人和猪各自序列之间的总体序列一致性(p'sporn，1987)。使用猪组织的通过甲酰胺和dmso可预期tgf-β1的剂量依赖性激活，证实了人组织的早期结果。证明猪组织细胞因子的释放与人相似(schneider,2017)将证实类似的作用机制在vs83处理的猪组织中发挥作用。
[0136][0137]
预计已脱细胞的α-gal敲除心脏瓣膜和玻璃化ifc(α-gal敲除脱细胞+v)将在体内功能出现任何结构恶化或降低时具有最小值。储存在无菌pbs中的α-gal敲除-脱细胞预计会有类似的结果，因为瓣膜在脱细胞前会暴露于cpa。由于与瓣膜ecm相关的α-gal，wt脱细胞+v组不太可能表现良好。同样，我们预计单独的wt-脱细胞会因ecm相关α-gal的存在而失败。组织支架不太可能需要基因组的其他工程改造。
[0138]
正在考虑的异种移植的进一步遗传增强是其他基因敲除，如n-甘醇基神经氨酸(neu5gc)。α-gal在细胞表面上和大多数哺乳动物组织基质中，而neu5gc似乎仅限于细胞表面。neu5gc与ags的病因无关(apostolovic，2014)。与α-gal不同，neu5gc存在于一些人对象的细胞中。在所有人中都检测到高水平的α-gal抗体，占循环igg的1-3％，然而，相应水平的抗neu5gc抗体变化很大，并且不是普遍可检测的当存在抗-neu5gc抗体时，其含量低于循环igg的0.1％。因此，不太可能需要进一步的遗传修饰。
[0139]
心脏瓣膜的采购：用于实验的wt心脏将在当地食品加工厂获取自市售大小的供者(约4月龄)。也可以使用revivicor的雄性和雌性幼年(wt和)猪心。心脏将在冰冷的汉克斯平衡盐溶液(hbss)中清洗，并将其置于含有抗生素(126mg/l林可霉素、52mg/l、10万古霉素、157mg/l头孢西丁和117mg/l多粘菌素)的冰上的hbss中，运输至解剖实验室。在100级生物安全罩中无菌条件下进行解剖后，将记录主动脉瓣内径和解剖结构，并在进一步处理之前，使用抗生素在4℃下处理24小时。这一步骤可以通过无菌采购或使用加工用于植入、移植患者的产品的哺乳动物组织加工中常用的化学和/或辐射技术进行最终灭菌来避免。
[0140]
生物反应器介导的脱细胞将如上文结合图1所述进行。如前所述，进行无冰冷冻保存(brockbank，2015)。通过将组织置于无菌聚酯袋或小瓶中，室温下置于振荡器上至少一小时(10-80ml vs83在ec溶液中，具体取决于组织体积)，一步到位，用含有4.65m dmso、4.65m fmd和3.31m 1,2丙二醇[丙二醇(pg)]的euro-collins(ec)溶液的83％ cpa溶液渗透组织。然后去除cpa溶液，用新鲜的vs83 cpa溶液替代，对袋子进行热密封，然后快速冷却。然后，将袋子放在-135℃机械冷冻柜或氮气冷却冷冻柜顶部的2-甲基丁烷预冷浴(《-100℃)中10分钟，然后在-80℃下储存，以实现冷却过程。储存至少一周后，将组织在37℃水
浴中快速重新升温，并将组织置于预冷的含有甘露醇的ec溶液中，然后是单独的ec溶液，最后放入4℃的达氏改良的伊氏培养基(dmem)或含5％右旋糖的乳酸林格培养基(lrd5)中，以去除cpa溶液。
[0141]
血液动力学和叶力学：新鲜和无冰冷冻保存的hv
±
脱细胞将安装在hv生物反应器中(图1)，并测试功能性，例如在主动脉条件下，我们将使用70.5bpm、70ml/冲程、120/80mmhg，并使用高速相机(240fps)和数字成像进行数据捕获。几何孔口面积(goa)测量值将以mm2为单位进行计算，并绘制为多个循环中时间的函数(schleicher，2010)。还将使用已建立的方法评估叶的机械特性(brockbank,2011；sierad,2015)。
[0142]
组织学/免疫组织化学：残余细胞材料的脱细胞组织质量筛选包括dna提取/分析(cyquant试验)和组织学方法。处理来自hv外植体的单个组织组分的代表性样品，并将其用于染色切片的定性和定量形态计量学组织学评估。染色将包括苏木精和曙红(h&e)和弹性蛋白染色(song，2000)、dapi染色和莫瓦特五色套染(movat’s pentachrome)。免疫染色将使用免疫组织化学来鉴定脱细胞后残余的细胞片段。
[0143]
细胞因子产生/释放的测量作为潜在免疫原性的测量：组织冲头(直径6mm，n＝8-10)将在37℃的dmem中孵育1-7天。获取上清液并根据制造商的方案，将采用酶联免疫吸附试验(elisa)对其进行细胞因子分析，包括潜伏性和活性tgf-β同种型。将通过每天从同一培养孔收集上清液进行动力学分析，并将细胞因子浓度反计算出培养基的剩余体积，以获得以pg/mg组织干重为单位的细胞因子量。在450nm处在平板阅读器上测量吸光度。
[0144]
测量人外周血单核细胞(pbmc)的反应性作为免疫原性的测量：组织冲头(直径6mm，n＝8-10)可以与人pbmc共同培养，以确定新鲜未经处理的组织冲头的增殖效果是否使用seifert(2015)描述的方法得到改善。
[0145]
贯穿本公开所引用的所有文献和专利参考文献全部通过引用纳入。

