基于蛋白质组学及磷酸化蛋白质修饰组学的脊髓损伤生物标志物及其应用

1.本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种基于蛋白质组学及磷酸化蛋白质修饰组学的脊髓损伤生物标志物及其应用。


背景技术：

2.脊髓损伤 (spinal cord injury, sci) 是脊柱损伤最严重的并发症。各种原因引起脊髓结构功能的损伤，导致在损害的相应节段出现各种运动、感觉和括约肌功能障碍，肌张力异常及病理反射等的相应改变。根据致病因素的不同，脊髓损伤可分为创伤性脊髓损伤和非创伤性脊髓损伤：创伤性脊髓损伤主要为外部因素引起的，非创伤性脊髓损伤常由肿瘤压迫、血管缺血或先天性疾病引起。根据病理生理机制不同，脊髓损伤分为原发性损伤和继发性损伤：脊髓原发性损伤是指脊柱局部变形引起的初始机械损伤，机械创伤后发生骨折和移位的骨碎片或椎间盘材料对神经元和血管的直接压迫和损伤；继发性机制由原发性损伤引发，次要机制包括一系列生化和细胞过程，例如电解质异常、形成自由基、血管缺血、水肿、创伤后炎症反应、细胞凋亡或基因程序性细胞死亡等过程。
3.目前，对于脊髓损伤的治疗主要包括：（1）药物治疗，主要包括大剂量激素冲击、神经节苷脂、米诺环素、cethrin（rho通路抑制剂）等。（2）手术减压，脊髓损伤的早期手术减压治疗在减少神经损伤方面取得了较好的效果，手术减压治疗不仅解除了对受损脊髓的压迫，还对重塑脊柱的稳定性起到积极作用，为脊髓恢复提供稳定的环境。（3）血流动力学治疗，预防脊髓损伤后低血压甚至增加平均动脉压可能有益于神经功能恢复。（4）干细胞疗法，主要包括神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞等。（5）基因治疗和组织工程，越来越多的证据表明生物和工程策略已在脊髓损伤中显示出治疗潜力。虽然这些治疗选择的效用为脊髓损伤患者提供了适度的好处，但是给患者带来的伤害未能从根本去除。因此，寻求脊髓损伤的治疗新靶点是当今脊柱外科的迫切需求。
4.蛋白质组学是将蛋白质作为研究对象，在整体水平研究细胞、组织或整个生命体内蛋白质组成及其活动规律的科学。通过蛋白质组学研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平、翻译后的修饰和蛋白与蛋白相互作用等，从而获得蛋白质水平上的关于疾病发生和疾病发展等过程的全面认识。而在蛋白质组学中，生物样品蛋白质鉴定的关键技术是质谱 (mass spectrum, ms)。由于脊髓损伤发生机制是一个错综复杂、有众多因素参与的过程，利用蛋白质组学可以帮助人们更深入地理解脊髓损伤的发病机制和治疗方法。
5.随着磷酸化蛋白质修饰组学的飞速发展，磷酸化蛋白质修饰组学已经被应用到生物学和医学领域中。主要应用如下：（1）疾病的发生和治疗研究：磷酸化蛋白质修饰组学可以帮助鉴定和验证与疾病相关的蛋白质和磷酸化作用靶点，可以为疾病的诊断、治疗和药物研发提供依据。（2）细胞信号转导研究：磷酸化蛋白质修饰组学可以揭示蛋白质在细胞信号转导中的作用，帮助我们理解细胞信号传递网络的复杂性和动态性。（3）蛋白质相互作用研究：磷酸化修饰可以影响蛋白质的结构和功能，揭示蛋白质相互作用网络的特征和功能。
（4）药物研发和评价：药物的研发过程中，可以使用磷酸化蛋白质修饰组学技术来鉴定和评价药物的作用目标和机制；在药物评价方面，磷酸化蛋白质修饰组学可以用于评估药物对蛋白质磷酸化状态的影响。
6.synapsin-1（syn1）称为突触蛋白1，该蛋白是 synapsin 家族研究最广泛的成员之一，该蛋白主要表达于中枢神经系统的突触前膜和突触囊泡中，是突触前膜的运输和突触囊泡的释放的重要调节因子。此外，syn1在磷酸化调控机制具有很大潜力，与神经系统疾病的发生发展密切。然而，syn1 在脊髓损伤研究仍处于初步阶段，syn1 的磷酸化调控对脊髓损伤的作用尚未明确。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提出一种基于蛋白质组学及磷酸化蛋白质修饰组学的脊髓损伤生物标志物及其应用，可以用于脊髓损伤的早期诊断预防、生物蛋白质靶向治疗、预后监测判断等。
8.本发明的目的之一在于， 一种基于蛋白质组学及磷酸化蛋白质修饰组学的脊髓损伤生物标志物，所述生物标志物选自下述物质中的一种或多种：syn1、syn1 ser62。
9.本发明的另一个目的在于， 基于蛋白质组学及磷酸化蛋白质修饰组学的脊髓损伤生物标志物在制备诊断脊髓损伤的产品中的应用，所述生物标志物选自下述物质中的一种或多种：syn1、syn1 ser62。
10.进一步的， 所述产品为检测试剂、试剂盒、微阵列或生物芯片。
11.进一步的，所述生物标志物用于通过蛋白质组学及磷酸化蛋白质修饰组学的分析手段对样品进行检测，所述样品来自脊髓组织。
12.本发明的另一个目的在于， 基于蛋白质组学及磷酸化蛋白质修饰组学的脊髓损伤生物标志物在制备治疗脊髓损伤的药物中的应用，所述药物靶向所述生物标志物，所述生物标志物选自下述物质中的一种或多种：syn1、syn1 ser62。
13.本发明通过进行脊髓损伤的蛋白质组学及磷酸化蛋白质修饰组学的研究，最终筛选出脊髓损伤中表达水平具有显著差异的syn1和syn1 ser62作为生物标志物，开创性地提供上述生物标志物在脊髓损伤诊断和预后方面的应用，为研究治疗脊髓损伤的药物提供新靶点，本发明具有重要的临床、科研及药物转化价值。
附图说明
