一种抗香蕉枯萎病大环内酰胺化合物的制备及其应用

1.本发明涉及一种香蕉枯萎病的防治，尤其涉及一种抗香蕉枯萎病大环内酰胺化合物的制备及其应用。


背景技术：

2.香蕉（musaspp.）是世界上产量和贸易量最大的水果（faostat，2021年），也是热区国家的主要口粮，被世界粮农组织定位为仅次于水稻、小麦、玉米的第四大粮食作物（qietal.,2021）。当前，具有经济价值的香蕉栽培品种多采用无性繁殖，狭窄的遗传背景致使其受多种病害的威胁，尤其是香蕉枯萎病，严重制约了香蕉产业的发展（liuetal.,2020）。香蕉枯萎病又称巴拿马病，是一种毁灭性土传性病害，也是世界范围内最严重的真菌病害之一，其由尖孢镰刀菌古巴专化型病原菌（fusariumoxysporumf.sp.cubense，foc）引起，可产生真菌毒素，并破坏香蕉维管束，最终导致植株死亡（zhangetal.,2021）。香蕉枯萎病菌有4个生理小种（foctr1、foctr2、foctr3和foctr4），其中热带小种foctr4危害最大，可感染全球80%以上的香蕉和大蕉品种（aguayoetal.,2020），被认为是全球农业历史上最具破坏性的病害之一。该病原菌会以厚垣孢子形式在土壤中存活几十年，传播途径广，蔓延速度快，目前在我国台湾、福建、海南、广东、广西和云南等香蕉主产区均已发现，其发病率一般在10%~40%之间，严重时甚至造成蕉园绝收，给蕉农带来巨大损失。常规物理和化学措施难以对其进行有效防治，而统合成的抗真菌化学药剂具有毒性残留，严重破坏农业生态环境，威胁食品安全和人类健康，已不能满足现代农业发展的需求。因此，亟需发展高效、安全、绿色的香蕉枯萎病防治方法，服务我国农业的可持续发展。
3.生物防治被认为是香蕉枯萎病最有效且极具潜力的防治措施，挖掘和利用高效拮抗微生物及其活性成分是目前生物防治的主要策略（jingetal.,2020）。微生物产生的活性代谢产物具有高效、广谱、安全等抗真菌特性，其中，链霉菌是产生生物活性次级代谢产物的重要微生物资源（uenoetal.,2016;lietal.,2021）。目前所发现的抗生素中约有70%~80%是由链霉菌产生的（zouetal.,2021）。利用链霉菌来源的抗菌化合物创制新型农用杀菌剂，在香蕉枯萎病绿色防控中具有潜在的应用前景，也为香蕉枯萎病绿色防控提供了新思路。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术中的不足，一种抗香蕉枯萎病大环内酰胺化合物的制备及其应用。
5.本发明的第一个方面是提供一种大环内酰胺化合物的制备方法，从萨姆松链霉菌xjc-2-6发酵液中依次经乙醇萃取、乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析、sephadexlh-20凝胶柱层析、rp-hplc分离得到，所述的萨姆松链霉菌xjc-2-6于2017年10月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，命名为streptomycessamsunensisxjc-2-6，保藏编号为cctccno:m2017620；所述大环内酰胺化合物的结构式如下所示：
。
6.优选地，所述制备方法包括以下步骤：（1）将萨姆松链霉菌xjc-2-6接种到发酵培养液中发酵培养，获得发酵液；（2）向发酵液中加入适量乙醇萃取，过滤后取上清液，加入适量乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯相，浓缩得到乙酸乙酯浸膏；（3）采用硅胶柱层析分离乙酸乙酯浸膏，用ch2cl2/meoh体系进行梯度洗脱，ch2cl2/meoh的体积比依次为，100：0，100:1，80:1，60:1，40:1，30:1，20:1，10:1，5:1，2:1，0：100），将得到的各个组分进行抑菌活性检测（优选采用tlc-bioautography法），靶标病原菌为foc tr4，得活性组分fr. c；（4）将活性组分fr. c经过sephadex lh-20凝胶柱层析，用ch2cl2/meoh洗脱剂进行洗脱，ch2cl2/meoh的体积比为 2:1；将得到的各个组分进行抑菌活性检测（优选采用tlc-direct bioautography法），靶标病原菌为foc tr4，得活性组分fr.c6；（5）将活性组分fr.c6通过rp-hplc反复分离纯化，并经抑菌活性检测，得到高活性单体大环内酰胺化合物。
7.其中，乙醇的加入量本发明不作特别限定，本领域技术人员根据经验添加即可。
8.其中，乙酸乙酯的加入量本发明不作特别限定，本领域技术人员根据经验添加即可。
9.进一步优选地，步骤（1）中，所述发酵培养液为fm1液体培养基，接种量为5%，28℃ 180 r/min振荡培养4d。
10.本发明的第二个方面是提供萨姆松链霉菌xjc-2-6在制备大环内酰胺化合物中的应用。