技术特征：
1.一种保存组织并在移植或植入保存的组织后减少免疫反应的方法，包括：从供者获得第一组织，所述第一组织是野生型组织或经遗传修饰的组织；通过将所述第一组织浸入具有至少约75重量％的冷冻保护剂浓度的第一溶液中至少一小时以杀死和裂解第一组织的细胞来形成第二组织；通过使所述第二组织在生物反应器中经历脱细胞来去除所述第二组织的残余细胞材料，通过去除所述第二组织的所述残余细胞材料来形成第三组织；使所述第三组织经历无冰冷冻保存，所述无冰冷冻保存包括：通过将所述第三组织和第二溶液放置在预定温度的容器中至少一小时，用冷冻保护剂浓度为至少约75重量％的所述第二溶液渗透第三组织，去除所述第二溶液并用具有至少约75重量％的冷冻保护剂浓度的第三溶液替代，在用所述第三溶液替代所述第二溶液之后密封所述容器，使得所述密封的容器包含所述第三溶液和第三组织，以及储存所述密封的容器；以及将所述第三组织植入或移植到受者中，其中所述第三组织的移植或植入没有引起免疫反应，或所述受者发生的任何免疫反应都是不危及生命的。2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一组织的来源是经遗传修饰的猪来源。3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述野生型组织或经遗传修饰的组织选自心脏瓣膜、心包、血管、韧带、肌腱、膀胱、肠和皮肤。4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一组织、所述第二组织和所述第三组织不与戊二醛交联。5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，通过将无菌包装中的第一组织在室温下放置在振荡器上的10至80ml第一溶液中，持续足以杀死第一组织的所有活细胞的时间，在一个步骤中形成第二组织。6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在1至5天或大于5天的时间段内，由所述第二组织形成所述第三组织，通过在生理流动和压力条件下用无菌溶液在无菌生物反应器中洗涤来去除所述第二组织的残余细胞材料。7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述无冰冷冻保存包括将所述第三组织和第二溶液在无菌聚酯袋或无菌聚酯小瓶中在室温下置于振荡器上至少一小时。8.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述无冰冷冻保存包括将所述第三组织和第二溶液在室温下在无菌聚酯袋中置于振荡器上至少一小时，然后，在用所述第三溶液替换所述第二溶液之后，对所述聚酯袋进行热密封和储存。9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一组织、所述第二组织和所述第三组织各自是其中不存在半乳糖-α(1,3)-半乳糖抗原(α-gal)表位的组织。10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第三组织是在动态流动生物反应器中通过无去污剂脱细胞形成的。11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第三组织99％无dna。12.如权利要求1-11所述的方法，其中所述第一溶液、所述第二溶液和所述第三溶液各
自为83％的冷冻保护剂溶液，所述冷冻保护剂溶液在euro-collins溶液中含有4.65m dmso、4.65m甲酰胺和3.31m 1,2丙二醇。13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述野生型组织或经遗传修饰的组织是心脏瓣膜。14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中与从同一供者获得的相应野生型组织或经遗传修饰的组织相比，所述第三组织在人中具有降低的免疫原性，所述从同一供者获得的相应的野生型组织或经遗传修饰的组织是：仅经历脱细胞或冷冻保护剂暴露的组织，通过隐藏或掩蔽抗原实现的具有降低的免疫原性的组织，未经历脱细胞和/或冷冻保护剂暴露的组织，或15.一种保存组织的方法，包括：获得第一组织，所述第一组织是野生型组织或经遗传修饰的组织；通过将所述第一组织浸入具有至少约75重量％的冷冻保护剂浓度的第一溶液中至少一小时以杀死和裂解第一组织的细胞来形成第二组织；通过使所述第二组织在生物反应器中经历脱细胞来去除所述第二组织的残余细胞材料，通过去除所述第二组织的所述残余细胞材料来形成第三组织；和使所述第三组织经历无冰冷冻保存，所述无冰冷冻保存包括：通过将所述第三组织和第二溶液放置在预定温度的容器中至少一小时，用冷冻保护剂浓度为至少约75重量％的所述第二溶液渗透第三组织，去除所述第二溶液并用具有至少约75重量％的冷冻保护剂浓度的第三溶液替代，在用所述第三溶液替代所述第二溶液之后密封所述容器，使得所述密封的容器包含所述第三溶液和第三组织，以及储存所述密封的容器。

技术总结
一种保存和降低组织免疫原性的方法，该方法包括获得第一组织，该第一组织是野生型组织或经遗传修饰的组织；通过将第一组织浸入具有至少约75重量％的冷冻保护剂浓度的第一溶液中至少一小时以杀死和裂解第一组织的细胞来形成第二组织；通过使所述第二组织在生物反应器中经历脱细胞来去除所述第二组织的残余细胞材料，通过去除所述第二组织的所述残余细胞材料来形成第三组织；以及使所述第三组织经历无冰冷冻保存。无冰冷冻保存。无冰冷冻保存。


技术研发人员：K
受保护的技术使用者：组织测试技术有限公司
技术研发日：2021.10.20
技术公布日：2023/10/15