14.图1a为本发明实施例1全蛋白质组数据箱式图;图1b为本发明实施例1全蛋白质组pca图；图2a为本发明实施例1全蛋白质丰度的均值 (in (mean))与标准差 (in (sd))的线性拟合图；图2b为本发明实施例1残差的直方图；图2c为本发明实施例1全蛋白质丰度平均值的秩与残差的等高线图；图2d为本发明实施例1残差的q-q 图；图3a为本发明实施例1的 deps火山图，红色标注为上调蛋白，灰色为无差异变化蛋白，蓝色标注为下调蛋白；
图3b为本发明实施例1的deps聚类热图分析，蓝色为上调蛋白，青绿色为下调蛋白；图4a为本发明实施例1的全蛋白质组差异蛋白go分析气泡图；图4b为本发明实施例1的全蛋白质组差异蛋白kegg分析柱状图 ；图4c为本发明实施例1的全蛋白质组gsea富集分析图；图5a为本发明实施例1的磷酸化数据统计图；图5b为本发明实施例1的磷酸化数据占比图；图5c为本发明实施例1的磷酸化蛋白质统计图；图5d为本发明实施例1的磷酸化肽段统计图；图5e为本发明实施例1的磷酸化位点占比环形图；图6a为本发明实施例1的全蛋白质组数据pca图；图6b为本发明实施例1的磷酸化蛋白质修饰组数据pca图；图7a为本发明实施例1的磷酸化蛋白质丰度的均值 (in (mean))与标准差 (in (sd))的线性拟合图；图7b为本发明实施例1的残差的直方图；图7c为本发明实施例1的磷酸化蛋白质修饰组火山图；图7d为本发明实施例1的磷酸化蛋白质修饰组差异位点热图；图8a为本发明实施例1的磷酸化变化率的均值(in (mean))与标准差(in (sd))的线性拟合图；图8b为本发明实施例1的残差的直方图；图8c为本发明实施例1的磷酸化变化率组火山图；图8d为本发明实施例1的磷酸化变化率组差异位点热图；图9为本发明实施例1的磷酸化蛋白质修饰组磷酸化差异位点韦恩图；图10a为本发明实施例1的差异磷酸化位点所属蛋白质go富集气泡图；图10b为本发明实施例1的差异磷酸化位点所属蛋白质生物学过程go弦图；图10c为本发明实施例1的突触组织相关的蛋白质表达热图；图10d为本发明实施例1的突触组织关键蛋白质top 10；图10e为本发明实施例1的差异磷酸化位点所属蛋白质kegg富集柱状图；图11a为本发明实施例1的脊髓损伤突触组织的激酶-底物网络图，左侧为激酶，右侧为底物；图11b为本发明实施例1的脊髓损伤syn1的激酶激酶-底物网络图，横线为非激酶-底物联系，竖线为激酶-底物联系（p》0.05），橙色正方形为激酶-底物联系（p《0.05）；图12a为本发明实施例1的syn1高度相关蛋白质go富集分析；图12b为本发明实施例1的syn1高度相关蛋白质kegg富集分析；图13a为本发明实施例1的syn1全蛋白质组统计数据；图13b为本发明实施例1的syn1磷酸化蛋白质修饰组统计数据；图14a为本发明实施例1的全蛋白质水平syn1 western blot；图14b为本发明实施例1的磷酸化蛋白质水平 syn1 ser62 western blot。
具体实施方式
15.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明设计、阳性样本验证和结果分析。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
16.实施例11实验材料与仪器1.1动物来源所有实验均使用6-8周龄，体重17-23 g 的成年雌性spf级的 c57bl/6小鼠(购自南方医科大学实验动物研究所)。
17.1.2实验主要试剂bca蛋白定量试剂盒（thermo）；western 及 ip 细胞裂解液（meilunbio）；蛋白酶抑制剂混合物 (pi)（roche）；磷酸酶抑制剂 (ppi)（roche）；fe-mac磷酸化富集柱（sep-pak）；金水（质谱级）（thermo fisher science）；甲酸 (fa)（质谱级）（sigma-aldrich）；三氟乙酸 (tfa)（sigma-aldrich）；乙腈acn（质谱级）（thermo fisher science）；无水甲醇（广州化学试剂厂）；碘乙酰胺 (iaa)（sigma-aldrich）；二硫苏糖醇 (dtt)（sigma-aldrich）；尿素 (urea)（sigma-aldrich）；胰蛋白酶（生夏蛋白v5280）；无水乙醇（广州化学试剂厂）；四乙基溴化铵 (teab)（sigma-aldrich）；irt kit（biognosys）；吐温 (tween)（sigma-aldrich）；ecl化学发光底物发光液（bio-rad）；pvdf膜（millipore）；5x loading buffer（bio-rad）；蛋白marker（bio-rad）；脱脂奶粉（genebase）；过硫酸铵 (aps)（sigma-aldrich）；十二烷基硫酸钠 (sds)（sigma-aldrich）；四甲基乙二胺 (temed)（sigma-aldrich）；丙烯酰胺（sigma-aldrich）；1.5m tris-hcl缓冲液（sigma-aldrich）。
18.1.3实验主要抗体兔抗syn1单克隆抗体（1:1000）（proteintech）；兔抗syn1 ser62单克隆抗体（1:500）（bioworid）；β-actin (i102) polyclonal antibody（1:2000）（bioworid）；兔二抗（1:5000）（bioworid）。