11.本发明的第三个方面是提供萨姆松链霉菌xjc-2-6发酵液在制备大环内酰胺化合物中的应用。
12.本发明的第四个方面是提供萨姆松链霉菌xjc-2-6发酵液乙酸乙酯提取物在制备大环内酰胺化合物中的应用。
13.其中，所述萨姆松链霉菌xjc-2-6发酵液乙酸乙酯提取物为萨姆松链霉菌xjc-2-6发酵液加入乙醇萃取过滤后的上清液中加入乙酸乙酯萃取浓缩乙酸乙酯相得到的。
14.其中，乙醇的加入量本发明不作特别限定，本领域技术人员根据经验添加即可。
15.其中，乙酸乙酯的加入量本发明不作特别限定，本领域技术人员根据经验添加即可。
16.本发明的第五个方面是提供大环内酰胺化合物在拮抗香蕉枯萎病菌4号生理小种、和/或防治香蕉枯萎病菌4号生理小种所致病害中的应用。
17.本发明的第六个方面是提供大环内酰胺化合物在提高香蕉枯萎病菌4号生理小种细胞壁中n-乙酰葡萄糖胺含量、和/或提高香蕉枯萎病菌4号生理小种细胞壁中β-1,3-葡聚糖酶活性、和/或降低香蕉枯萎病菌4号生理小种菌体生物量、和/或降低香蕉枯萎病菌4号生理小种菌体中总糖含量、和/或降低香蕉枯萎病菌4号生理小种菌体中蛋白质含量、和/或降低香蕉枯萎病菌4号生理小种菌体中脂肪含量中的应用。
18.本发明的第七个方面是提供大环内酰胺化合物在降低香蕉枯萎病菌4号生理小种菌体中线粒体呼吸链复合体酶i、和/或线粒体呼吸链复合体酶ii、和/或线粒体呼吸链复合体酶iii、和/或线粒体呼吸链复合体酶iv、和/或柠檬酸合酶、和/或异柠檬酸脱氢酶、和/或α-酮戊二酸脱氢酶、和/或琥珀酸脱氢酶、和/或苹果酸脱氢酶、和/或atp合成酶活性中的应用。
19.本发明首次采用萨姆松链霉菌制备上述大环内酰胺化合物，以香蕉枯萎病4号生理小种（foc tr4）为靶标病原菌，对萨姆松链霉菌xjc-2-6进行发酵，萃取获得活性粗提物浸膏，采用正反相硅胶柱层析，sephadex lh-20 凝胶柱层析以及制备hplc等现代色谱分离技术对活性次级代谢产物进行研究，终分离得到了1个抗香蕉枯萎病活性大环内酰胺化合物，进一步研究发现，该化合物能有效拮抗香蕉枯萎病菌4号生理小种，破坏菌丝结构，抑制菌丝生长，ec
50
为0.084 mm，能够显著提高香蕉枯萎病菌4号生理小种细胞壁中n-乙酰葡萄糖胺含量和β-1,3-葡聚糖酶活性，能够显著降低香蕉枯萎病菌4号生理小种菌体生物量以及总糖、蛋白质含量、脂肪含量，同时还能够有效降低线粒体呼吸链复合体酶i～iv、柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、atp合成酶等的活性。本发明为制备大环内酰胺化合物提供了新的新的思路，为枯萎病等植物病害的防治拓展新领域，具有广阔的发展空间和良好的开发应用前景。
附图说明
20.图1为链霉菌2-6乙酸乙酯浸膏化学成分分离与纯化流程图。
21.图2为化合物c3的结构。
22.图3为化合物c3的氢谱。
23.图4为化合物c3的碳谱。
24.图5为化合物c3的dept谱。
25.图6为化合物c3对foc tr4菌丝生长的抑制作用。
26.图7为扫描电镜下化合物c3对foc tr4菌丝的形态变化（a）和分生孢子形态变化（b）影响、以及透射电镜下化合物c3对foc tr4的细胞超微结构变化（c）影响。
27.图8为活性化合物c3对foc tr4病原菌生理代谢的影响。横坐标为活性化合物c3的浓度，单位为mm。
28.图9为活性化合物c3对foc tr4病原菌生物合成的影响。a, 线粒体呼吸链复合体酶i；b, 线粒体呼吸链复合体酶ⅱ；c, 线粒体呼吸链复合体酶ⅲ；d, 线粒体呼吸链复合体酶ⅳ。横坐标为活性化合物c3的浓度，单位为mm。
29.图10为活性化合物c3对foc tr4病原菌生物氧化的影响。横坐标为活性化合物c3的浓度，单位为mm。
30.本发明所述的萨姆松链霉菌xjc-2-6（下文简称“链霉菌2-6”）为链霉菌属的一个
新种，从采集自南海珊瑚样品中分离、筛选得到，命名为：streptomyces samsunensis xjc-2-6，于2017年10月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc) ，保藏编号为cctcc no: m2017620，地址在中国武汉的武汉大学。
具体实施方式
31.下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
32.1试验材料1.1 供试菌株
33.链霉菌2-6形态特征、培养特征、生理生化特征和16s rrna分子生物学特征鉴定等参见“专利号：201711435432.5，专利名称：一种萨姆松链霉菌及其应用”的中国专利，本发明在此不再赘述。
34.1.2 供试病原菌香蕉枯萎病菌4号生理小种 f. oxysporum f. sp. cubense race 4 (atcc 76255) （foc tr4）。
35.1.3 供试培养基本章研究中所用主要培养基见表1。
36.表1 发酵培养基及配方1.4主要试剂本研究使用的主要试剂见表2。