19.1.4实验主要仪器制冰机（湖北黄石市医疗器械厂）；电子天平仪器（奥豪斯仪器有限公司）；低温型组织研磨仪（上海贺帆仪器有限公司）；非接触超声仪器（新芝生物公司）；冷冻离心机（湘仪）；质谱仪（lumos obitrap）；酶标仪（biotek）；真空除盐泵（agilent）；millopore纯水系统（广州皇河仪器科技有限公司）；恒温培养摇床（上海一恒集团）；水浴锅（常州普天仪器制造有限公司）；涡旋震荡仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；冻干机（湖南赫西仪器装备有限公司）；蛋白胶电泳装置（bio-rad）；全自动化学发光图像分析系统（上海天能）。
20.1.4主要试剂配制（1）质谱实验相关试剂配方a) 8 m urea：24.024 g urea 溶解于50 ml金水，用浓盐酸进行调节ph 值为8.0b) 1 m dtt：154.2 mg dtt 溶解于1 ml金水c) 1 m iaa：184.96 mg iaa 溶解于1 ml金水d) conditioning buffer：0.1 % tfa溶于20 %乙腈溶液
e) washing buffer：0.1% tfa 溶于5 %乙腈溶液f) elution buffer：0.1% tfa 溶于60 %乙腈溶液（2）western blot 相关试剂配方a）5% 浓缩胶超纯水
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2.1 ml30% 单体
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0.5 ml1.5m tris-hcl ph 6.8
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0.38 ml10% sds
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30 μl10%aps
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30 μltemed
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3 μlb)10%分离胶超纯水
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6.9 ml30% 单体
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4 ml1.5m tris-hcl ph 8.8
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0.75 ml10% sds
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60 μl10% aps
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60 μltemed
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9 μlc)电泳缓冲液 (10
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)tris-base
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30.3 gglycine（甘氨酸）
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144.4 gsds
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10 g纯水
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1000 mld）转膜缓冲液 (10
ꢀ×ꢀ
)tris-base
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37.9 gglycine（甘氨酸)
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187.7 g纯水
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1000 mle）转膜缓冲液 (1
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)10
×
转膜缓冲液
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80 ml无水甲醇
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200 ml纯水
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720 mlf）tbs缓冲液 (10
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)氯化钠
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80 g氯化钾
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2 gtris-base
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30 g纯水
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1000 mlg）tbst缓冲液 (1