37.表2 主要生化试剂及来源生化试剂来源常用有机试剂为国产ar级试剂天津科密欧、天津福晨四甲基偶氮唑蓝(mtt)sigma公司rmpi1640sigma公司柱层析用硅胶(60～80mesh、200～300mesh)青岛海洋化工集团公司薄层层析硅胶h青岛海洋化工集团公司薄层层析硅胶板(gf
254
)青岛海洋化工厂分厂玻璃点样毛细管华西医科大学仪器厂1.5主要仪器本研究所用部分主要仪器见表3。
38.表3 主要仪器名称型号生产商显微熔点测定仪x-5恒温型北京泰克仪器有限公司质谱仪esi-ms、ei-4000micromassautospec-uitima-tof核磁共振仪brukerav-400，av-500bruker红外光谱仪nicolet380thermo,usa
g)，fr.c (5.5961 g)，fr.d (0.7065 g)，fr.e (1.3725 g)，fr.f (0.9760 g)，fr.g (1.5719 g)，foc tr4为靶标病原菌，经tlc-direct bioautography抑菌活性检测，得到主要活性组分fr.c (5.5961 g)。
45.2.5 活性组分sephadex lh-20凝胶柱层析经硅胶柱层析、tlc检测、生物活性测定后所得活性组分，用少量甲醇溶解，湿法上样，经sephadex lh-20凝胶柱层析分离（3 cm
×
150 cm）。用ch2cl2/meoh流动相进行洗脱，ch2cl2/meoh的体积比为 2:1，收集流分，每管收集8 ml，经tlc检测合并得组分。采用tlc-bioautography法进行抑菌活性检测，靶标病原菌为foc tr4，得活性组分fr.c6。
46.将活性组分fr.c经过sephadex lh-20凝胶柱层析，用ch2cl2/meoh（2:1）洗脱剂进行洗脱，共收集74管流分，经tlc检测后，合并得7个组分fr.c1~c7，经tlc-direct bioautography抑菌活性检测，得到较高活性组分fr.c6 (0.8215 g)。
47.2.6 活性组分rp-hplc分离纯化高效液相色谱半制备条件为：agilent 1100，uv/rid检测器，柱温30℃；色谱柱为ymc pack ods-a（250
ꢀ´ꢀ
10 mm，5 μm）；流动相为meoh/h2o；检测波长分别为210，230, 254和305 nm; 手动进样，进样量为50 μl；流速为0.2 ml/min。
48.经sephadex lh-20凝胶柱层析得到的活性组分fr.c6，通过rp-hplc反复分离纯化，并经抑菌活性检测，得到高活性单体化合物c3（92.4 mg, meoh : h2o =70 : 30, 1.5 ml/min, tr = 22.6 min），进行结构鉴定。
49.化合物c3为白色固体，分子式为c
26h48
n2o6，质谱 (m/z): 485.3646 [m + h]
+
，不饱和度为4。1h-nmr (600 mhz, cd3od) 数据显示，有5个甲基信号δ
h 2.03 (s, 3h), 1.12 (d, j = 6.5 hz, 3h), 0.90 (d, j = 6.9 hz, 3h), 0.87 (t, j = 7.2 hz, 6h)。3c-nmr谱显示，该化合物共含有26个碳原子。根据以上数据，确定该化合物为大环内酯酰胺类化合物结构式如图2所示，该化合物核磁数据见表4。
[0050]
表4 化合物c3的nmr数据（j单位：hz）positionδh(mult,jinhz)δc1178.9,c22.28,ddt(12.9,9.1,4.4)43.0,ch31.49,m;1.42,m36.2,ch241.41,m;1.16,m26.1,ch251.43,m;1.06,m35.2,ch261.68,m32.4,ch71.42,m;1.41,m26.1,ch281.56,m;1.49,m22.8,ch293.62,m78.6,ch101.53,m42.3,ch111.40,m;1.31,m26.3,ch2121.62,m;1.35,m28.5,ch2133.57,m;2.95,ddd(13.4,5.5,2.9)39.8,ch214
151.57,m;1.53,m22.3,ch2160.87,t(7.3)9.4,ch3171.08,d(6.9)18.9,ch3180.91,d(6.7)20.9,ch
31´
4.87,d(1.6)99.3,ch2
´
3.55,m71.2,ch3
´
4.15,dd(3.0,3.0)51.1,ch4
´
3.55,m72.3,ch5
´
4.03,q(6.5)68.8,ch6
´
1.21,d(6.5)17.0,ch37
´
173.0,c8
´
2.03,s22.7,ch
31
h-nmr was reconrded at 600 mhz and 13
c-nmr was recorded at 150 mhz
[0051]