ꢀ×
)10
×
tbs缓冲液
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50 mltween 20
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500 μl纯水
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450 μl
h）5%脱脂牛奶脱脂奶粉
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2.5 g1
×
tbst缓冲液
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50 l2实验方法2.1 建立小鼠脊髓损伤模型(1)本实施例采取6-8周龄，体重17-23 g的成年雌性spf级的 c57bl/6小鼠构建脊髓损伤模型。将6只小鼠随机分为2组：假手术组 (sham) 和损伤组 (injury)。对2组小鼠予麻醉前禁食，采取腹腔注射的方式用三溴乙醇深度麻醉小鼠。麻醉成功后予背部剃毛，俯卧置于操作台上，常规碘伏消毒。
21.(2)损伤组小鼠作为实验组，以脊柱最高点为起点做2 cm长度的皮肤切口，钝性分离小鼠背部皮肤肌肉，暴露t9-t11脊柱节段。并以t10为中心进行椎板切除术，充分暴露脊髓。利用lisa脊髓撞击器进行损伤，计算机参数调整至深度为1.8 mm，时间0.35 s，平均撞击力为1.25 n进行撞击，可见脊髓组织迅速肿胀、淤血，尾巴出现摆尾反射，双下肢扑动。造模成功后，依次缝合皮下组织与皮肤。
22.(3)假手术组小鼠作为对照组，只进行皮肤切开，不对脊髓进行处理，依次缝合皮下组织与皮肤。
23.(4)术后将小鼠放置在37
°
c保暖，等待至小鼠麻醉苏醒。再将小鼠分开笼子饲养，保证充足的食物来源。造模成功后，对所有小鼠皮下注射1 ml含有抗生素的0.9% nacl溶液预防感染，并每天进行人工膀胱按摩挤尿，持续3 d。
24.2.2 小鼠脊髓组织获取(1)将上述6只小鼠通过腹腔注射的方式用戊巴比妥钠深度麻醉小鼠，麻醉良好后，俯卧置于操作台上，常规碘伏消毒。
25.(2)在小鼠背部皮肤用手术刀切开皮肤，钝性分离肌肉，暴露小鼠脊柱进行椎板切除术，使由硬脊膜包裹的脊髓全长暴露出来。
26.(3)提取小鼠脊髓全长，剥离脊髓硬脊膜，用pbs进行漂洗3次，分别装入2 ml 冻存管中，用液氮迅速冷冻，储存于
ꢀ‑
80
°
c冰箱。
27.2.3 组织研磨与裂解（1）在
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80℃冰箱里取出小鼠脊髓组织置于干冰上，在超净台将脊髓组织剪碎，分别放入2 ml研磨管内。用无水乙醇将研磨珠清洗干净，并用吸水纸吸干，每个研磨管加入3颗小研磨珠，用预冷的组织研磨仪进行研磨（工作条件：70 hz，2 min，-50
°
c）研磨至粉末状。
28.（2）向组织研磨管中加入含 ppi 和 pi（roche的用1 ml 金水溶解后分别是10
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和50
ꢀ×
）细胞裂解液1 ml。用镊子取出组织研磨管内的研磨珠，无接触式超声预冷至4℃，开启预冷系统水循环，将研磨管内的组织进行超声破碎（4℃, 超声5 s间隔10 s，连续10 min），可见组织颗粒物完全裂解。
29.（3）将装有组织的研磨管置于冰上裂解30 min，每10 min剧烈震荡1次。裂解后的组织在预冷的离心机进行离心(工作条件: 4℃, 12000 rpm, 30 min )，用移液枪吸取上清液转移至1.5 ml 离心管。
30.2.4 高效率蛋白质酶解
（1）将上一步提取的脊髓蛋白样液通过 bca 试剂盒检测蛋白液浓度：用超纯水梯度稀释蛋白质标准品，配制成终浓度分别为0 μg/μl 、0.0625 μg/μl 、0.125 μg/μl 、0.25 μg/μl 、0.5 μg/μl 、1 μg/μl 、2 μg/μl 的标准样品。按照每样品200 μl b 液、4 μl a 液的比例配制bca工作液，37℃培养箱孵育30分钟，使用酶标仪读取波长为570 nm 处的吸光值。根据bca试剂盒检测的蛋白浓度，取3 mg 相应体积的蛋白样液置于15 ml 离心管中进行酶解。
31.（2）在 15 ml 离心管中加适当体积的8 m urea，使其终浓度大于 4 m （即1：1），即以最低浓度的样品为准，其余较高浓度样品用8 m urea 补齐至相同体积，充分震荡。
32.（3）配制1 m的 dtt （金水配制），加适量体积，使其工作浓度为 50 mm （即1：20），充分震荡，37℃ 水浴1 h，使蛋白质的二硫键充分还原。
33.（4）配制1 m的 iaa （金水配制）, 加适量体积，使其工作浓度在135 mm ，充分震荡，室温避光放置30 min 。
34.（5）用1 ml teab 润洗超滤管，进行离心（工作条件：20℃, 4000 rpm, 20 min） ，若液体没有完全离下去，需要转换离心角度90
°
，避免超滤管膜破损，直至液体全部离下去，每次离心不能超过15 min，避免超滤管膜破损。
35.（6）将样品加入润洗后的超滤管，每管体积不能超过1 ml，进行离心（工作条件：20℃, 4000 rpm, 20 min），若液体没有完全离下去，需要转换离心角度90
°
，避免超滤管膜破损，离心至液体全部离下去，每次离心不能超过15 min，避免超滤管膜破损。