2.7 活性化合物c3对foc tr4菌丝生长的抑菌作用将溶于无菌水（10.0 mg/ml）的活性化合物c3添加到45-50℃的pda培养基中，采用2倍连续稀释法制备不同活性成分浓度的pda平板，平板终浓度分别为0, 0.013, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2 and 0.4 mm，以添加等量的无菌水为对照。将foc tr4的真菌菌饼（φ=5 mm）接种到每个平板中央，于28
ꢀ±ꢀ2ꢀ°
c下培养，直到对照菌丝到达平板边缘。测定各菌落垂直直径的平均值。每个处理重复3次。菌丝生长抑制率的计算公式如下（nimaichand et al., 2015）：
[0052]
式中：c是对照组菌落平均直径，t是处理组菌落平均直径。
[0053]
采用生长速率法，测定0, 0.013, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2 and 0.4 mm浓度下活性化合物c3对靶标病原菌foc tr4菌丝生长的影响，如图6所示。通过测量菌落直径和模型计算，求得毒力回归方程，计算得化合物c3的ec
50
为0.084 mm。活性成分浓度与菌丝生长抑制呈正相关，浓度越大，抑制作用越强。
[0054] 2.8 活性化合物c3对foc tr4病原菌形态及细胞内超微结构的影响分别采用扫描电镜和透射电镜观察法，研究链霉菌活性化合物c3对foc tr4病原菌菌丝、病原菌分生孢子及病原菌细胞内超微结构的致畸作用。
[0055]
（1）扫描电镜观察foc tr4病原菌菌丝体变化用打孔器在靶标病原菌foc tr4菌落边缘取 0.5 cm 菌饼接入含活性化合物c3平板中央。28℃培养5d后，在菌落边缘用刀片切取菌丝尖端并尽量切去培养基，用2.5%（w/v）戊二醛溶液4℃固定过夜，磷酸缓冲液漂洗三次，然后用30%、50%、70%、90%的乙醇逐级脱水一次，100%乙醇脱水两次，每次20min，最后用乙酸异戊酯洗脱乙醇两次，每次30min，真空干燥后喷金观察。
[0056]
从图7a可观察到，对照组的菌丝表面致密光滑，形状均匀、饱满，完整性良好，菌丝周围产生大量小孢子。而经活性化合物c3处理后，病原菌菌丝表面粗糙、不平整，菌丝萎缩、变细，完整性遭到破坏，发生断裂和破裂的现象，分生孢子产生受到抑制。通过本实验可以
发现化合物c3能够破坏病原菌的菌丝结构，进而抑制了病原菌的生长和分生孢子的产生。
[0057]
（2）扫描电镜观察foc tr4病原菌分生孢子变化制备foc tr4孢子悬浮液(1
×
10
6 cfu/ml)，取5
µ
l孢子悬浮液置于载玻片，用5
µ
l ec
50
浓度的活性化合物c3处理，用无菌水处理作为对照，培养24h。载玻片用2.5%戊二醛4℃固定过夜，磷酸缓冲液漂洗三次，然后用30%、50%、70%、90%的乙醇逐级脱水一次，100%乙醇脱水两次，每次20min，最后用乙酸异戊酯洗脱乙醇两次，每次30min，真空干燥后喷金观察。
[0058]
活性化合物c3对foc tr4病原菌分生孢子的作用通过扫描电镜进行观察，如图7b所示。sem图像显示经活性成分处理的病原菌，孢子变形、皱缩、塌陷、弯曲和头部肿大，且完整性遭到破坏，发生断裂与破裂的现象。而对照组孢子饱满，表面光滑，孢子形态完整。通过本实验可以发现化合物c3能够破坏病原菌的分生孢子结构，进而抑制了病原菌的生长。
[0059]
（3）透射电镜观察foc tr4病原菌细胞超微结构的变化用打孔器在靶标菌菌落边缘取 0.5 cm 菌饼接入含活性化合物c3平板的正中心。28℃培养5d后，在菌落边缘用刀片切取菌丝尖端并尽量切去培养基，用2.5%（w/v）戊二醛溶液4℃固定过夜，磷酸缓冲液漂洗三次，然后用30%、50%、70%、90%的乙醇逐级脱水一次，100%乙醇脱水两次，每次20min，再将样品浸入环氧丙烷置换2次，每次20 min。将样品在环氧丙烷：环氧树脂（1:1）溶液中浸泡1h进行包埋后，用钻石刀将包埋物切成70 nm 超薄切片。切片用乙酸双氧铀和柠檬酸铅分别染色 30 min，用透射电子显微镜进行观察（phillips et al., 2003）。
[0060]
活性化合物c3对foc tr4病原菌细胞超微结构的影响如图7c所示。透射电镜观察对照组病原菌细胞形态丰满，结构完整，细胞器种类齐全，细胞壁完整，细胞质均匀，线粒体形态规整，体型均匀（图7c上）。经活性化合物处理后，foc tr4病原菌细胞壁明显变薄，细胞器溶解消失，细胞组织崩解，细胞空泡形成，囊泡出现（图7c中）；细胞质电子密度增加，线粒体数量明显增多，线粒体形态异常，表现出表面粗糙塌陷、缺乏基质、内外膜清晰可见，嵴肿胀和结构无序（图7c下）。
[0061]
2.9 活性化合物c3对foc tr4病原菌生理代谢的影响（1）活性化合物c3对foc tr4病原菌细胞壁几丁质酶的影响n-乙酰葡萄糖胺标准曲线：配制100
ꢀµ
g/ml的 n-乙酰葡萄糖胺标准液，稀释为20，40，60，80，100
ꢀµ
g/ml的梯度标准液。取1ml梯度标准液加入试管，再加入0.5 ml硼酸钾（0.8 mol/l再加入0.5 ml硼酸钾溶液（0.8 mol/l），沸水浴3 min，冷却后加入3 ml质量分数为1%的dmab(对二甲氨基苯甲醛)，36℃保温20 min，冷却，紫外分光光度仪于波长544 nm处测定吸光度。以 n-乙酰葡萄糖胺含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
[0062]
在250 ml三角瓶中加入100 ml pdb培养基，接入foc tr4病原菌，同时加入不同浓度梯度的活性化合物c3（浓度为0.021、0.042、0.084、0.168和0.336 mm），于180 r/min，28℃振荡培养5 d，5000 r/min 离心15 min 收集菌丝，并用无菌水冲洗菌丝，水洗 3 次后待测。称取 1.0 g 菌丝，加入5 ml tris-hcl，冰浴中研磨，10000 r/min，4 ℃离心，取上清液于-20 ℃保存备用。向洁净的试管中加入不同处理的菌体上清液1.0 ml，再加入0.5 ml硼酸钾溶液（0.8 mol/l），沸水浴3 min，冷却后加入3 ml质量分数为1%的dmab(对二甲氨基苯甲醛)，36 ℃保温20 min，冷却，用紫外分光光度仪于波长544 nm处测定吸光度。通过标准曲线计算几丁质水解产物n-乙酰葡萄糖胺含量。
[0063]
活性成分对foc tr4病原菌细胞内n-乙酰葡萄糖胺含量变化影响如图8a所示。随着活性化合物c3浓度升高，n-乙酰葡萄糖胺含量呈现逐渐上升趋势。化合物c3处理组在0~0.084 mm浓度区间，n-乙酰葡萄糖胺含量急剧上升，增长斜率较大。而在0.084~0.336 mm浓度区间，n-乙酰葡萄糖胺含量上升趋势变缓，增长斜率变小。因此，0.084 mm为化合物c3处理的浓度节点，此浓度n-乙酰葡萄糖胺含量为22.16μg/g。几丁质是病原菌细胞壁的主要组成成分，n-乙酰葡萄糖胺是几丁质水解的终产物，n-乙酰葡萄糖胺的变化能够反映病原菌细胞壁的变化。n-乙酰葡萄糖胺含量随处理浓度上升而增加，说明活性组分c3浓度升高，导致几丁质水解程度增大，细胞壁遭到了破坏，且破坏程度不断加重。链霉菌2-6的活性化合物通过分解病原菌的细胞壁，进而降低病原菌的生存能力，达到抑制病原菌生长的目的。
[0064]
（2）活性化合物c3对foc tr4细胞壁β-1,3-葡聚糖酶的影响称取0.2 g香蕉枯萎菌丝，放入预冷的研钵中，加入少许的无菌石英砂，加入2.5 ml浓度为0.05 mol/l的醋酸钠缓冲液（ph 5.0），在冰浴中充分研磨成匀浆，然后倒入到离心管中，4 ℃下12000 r/min离心15 min，离心管中的上清液即为粗酶液，保存到冰箱中（-20℃），用于β-1,3-葡聚糖酶活性测定。通过miller描述的方法测定产生的还原糖，在试管中加入100μl 1 mg/ml 的昆布多糖溶液和100 μl酶液，45℃水浴30 min后立即加入1 ml二硝基水杨酸（dns）溶液来终止反应，混匀，置于沸水浴中显色5 min，迅速冷却至室温于540 nm测定吸光度值（a），沸水浴（10 min）失活酶液作为对照，利用葡萄糖标准曲线计算产生的葡萄糖量，以吸光度差值（样品液 a 值减去空白对照a值），根据酶活力定义计算酶活力单位（miller et al., 1959; noronha et al., 2000）。
[0065]
一个酶活力单位（u）定义为：45℃下，每 g 菌丝每 30 min 催化昆布多糖（laminarin）产生 1μmol 葡萄糖的酶量。公式为:
[0066]
式中，v1是加入反应体系中样本体积，0.1 ml，v2是加入提取液体积，2.5 ml；w是样本鲜重，g。
[0067]
活性成分对foc tr4菌丝中β-1,3-葡聚糖酶活力的影响如图8b所示。随着处理浓度加大，β-1,3-葡聚糖酶的活力呈现上升趋势。除了0.021 mm和0.042 mm和外，其余各处理组与对照组相比，均具有差异显著性（p《0.05）。与对照组的β-1,3-葡聚糖酶活力（0.188 u/ ml）相比，0.084 mm、0.168 mm和0.336 mm处理组中相应酶活分别为0.192 u/ ml、0.264 u/ ml和0.377 u/ ml。
[0068]
（3）活性化合物c3对foc tr4病原菌生物量的影响在250 ml三角瓶中加入100 ml pdb培养基，接入foc tr4病原菌，同时加入不同浓度梯度的活性化合物c3（浓度为0.021、0.042、0.084、0.168和0.336 mm），于180 r/min，28℃振荡培养5 d，5000 r/min 离心15 min 收集菌丝，并用无菌水冲洗菌丝，并干燥。称重并记录菌丝干重，评价活性化合物c3对foc tr4病原菌生物量的影响。
[0069]
图8c结果显示，foc tr4病原菌菌丝的干重随着活性化合物c3浓度的增加而逐渐降低。0.021和0.042