36.（7）在超滤管中加入1 ml 8 m urea，充分震荡，离心至液体全部离下去（工作条件：4℃, 4000 rpm, 20 min），重复2次。
37.（8）在超滤管加入1 ml teab，充分震荡，进行离心（工作条件：4℃, 4000 rpm, 20 min） ，离心至液体全部离下去，重复5次。丢弃收集管，换至新的收集管。
38.（9）将公司配套的hcl溶液溶解胰酶，配制胰酶浓度为1 μg/μl ，依次在超滤管中加入50 mm teab 500 μl和配置好的质谱级胰酶溶液75 μl 。
39.（10）在超滤管中用干净枪头吹散絮状蛋白使溶液呈浑浊，充分震荡5 min，将超滤管用保鲜膜封闭，放置于37℃、200 rpm 摇床摇晃16-18 h，在8 h 后再次用干净枪头吹散絮状蛋白使溶液呈浑浊，充分震荡5 min。
40.（11）将上一步的超滤管进行离心到收集管（工作条件：4℃, 4000 rpm, 20 min），再加入1 ml 金水后，用干净枪头吹散絮状蛋白使溶液呈浑浊，充分震荡5 min ，进行离心（工作条件：4℃, 4000 rpm, 20 min），收集酶解后肽段溶液。
41.（12）酶解后肽段溶液进行bca试剂盒检测浓度，计算蛋白样品酶解效率。
42.2.5 高通量除盐（1）连接好真空除盐仪器，检测密闭性。用纯水清洗除盐柱连接头。
43.（2）活化除盐柱：加入甲醇活化sep-pak c18 除盐柱10 min，真空泵压力控制不能超过300 kpa 。
44.（3）平衡除盐柱：配制含0.1 % fa 的2 % 乙腈作为平衡液 (condition buffer)，过柱子2次，每次 1 ml，首次过柱子停留1 min。
45.（4）吸取样品：在负压槽的架子上放置废液管，将酶解后肽段溶液过柱子3-5次，每次1 ml，首次过柱子停留1 min，用真空泵除盐切记勿使压力差过大导致流速过快产生气泡
dia 模式检测顺序进行质谱分析，全蛋白质组采取 dia 模型进行质谱分析。
61.2.8 搜索数据库本实施例利用 maxquant 平台对上述 dda 数据进行定性分析建立小鼠磷酸化蛋白质数据库，利用 spectronaut 软件对 dia 进行数据定量分析。通过与小鼠蛋白数据库比对后，分别导出全蛋白质组和磷酸化质组的图谱数据比对结果。
62.2.9 生物信息学统计分析方法2.9.1 分析使用软件本实施例主要采用 r 软件 (4.2.0) 进行生物信息学分析。本实施例认为对数据的缺失值处理对稳妥方法是：对于蛋白质定量值偏移过大（即低于500）定义为缺失值，并且对蛋白质定量缺失值进行平均值填补。
63.2.9.2 样品重复性评价本实施例在蛋白表达量提取过程中采取生物重复样本，因此，采用主成分分析(principal component analysis, pca)和箱式图 (box-plot) 可视化对样品间的蛋白质重复性进行评价，以检验生物学重复样品的实验结果是否具有统计学一致性，有助于提高实验的准确性和可信度。
64.2.9.3 全蛋白质组差异分析基于对全蛋白质组数据质量质控，既往研究表明，幂律全局分析 (plgem) 模型有利于对蛋白质组数据进行统计分析，也是本团队常用的蛋白质组学分析模型之一。本实施例通过 plgem 模型进行对全蛋白质组定量结果进行拟合，并对数据质量进行评价。利用 plgem 模型进行差异分析，并且对差异蛋白质基于 r 语言使用 ggplot2 包进行火山图和热图可视化展示。
65.2. 9.4蛋白质功能富集分析本实施例对差异蛋白进行功能注释，并且设定富集检验显著性 p 值小于 0.05。
66.go（gene ontology, 基因本体论）富集分析是通过对基因进行分类和注释，揭示不同基因和基因集的生物学功能和相互关系，主要从三个层级：分子功能、细胞组分和生物过程对蛋白或基因进行功能分析。
67.kegg （kyoto encyclopedia of genes and genomes, 京都基因与基因组百科全书）是一种系统生物学数据库，集成了基因组、生化反应、代谢通路等方面的信息。对差异蛋白质进行富集分析可以帮助研究人员理解基因和蛋白质在代谢通路中的功能和相互作用，为研究生物学过程、发现新的生物标志物以及开发药物提供重要的线索。
68.基因集富集分析 (gene set enrichment analysis, gsea)：用于分析高通量基因表达数据中基因集在不同实验条件下的富集情况，以便研究基因表达变化与生物学过程之间的关系。本实施例将全蛋白质组数据进行 gsea，从而初步判断该基因集内基因的协同变化对表型变化的影响。
69.2.9.5 磷酸化蛋白质修饰组和磷化变化率差异分析基于上述的数据质量质控，本实施例利用磷酸化蛋白质修饰组和全白质组计算出磷酸化变化率（即用磷酸化肽段的丰度除以对应蛋白质的丰度），并利用 plgem 模型分别对磷酸化蛋白质修饰组和磷酸化变化率组数据结果进行差异分析，并找出两组中重叠同向变化的差异磷酸化位点为差异磷酸化位点。
70.2.9.6 差异磷酸化位点所属蛋白质功能富集分析通过上述筛选的磷酸化蛋白质差异位点结合 go 数据库和 kegg 数据库进行功能富集分析，探讨差异磷酸化位点相关蛋白质在脊髓后参与的代谢通路中的功能和相互作用。
71.2.9.7 激酶-底物调控网络构建为了探究脊髓损伤的磷酸化调控相关机制以及磷酸化激酶的相关作用，igps 软件是基于 gps 开发的高级版本，可以预测出磷酸化修饰位点潜在调节的激酶的蛋白。通过 igps 软件对差异磷酸化位点进行激酶预测，构建脊髓损伤后的激酶-底物调控网络，并且利用 cystoscape 绘制激酶-底物网络图。