µ
m处理组之间未观察到显著差异。0.168和0.336
µ
m处理组能显著抑制foc tr4菌丝体干重的增加，其二者之间没有明显差异。总之，活性化合物c3可显著降低foc tr4病原菌的生物量。
[0070]
2.10 活性化合物c3对foc tr4病原菌生物合成的影响（1）活性化合物c3对foc tr4病原菌总糖的影响配置2 ml终浓度为0，40，80，120，160，200 μg/ml葡萄糖溶液，加入1.5 ml 3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid ，dns）试剂。混匀后置100℃恒温水浴保温5min，冷却至室温，加蒸馏水稀释至20ml，混合均匀，于540 nm波长处测定吸光度。葡萄糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。在250 ml三角瓶中加入100 ml pdb培养基，接入foc tr4病原菌，同时加入不同浓度梯度的活性化合物c3（浓度为0.021、0.042、0.084、0.168和0.336 mm），于180 r/min，28℃振荡培养5 d，5000 r/min 离心15 min 收集菌丝，并用无菌水冲洗菌丝，并干燥。称取制备好的菌丝1.0 g置于预冷的研钵中，加入6 mltris-hcl浸提液，冰浴中研磨至匀浆，4℃，10000 r/min离心10 min。取1 ml上清夜加入2 ml hcl（6 mol/l），沸水浴30 min，流动冷却，用 naoh（6 mol/l）溶液中和至中性加入 1.5ml dns，沸水浴 5 min，取 2 ml 上清液加1.5 ml dns，沸水浴5 min。取出后冷却至室温，加蒸馏水稀释至 20 ml，混匀。于波长540 nm处测定吸光度，通过标准曲线计算总糖含量（rivers et al., 1984）。
[0071]
从图8e可以看出，经活性化合物c3处理，foc tr4病原菌菌体中总糖含量随着活性化合物c3浓度的增大而逐渐降低，浓度为0.021 mm、0.042 mm、0.084 mm、0.168 mm和0.336 mm的化合物c3处理后，foc tr4病原菌总糖含量分别为1.74
±
0.04、1.64
±
0.05、1.57
±
0.06、1.418
±
0.10和1.20
±
0.06mg/g。与对照组相比，分别下降了3.52%、9.07%、15.37%、21.48%和33.33%。
[0072]
（2）活性化合物c3对foc tr4病原菌蛋白质含量的影响在250 ml三角瓶中加入100 ml pdb培养基，接入foc tr4病原菌，同时加入不同浓度梯度的活性化合物c3（浓度为0.021 mm、0.042 mm、0.084 mm、0.168 mm和0.336 mm），于180 r/min，28℃振荡培养5 d，5000 r/min 离心15 min 收集菌丝，并用无菌水冲洗菌丝，并干燥。称取制备好的菌丝1.0 g置于预冷的研体中，加入6 mltris-hcl 浸提液，冰浴中研磨至匀浆，4℃，10000 r/min 离心10 min。取0.1 ml上清夜，加入0.9 ml 蒸馏水，再加入5 ml考马斯亮蓝g-250 溶液，充分混合，静置5 min，于波长595 nm 测定吸光度，对照标准曲线，计算蛋白质含量（bradford, 1976）。
[0073]
图8d实验结果显示，foc tr4病原菌蛋白质含量与活性化合物c3的浓度呈负相关关系。活性化合物c3的浓度为0.021 mm 时，foc tr4菌丝中蛋白质含量为2.99mg/g，而对照组为3.24mg/g，而当活性化合物c3的浓度变为0.336 mm时，foc tr4菌丝中蛋白质含量降低为2.15mg/g。
[0074]
（3）活性化合物c3对foc tr4病原菌脂肪含量的影响脂肪含量的测定参文献（陈毓荃，2002）的方法进行：在250 ml三角瓶中加入100 ml pdb培养基，接入foc tr4病原菌，同时加入不同浓度梯度的活性化合物c3（浓度为0.021 mm、0.042 mm、0.084 mm、0.168 mm和0.336 mm），于180 r/min，28℃振荡培养5 d，5000 r/min 离心15 min 收集菌丝，并用无菌水冲洗菌丝。精确称取菌丝0.5 g于滤纸筒中，封好纸筒两端，置于索氏脂肪抽提器中。连接已恒重的抽脂瓶，从冷凝器上端加入无水乙醚（沸程30～60℃）。在 50～60℃水浴上加热提取12～16 h。提取完毕后，在水浴锅上蒸去残留乙醚，再于 100～105℃烘箱中干燥8 h至恒重。计算公式如下：
[0075]
活性化合物c3对foc tr4病原菌菌体中脂肪含量的影响结果如图8f所示。与总糖含量相似，浓度为0.021 mm、0.042 mm、0.084 mm、0.168 mm和0.336 mm的化合物c3处理后，foc tr4病原菌脂肪含量分别下降了1.51%、7.82%、18.70%、36.01%和49.02%。因此，活性化合物c3对靶标病原菌生物合成可以造成显著的影响。
[0076]
2.11 活性化合物c3对foc tr4病原菌生物氧化的影响（1）活性成分对线粒体呼吸链（etc）复合体酶i～iv活性的影响
①ꢀ
线粒体提取和预处理离心收集经不同浓度活性成分处理后的菌丝。采用蔗糖差速离心法提取菌丝线粒体（mizutani et al.，1995），取5 g用预冷的 hepes-trisbuffer（20 mm，ph 7.2）冲洗三次后，将菌丝重悬于3倍体积预冷的线粒体提取缓冲液（250 mm 蔗糖，10 mm kcl，5 mm edta，20 mm hepes-tris，ph 7.2，1.5 mg/ml bsa）中，将菌丝放入50 ml 离心管中，加入玻璃珠涡旋振荡器下匀浆破碎（fishbein et al., 1993）。匀浆4 ℃下4000 r/min离心15 min，收集上清液，弃去沉淀。取上清液，继续离心，12000 r/min，4 ℃下离心，弃去上清液，以不含bsa的线粒体提取缓冲液冲洗沉淀后，4 ℃下10000 r/min离心20 min。沉淀即为线粒体颗粒粗提物（barrientos, 2002）。
[0077]
重悬线粒体颗粒于400 μl预冷的线粒体保存缓冲液（2 mm hepes，0.1 mm egta，250 mm蔗糖，ph 7.4）中，留 60~70μl和复合体酶iii活性测定。取 10 μl 线粒体溶液，以bsa为标准蛋白，利用bradford法（bradford m，1976）测定蛋白浓度后，用线粒体保存缓冲液调节蛋白浓度至1 mg/ml，置于冰上备用，或分装后以液氮速冻，-20℃保存。测定酶活性前，将线粒体溶液置于液氮/室温反复冻融3次。
[0078]
剩余330～340 μl 溶液4℃下10000 r/min离心20 min，将沉淀重悬于1 ml低渗缓冲液，再于4℃下10000 r/min离心20 min后，将沉淀重悬于300 μl低渗缓冲液中。用于复合体酶i、复合体酶ii、复合体酶iv。取10 μl线粒体溶液，以bsa 为标准蛋白，利用bradford法测定蛋白浓度后，用低渗缓冲液调节蛋白浓度至 1 mg/ml，置于冰上备用，或分装后以液氮速冻，-20℃保存。线粒体复合体酶检测之前，溶液置于液氮/室温反复冻融3次再进行后续检测。复合体酶i~iv测定在37℃进行，反应体系总体积1 ml，线粒体蛋白加入量为20～40μg。线粒体复合体酶ⅰ～ⅳ活性检测方法参照已知文献方法（spinazzi, et al., 2012）进行。
[0079]
②ꢀ
对线粒体呼吸链复合体酶 i 活性的影响复合体酶i（鱼藤酮敏感的nadh-癸基泛醌氧化还原酶）：以癸基泛醌为电子受体，nadh为电子供体，通过测定nadh被氧化而引起的340 nm吸收值降低来进行。取700 μl纯水加入1 ml比色杯中，加入8
ꢀµ
l经预处理的线粒体溶液（1 mg/ml），37℃孵育2 min。分别加入100 μl磷酸钾缓冲液（0.5 m，ph 7.5）、60
ꢀµ
l无脂肪酸bsa（50 mg/ml）、30
ꢀµ
l kcn（10 mm）和10
ꢀµ
lnadh（10 mm）。平行试验的另一比色杯多加入10 μl鱼藤酮（1 mm），测定鱼藤酮不敏感的复合酶活性，扣除后定量鱼藤酮敏感的复合体酶i活性。用纯水调节反应混合物体积至994 μl。将以parafilm膜封口的比色杯翻转混匀反应混合物后在340 nm监测基线2 min。加入6 μl癸基泛醌（10 mm）启动反应，测定2 min内340 nm吸光度值的降低（nadh摩尔消光系
c消光系数ε=18.5 mm-1
·
cm-1）。计算公式：
[0083]
为了研究活性化合物对线粒体电子传递链复合体酶活性的影响，分别用0.021 mm、0.042 mm、0.084 mm、0.168 mm和0.336 mm浓度的化合物c3处理foc tr4，并检测etc复合体酶i～iv的活性（图9）。与对照组相比，etc复合体酶i～iii的活性均在低浓度处理下增加；然而，随着处理浓度的增加，其活性或含量无一例外地逐渐降低。化合物c3处理下，复合体酶i～iii的活性在0.021 mm浓度时增加到最大值，并开始下降，而复合体酶iv的活性随着活性化合物的浓度增加而逐渐降低。
[0084]
（2）活性成分对三羧酸循环（tca）关键酶活性的影响包括柠檬酸合酶（cs）、异柠檬酸脱氢酶（icdhm）、α-酮戊二酸脱氢酶（α-kgdh）、琥珀酸脱氢酶（sdh）、苹果酸脱氢酶（mdh）在内的三羧酸循环酶系活力及atp合成酶则根据索莱宝所售试剂盒bc1060，bc2160，bc0710，bc0955，bc1040，bc0305进行测定。
[0085]
本研究检测了tca循环中6种关键酶icdhm，α-kgdh，cs，mdh， sdh和atpase（图10）。与对照组相比，6种关键酶活性均随着处理浓度的增加而逐渐降低。这可能是由于活性化合物处理后，氧化应激（ros）水平升高，增加了线粒体的负担，也抑制了能量代谢，atp酶也迅速下降。