72.2.9.8 syn1高度相关蛋白质功能富集分析基于全蛋白质组数据，进行syn1的相关性分析，定义相关性系数 》0.7的蛋白质为syn1高度相关性蛋白质，并且进行go功能富集分析和kegg富集分析。
73.2.10 western blot（免疫印迹实验）(1) 制备样品：利用 bca 试剂盒检测蛋白样品浓度，各样品取等量蛋白（根据实验需要取30-100 μg 左右）至新 ep 管，并用细胞裂解液补齐体积，加入5
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loading buffer， 95 ℃水浴加热 10 min后冰上冷却。
74.(2) 配制电泳凝胶：用清水洗干净 1.5 mm薄玻璃板和厚玻璃板，放至常温晾干，然后用架子夹好固定。用纯水检验制胶架子的密闭性。先加入10 %分离胶，加入无水乙醇赶走气泡，压平分离胶，等待20-30 min后分离胶凝固后，加入5 %的浓缩胶，水平插入梳齿，等待20-30 min后浓缩胶凝固。
75.(3) 上样：用电泳槽夹好玻璃板，往里外注满配好的电泳液，水平取出梳齿，避免上样孔歪斜，用移液枪在上样孔加入样品；(4) 电泳：插好电源，调整参数：恒压 80 v。待样品跑过上胶后，把电压调成 120 v，根据目的蛋白分子量与内参蛋白分子量，停止电泳，避免样品跑离凝胶；(5) 转膜：将提前配好预冷的 1 l 转膜液放至操作盘里，然后放“三明治夹子”浸泡在转膜液中，黑色面在下，依次在上放置海绵以及滤纸，用剪刀剪一小块 8
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5 cm 的 pvdf 膜，在右上角剪角，这样可以避免转膜后方向颠倒，电泳结束后，剥开薄玻璃板，截去浓缩胶，保留分离胶，轻轻分离分离胶，把分离胶轻轻放至滤纸上，然后把准备好的 pvdf 膜浸泡在甲醇中 1 min，以达到活化的目的，然后将 pvdf 膜放至分离胶上，调整位置，让 pvdf 膜全部覆盖在分离胶上，同时避免 pvdf 膜下产生气泡影响转膜。整个过程需轻柔，避免分离胶破裂。将“三明治夹子”放至电转槽中，然后把操作盘里的转膜液倒至电转槽中，确保 pvdf 膜全部浸泡在电转液中，再在其余空的位置放 1 块冰盒，以确保电转的安全。调整参数：恒压 100 v，电流 235 ma ，120 min 开始电转；(6) 封闭：配制 5% 封闭液，将转膜完成后的 pvdf 膜放至一个含有 tbst （含 tween）的小盒子里清洗 2 次，去除 tbst（含 tween ），加入配好的 5% 封闭液，使封闭液浸没pvdf 膜为准，放摇床上缓慢摇 1 h；(7) 孵育一抗：封闭完成后，去除封闭液，加入 tbst （含 tween）清洗 pvdf 膜，放摇床摇 5 min，去除 tbst （含 tween），此清洗步骤重复 3 次，以达到去除全部封闭液的目的，将 pvdf 膜浸泡于配好的一抗溶液中，然后置于 4 ℃ 摇床缓慢摇晃过夜；
(8) 孵育二抗：回收一抗溶液，加入 tbst （含 tween ）清洗 pvdf 膜，放摇床摇 5 min，去除 tbst（含 tween），此清洗步骤重复 3 次，加入配好的二抗，使 pvdf 膜浸泡在二抗溶液中，放摇床缓慢摇 1 h；(9) 显影：去除二抗溶液，加入 tbst （含 tween）清洗 pvdf 膜，放摇床摇 5 min，去除tbst（含 tween），此清洗步骤重复 3 次，将准备好的发光液、镊子、纸巾和 pvdf 膜拿至生物分子成像仪前，用镊子轻轻夹起 pvdf 膜，正面朝上放至纸巾中，尽量吸干残留的 tbst（含 tween ），然后放至生物分子成像仪，在目的蛋白条带上滴入发光液进行显影，保存结果。
76.3 实验结果与统计分析p《0.05&foldchange》1.5视为统计学差异变化，所有数据分析均在r 4.2.0软件中进行。
77.3.1全蛋白质组质谱数据质控由于蛋白质组数据质量影响后续的分析与验证，因此需要对蛋白组数据进行质量控制，本实施例通过数据分布比较和pca分析评估蛋白组数据质量。如图1a和1b 所示的质控结果表明，6个样本的蛋白表达量分布趋势相似。但是与对照组（假手术）相比，脊髓损伤组的蛋白表达量存在差异。两组的组内差异较小，组间差异较大。以上结果表明数据整体存在的系统误差较小，适合进一步探究。
78.3.2 全蛋白质组差异分析plgem模型常用于拟合基因组和蛋白组表达数据集。因此使用plgem模型拟合脊髓损伤的全蛋白质组数据，然后筛选具有统计意义的差异表达蛋白。结果表明，全蛋白质丰度数据平均值与标准差呈线性关系，r2为0.993（图2a），残差丰度平均值的秩没有偏倚，属于正态分布（图2b, 2c, 2d），说明其对于脊髓损伤修复的蛋白组数据有好的线性拟合度，可用于后续分析。
79.本实施例将plgem模型差异分析p《0.05且foldchange》1.5的蛋白质定义为差异蛋白（脊髓损伤组vs对照组；different proteins , deps）。在全蛋白质组数据中，筛选出472个差异蛋白，其中包括348个上调差异蛋白和124个下调差异蛋白（图3a）。热图充分展示了筛选出的deps可以明显区分对照组和脊髓损伤组（图3b）。