[0086]
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

技术特征：
1.一种大环内酰胺化合物的制备方法，其特征在于，从萨姆松链霉菌xjc-2-6发酵液中依次经乙醇萃取、乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析、sephadexlh-20凝胶柱层析、rp-hplc分离得到，其制备方法，包括以下步骤：（1）将萨姆松链霉菌xjc-2-6接种到发酵培养液中发酵培养，获得发酵液；（2）向发酵液中加入适量乙醇萃取，过滤后取上清液，加入适量乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯相，浓缩得到乙酸乙酯浸膏；（3）采用硅胶柱层析分离乙酸乙酯浸膏，用ch2cl2/meoh体系进行梯度洗脱，ch2cl2/meoh体系中ch2cl2和meoh的体积比依次为100:0，100:1，80:1，60:1，40:1，30:1，20:1，10:1，5:1，2:1，0:100，将得到的各个组分进行抑菌活性检测，靶标病原菌为foctr4，得活性组分fr.c；（4）将活性组分fr.c经过sephadexlh-20凝胶柱层析，用体积比为2:1的ch2cl2/meoh洗脱剂进行洗脱，将得到的各个组分进行抑菌活性检测，靶标病原菌为foctr4，得活性组分fr.c6；（5）将活性组分fr.c6通过rp-hplc反复分离纯化，并经抑菌活性检测，得到高活性单体大环内酰胺化合物；所述的萨姆松链霉菌xjc-2-6于2017年10月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，命名为streptomycessamsunensisxjc-2-6，保藏编号为cctccno:m2017620；所述大环内酰胺化合物的结构式如下所示：。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述发酵培养液为fm1液体培养基，接种量为5%，28℃180r/min振荡培养4d。3.萨姆松链霉菌xjc-2-6在制备大环内酰胺化合物中的应用，所述大环内酰胺化合物的结构式如下所示：。4.萨姆松链霉菌xjc-2-6发酵液在制备大环内酰胺化合物中的应用，所述大环内酰胺化合物的结构式如下所示：
。5.萨姆松链霉菌xjc-2-6发酵液乙酸乙酯提取物在制备大环内酰胺化合物中的应用，所述大环内酰胺化合物的结构式如下所示：。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述萨姆松链霉菌xjc-2-6发酵液乙酸乙酯提取物为萨姆松链霉菌xjc-2-6发酵液加入乙醇萃取过滤后的上清液中加入乙酸乙酯萃取浓缩乙酸乙酯相得到的。7.大环内酰胺化合物在拮抗香蕉枯萎病菌4号生理小种、和/或防治香蕉枯萎病菌4号生理小种所致病害中的应用，所述大环内酰胺化合物的结构式如下所示：。8.大环内酰胺化合物在提高香蕉枯萎病菌4号生理小种细胞壁中n-乙酰葡萄糖胺含量、和/或提高香蕉枯萎病菌4号生理小种细胞壁中β-1,3-葡聚糖酶活性、和/或降低香蕉枯萎病菌4号生理小种菌体生物量、和/或降低香蕉枯萎病菌4号生理小种菌体中总糖含量、和/或降低香蕉枯萎病菌4号生理小种菌体中蛋白质含量、和/或降低香蕉枯萎病菌4号生理小种菌体中脂肪含量中的应用，所述大环内酰胺化合物的结构式如下所示：
。9.大环内酰胺化合物在降低香蕉枯萎病菌4号生理小种菌体中线粒体呼吸链复合体酶i、和/或线粒体呼吸链复合体酶ii、和/或线粒体呼吸链复合体酶iii、和/或线粒体呼吸链复合体酶iv、和/或柠檬酸合酶、和/或异柠檬酸脱氢酶、和/或α-酮戊二酸脱氢酶、和/或琥珀酸脱氢酶、和/或苹果酸脱氢酶、和/或atp合成酶活性中的应用，所述大环内酰胺化合物的结构式如下所示：。

技术总结
本发明涉及香蕉枯萎病的防治方法，首次采用萨姆松链霉菌制备大环内酰胺化合物，该化合物能有效拮抗Foc TR4，破坏菌丝结构，抑制菌丝生长，显著提高Foc TR4细胞壁中N-乙酰葡萄糖胺含量和β-1,3-葡聚糖酶活性，显著降低Foc TR4菌体生物量以及总糖、蛋白质含量、脂肪含量，同时还能够有效降低线粒体呼吸链复合体酶I～IV、柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、ATP合成酶等的活性。本发明为制备大环内酰胺化合物提供了新的新的思路，为枯萎病等植物病害的防治拓展新领域。治拓展新领域。治拓展新领域。


技术研发人员：陈宇丰 谢江辉 王尉 周登博 魏永赞 冯筠庭 赵炎坤 李凯 起登凤 张妙宜
受保护的技术使用者：中国热带农业科学院热带生物技术研究所
技术研发日：2023.09.06
技术公布日：2023/10/15