80.3.3 全蛋白质组差异蛋白富集分析为了进一步探究脊髓损伤影响的生物学过程以及细胞功能情况，对472个差异蛋白进行了go富集分析（图4a）。从结果可以看出，在生物学过程 (biological process, bp) 富集于小分子分解代谢、外部刺激反应的正调节、磷酸化的负向调节、对氧化应激的反应、突触组织、去磷酸化以及神经元死亡相关等生物学过程。其中突触组织是神经元之间的神经信号传递的特殊结构。脊髓损伤后，神经元和突触的结构和功能都发生了改变，这些变化可能导致神经元之间的信号传递不畅或失常，进一步影响神经系统的正常功能。氧化应激的通路也是脊髓损伤的重要信号通路之一，影响着神经元的功能，与脊髓损伤治疗和预后相关。然而磷酸化的调控机制可以调节神经元的代谢、和运动等生物学过程。在细胞组分(cellular component, cc) 主要富集有含胶原蛋白的细胞外基质、突触膜、线粒体基质、内质网膜等，在分子功能 (molecular function, mf) 主要富集氧化还原酶、裂解酶活性、磷酸酶活性、磷酸酯水解酶活性等。在磷酸化的调控机制中，磷酸化酶和磷酸酶可以调节脊
髓神经元的兴奋性和抑制性，从而影响神经元的发放行为和神经递质释放。
81.另外，差异蛋白的kegg富集分析结果提示在甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢和鞘磷脂代谢通路显著聚集（图4b），直接反映了脊髓损伤后局部代谢特征。对全部蛋白质进行gsea富集，结果提示主要富集氨基酸代谢、羧酸代谢、有机酸代谢、小分子代谢、类固醇代谢等（图4c）。既往研究表明，代谢异常是脊髓损伤后的常见并发症之一，代谢是脊髓损伤中必不可少因素，脊髓损伤后机体代谢发生改变，导致血脂异常、糖尿病和心血管疾病等发生率增加，与疾病的进展以及预后密切相关。
82.综上，差异蛋白质的富集分析结果表明，脊髓损伤的病理生理机制尤为复杂，影响着脊髓损伤的治疗和预后，然而磷酸化调控丰富了脊髓损伤的疾病机制，深入探究脊髓损伤的磷酸化调控具有重要意义。
83.3.4脊髓损伤磷酸化蛋白质修饰组学数据统计如图5a-5e所示，在脊髓损伤磷酸化蛋白质修饰组数据统表明，共鉴定到2730个磷酸化蛋白质、11265条磷酸化肽段，分别占比89.6%、77.9%，说明本次磷酸化富集效果良好。在11265条磷酸化肽段中，共有5274个磷酸化位点，其中在丝氨酸 (ser)、苏氨酸 (thr) 以及酪氨酸 (tyr) 发生磷酸化的比例分别是90.36%、8.84%、0.80%，与其它哺乳动物的磷酸化蛋白质修饰组相似。
84.3.5磷酸化蛋白质修饰组质谱数据质量质控磷酸化蛋白质修饰组通过数据分布比较和pca分析评估蛋白组数据质量，如图6a和6b的质控结果显示，6个样本总体蛋白表达量分布相似，组内差异小，组间差异明显，说明磷酸化蛋白质修饰组数据整体系统误差小，假手术组和脊髓损伤组组内重复性好，组间差距大，适合进行后续分析。
85.3.6磷酸化蛋白质修饰组和磷酸化变化率组plgem分析对于磷酸化蛋白质修饰组数据的分析，如果直接进行组间磷酸化蛋白丰度差异的比较，这种差异的变化无法准确判断是来自蛋白本身，还是来自于磷酸化水平的变化。因此，本实施例用全蛋白质丰度校正磷酸化肽段丰度，计算磷酸化变化率（即用磷酸化肽段的丰度除以对应蛋白质的丰度），然后利用plgem模型分别对磷酸化蛋白质修饰组和磷酸化变化率组进行差异分析。
86.磷酸化蛋白质修饰组数据在plgem拟合结果显示r
²
=0.994（pearson r=0.843）（图7a），残差值符合正态分布（图7b）。磷酸化蛋白质修饰组通过差异分析（p《0.05&foldchange》1.5）筛选出590个差异位点，包括314个上调位点和276个下调位点（图7c和7d）。
87.磷酸化变化率组在plgem拟合结果显示r
²
=0.994（图8a），残差值符合正态分布（图8b）。磷酸化变化率组通过差异分析（p《0.05&foldchange》1.5）筛选出641个差异位点，包括341个上调位点和300个下调位点（图8c和8d）。
88.3.7差异磷酸化蛋白位点筛选为了提高数据的可靠性，本实施例定义磷酸化蛋白质修饰组和磷酸化变化率组具有同向差异变化的重叠位点为差异磷酸化位点。结果表明，本实施例的差异磷酸化位点共有434个差异位点，包括245个上调位点和189个下调位点（图9）。
89.3.8差异磷酸化位点所属蛋白质富集分析为了进一步探讨差异磷酸化位点所属蛋白质的功能，对434个差异磷酸化位点的
所属蛋白质进行go富集分析。结果表明在生物学过程主要富集在突触组织、轴突生成、树突发育和蛋白质自身磷酸化等通路。在细胞定位中富集突触组织、神经递质运输、神经递质分泌、神经元突触的调节等；在分子功能中富集肌动蛋白结合、磷脂结合、微管蛋白结合、细胞骨架结构等（图10a）。其中神经递质传输、囊泡定位和突触组织都是神经信号传递的重要组成部分，对于神经系统的正常功能至关重要，而 syn1是在上述四个神经信号传递通路的唯一交集（图10b）。在脊髓中，神经元通过突触进行信息传递，而突触的结构和功能受到神经递质和囊泡定位的调节。突触组织信号通路上的蛋白变化趋势有助于了解脊髓损伤后的信号传导通路变化，质谱结果表明通路上不同蛋白质在脊髓损伤后的变化趋势截然不同（图10c）。利用突触组织相关的蛋白质联合string数据库进一步分析，寻找出通路上的top 10关键蛋白质，结果表明syn1是该通路上的中心蛋白质（图10d）。此外在kegg数据库中主要富集糖代谢、轴突导向、erbb信号通路、碳代谢和突触囊泡周期等（图10e）。
90.综上，磷酸化的差异位点所属蛋白质富集分析反映了脊髓损伤的局部特征，并且鉴定了脊髓损伤后的信号通路。突触组织是脊髓损伤神经元传递信号的关键通路之一，在该通路上最显著变化的蛋白为syn1。
91.3.9 激酶-底物网络构建本实施例对差异磷酸化位点通过igps软件进行了激酶预测分析，得到脊髓损伤后激酶-底物互相作用表。通过对突触组织相关的蛋白质磷酸化位点进行激酶-底物网络构建（图11a），结果表明，激酶与syn1、marcks、gap43、gphn、rph3α这些蛋白质存在调控作用。其中syn1的多个磷酸化位点为下游底物，分别为ser62、ser67、ser510、ser551、ser553、ser605（图11a），因此我们构建脊髓损伤syn1激酶-底物调控网络。结果表明syn1的上游激酶主要有camk2α、camk2g、cdk14、cdk16、gsk-3α、gsk-3β、pnck、prkcg、srpk1，其中gsk-3β与syn1的多个磷酸化位点存在调控作用且具有统计学意义。通过热图可视化可以更清晰展示syn1上游激酶变化趋势（图11b），有助于深入探究脊髓损伤后syn1 的磷酸化调控机制。
92.3.10 syn1 高度相关蛋白质富集分析为了对syn1进一步的深入研究，将全蛋白质谱数据进行相关性分析，把与syn1皮尔森相关性系数 》0.7的蛋白质定义为syn1高度相关性蛋白质。利用syn1的高度相关蛋白质进行go富集分析，在生物学过程中主要与有机磷合成、突触组织、对氧化应激的反应、轴突发生、神经递质的传递和神经丝细胞骨架组织等通路相关；在细胞定位富集与突触、髓鞘、轴突、微管、树突、神经元突触等相关；在分子功能主要与肌动蛋白、磷脂结合蛋白等相关（图12a）。富集分析结果表明，与syn1高度相关蛋白质与神经系统的功能显著相关。脊髓损伤可以影响轴突的发生和维护，从而影响神经递质传递和突触组织的形成。脊髓损伤还会导致氧化应激反应的增加，这可能会进一步影响神经元的生存和功能。
93.此外，结合kegg数据库进行富集分析，结果提示与乙醚脂质代谢、甘油磷脂代谢和gaba能突触相关（图12b）。以上这些结果揭示syn1高度蛋白质的参与的代谢通路以及生物学功能。
94.3.11 脊髓损伤后syn1 多个磷酸化位点上调基于磷酸化变化率的差异分析和生物学过程的通路鉴定，syn1在脊髓损伤中发挥重要的功能作用。在全蛋白质组中，syn1 在脊髓损伤后为下调变化（图13a）。然而，我们发现磷酸化的多个位点呈现上调变化，分别为ser62、ser67、ser437、ser510、ser551、ser553、
ser568、ser605（图13b）。因此，深入探究syn1的磷酸化调控有助于了解脊髓损伤的病理生理机制。
95.3.12 western blot验证质谱数据准确性在鉴定syn1 磷酸化位点中，syn1 ser62是目前常用研究位点，也是神经学科研究的关键磷酸化位点之一。因此挑选了syn1和syn1 ser62利用脊髓组织进行western blot验证。在脊髓组织全蛋白质水平中表明，syn1 在脊髓损伤组后为下调趋势（图14a）。基于全蛋白质组的结果，本实施例以syn1 的表达量作为校准水平，以syn1 的表达定量去比较该蛋白质位点的磷酸化水平变化。结果表明，在syn1 的表达量一致的情况下，syn1 ser62在脊髓损伤组呈现上调的趋势（图14b）。western blot的结果与质谱数据结果一致。
96.综上所述，本发明通过质谱技术获得脊髓损伤相关蛋白质组学的数据，鉴定了与脊髓损伤相关的生物学信号通路。此外，通过磷酸化蛋白质修饰组学生物信息学分析，揭示了在脊髓损伤后突触组织相关的蛋白质发生显著变化，并寻找出syn1和syn1 ser62与脊髓损伤密切相关，同时构建了脊髓损伤后突触组织和syn1的激酶-底物调控网络。western blot证实syn1在脊髓损伤组中表达量下调，syn1 ser62在脊髓损伤组表达上调，与质谱分析结果一致。本发明开创性地提供上述生物标志物在脊髓损伤诊断和预后方面的应用，为研究治疗脊髓损伤的药物提供新靶点，本发明具有重要的临床、科研及药物转化价值。
97.以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。

技术特征：
1.一种基于蛋白质组学及磷酸化蛋白质修饰组学的脊髓损伤生物标志物，其特征在于：所述生物标志物选自下述物质中的一种或多种：syn1、syn1 ser62。2.基于蛋白质组学及磷酸化蛋白质修饰组学的脊髓损伤生物标志物在制备诊断脊髓损伤的产品中的应用，其特征在于：所述生物标志物选自下述物质中的一种或多种：syn1、syn1 ser62。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述产品为检测试剂、试剂盒、微阵列或生物芯片。4.如权利要求2所述的应用，其特征在于： 所述生物标志物用于通过蛋白质组学及磷酸化蛋白质修饰组学的分析手段对样品进行检测，所述样品来自脊髓组织。5.基于蛋白质组学及磷酸化蛋白质修饰组学的脊髓损伤生物标志物在制备治疗脊髓损伤的药物中的应用，其特征在于：所述药物靶向所述生物标志物，所述生物标志物选自下述物质中的一种或多种：syn1、syn1 ser62。

技术总结
本发明提供了一种基于蛋白质组学及磷酸化蛋白质修饰组学的脊髓损伤生物标志物，所述生物标志物选自下述物质中的一种或多种：SYN1、SYN1 Ser62。本发明通过进行脊髓损伤的蛋白质组学及磷酸化蛋白质修饰组学的研究，最终筛选出脊髓损伤中表达水平具有显著差异的SYN1和SYN1 Ser62作为生物标志物，开创性地提供上述生物标志物在脊髓损伤诊断和预后方面的应用，为研究治疗脊髓损伤的药物提供新靶点，本发明具有重要的临床、科研及药物转化价值。值。值。


技术研发人员：纪志盛 王珂 肖永春 林宏生
受保护的技术使用者：暨南大学附属第一医院（广州华侨医院）
技术研发日：2023.09.06
技术公布日：2023/10/15