FimH突变体、其组合物及其用途的制作方法

fimh突变体、其组合物及其用途
技术领域
1.本发明涉及医学微生物学和疫苗领域。具体而言，本发明涉及包含fimh凝集素结构域的多肽，该fimh凝集素结构域包含导致该fimh凝集素结构域处于对甘露糖具有低亲和力的构象中的至少一个氨基酸突变并且在施用于受试者时诱导高水平的抗体介导的对大肠杆菌(e.coli)向膀胱上皮细胞粘附的抑制作用。此外，本发明涉及包含此类多肽的组合物，并且涉及通过施用免疫原性多肽在有需要的受试者中刺激免疫应答的方法。


背景技术：

2.造成肠外感染的大肠杆菌菌株已经被称为肠外病原性大肠杆菌(expec)。expec是在门诊、长期护理和医院环境中引起肠外感染的最常见的肠革兰氏阴性生物体。由大肠杆菌引起的典型肠外感染包括尿路感染(uti)、菌血症和败血症。大肠杆菌是严重败血症的主要原因，也是高发病率和高死亡率的原因。
3.与肠杆菌科(enterobacteriaceae)的其他成员一样，expec产生有助于向粘膜上皮表面附着的i型菌毛。这些i型菌毛是从肠杆菌科的表面成员发出的毛发状结构。i型菌毛的主要组分是fima的重复亚单元，这些亚单元呈右手螺旋排列以形成长度大约为1μm且直径大约为7nm的具有中心轴孔的细丝。连同作为主要亚单元的fima一起，菌毛细丝还含有作为次要蛋白质亚单元的fimf、fimg和fimh。次要蛋白质亚单元fimh是甘露聚糖结合粘附素，其促进i型菌毛化细菌粘附到真核细胞表面上的含甘露糖的糖蛋白上，并且代表与各种靶标(包括甘露聚糖和纤连蛋白)结合的蛋白质家族。免疫电子显微术研究已经揭示，fimh策略性地放置在i型菌毛的远侧尖端，在那里它似乎与fimg复合，从而形成柔性原纤维结构，并且还沿细丝以各种间隔纵向放置。
4.已证实fimh粘附素蛋白在针对uti的各种临床前模型中用作疫苗时诱导保护作用(langermann s等人，1997,science,276:607-611；langermann s，等人，2000,j infect dis,181:774-778；o’brien vp等人，2016,nat microbiol,2:16196)。
5.已经证实，在大肠杆菌感染期间，与甘露糖基化受体结合的粘附素fimh的凝集素结构域可以采用以下两种不同的构象：对甘露糖低亲合力(紧张)构象和对甘露糖高亲合力(伸长/松弛)构象(kalas等人，2017,sci adv 10；3(2))。低亲和力构象促进细菌运动和新组织的定殖。高亲和力构象确保在尿液排泄的机械力下紧密的细菌粘附。此外，证实针对低亲和力变体的抗体会阻断细菌与尿路上皮细胞的结合，并减少膀胱中的cfu计数(tchesnokoca,2011infect immun.79(10):3895-904；kisiela,2013proc natl acad sci,19；110(47):19089-94)。
6.wo02102974描述了许多fimh突变体，它们全部在分子的峡谷区中包含氨基酸修饰。具体地，wo02102974描述了其中在结合口袋中的甘露糖相互作用残基发生突变的变体。选择这个突变位置是因为它将保持fimh突变体呈更开放的构象，并因而暴露出野生型蛋白质中难以接近的表位。然而，到目前为止，据我们所知，这些突变体中还没有一个被进一步作为疫苗候选物进行研究。在临床试验中，仅使用了野生型fimh。
7.因此，在本领域中仍然需要能够诱导针对由大肠杆菌引起的细菌感染的高度抑制性抗体的疫苗。


技术实现要素：

8.在第一方面，本发明提供了一种多肽，该多肽包含fimh凝集素结构域，该fimh凝集素结构域在与seq id no:1的氨基酸序列中的位置71相对应的位置处包含除苯丙氨酸(f)之外的氨基酸。
9.在第二方面，本发明提供了一种多肽，该多肽包含根据第一方面的fimh凝集素结构域，其中该多肽还在与seq id no:1的氨基酸序列中的位置144相对应的位置处包含除苯丙氨酸(f)之外的氨基酸。
10.在第三方面，本发明提供了一种编码根据本发明的多肽的多核苷酸。
11.在第四方面，本发明提供了一种包含根据本发明的多核苷酸的载体。
12.在第五方面，本发明提供了一种包含根据本发明的多核苷酸或载体的宿主细胞。
13.在第六方面，本发明提供了一种包含根据本发明的多肽、多核苷酸或载体的药物组合物。
14.在第七方面，本发明提供了用于在诱导针对肠杆菌科细菌的免疫应答中使用的根据本发明的多肽、根据本发明的多核苷酸、根据本发明的载体或根据本发明的药物组合物。本发明还涉及一种用于治疗或预防有需要的受试者的肠杆菌相关病症的方法，该方法包括施用有效量的根据本发明的多肽、根据本发明的多核苷酸、根据本发明的载体或根据本发明的药物组合物。
15.在第八方面，本发明还提供了一种用于产生多肽的方法，该方法包括从含有本发明的多核苷酸和/或本发明的载体的重组细胞表达该多肽，任选地，该方法还包括回收该多肽，然后任选地配制成该多肽的药物组合物。
附图说明
16.图1：由不同fimh变体诱导的抗体的功能性。wistar大鼠在第0天、第7天、第10天和第18天接受4次肌内免疫接种60ug/剂的与非弗氏佐剂组合的不同fimh变体(speedy大鼠模型，eurogentec)。在第0天(免疫接种前)以及第28天(免疫接种后)获得血清样品。
17.a)用各种fimh变体(在图下方所示)进行的初始实验。基于12步稀释曲线上拟合的四参数逻辑回归模型，计算抑制性抗体滴度(ic50)。数据表示每组2只动物的重复血清样品的平均值。
18.b)用fimh突变体f144v、f71y、以及f144v/f71y双突变体进行的单独的实验。基于6步稀释曲线上拟合的四参数逻辑回归模型，计算抑制性抗体滴度(ic50)。图表示出了以一式两份测量的血清样品的免疫接种前和免疫接种后的各个ic50滴度以及gmt(几何平均滴度)
±
95％ ci(置信区间)。lod：检测极限。
19.图2：通过nmr光谱法确定的在存在和不存在甘露糖苷配体的情况下不同fimh凝集素结构域变体的构象状态。左小图示出了当未结合甘露糖苷配体时(例如apo状态)，均匀地经
15
n标记的fimh
ld
变体在低亲和力状态(l)下的
15
n hsqc nmr谱，并且右小图示出了当结合了甘露糖苷配体时(例如配体状态)，高亲和力状态(h)下的谱。在框中指示了在结合甘露糖
苷配体后发生化学位移的关键氨基酸残基。除了残基1号和2号之外，这些残基已经从大肠杆菌k12的可公开获得的nmr谱中鉴定出来(rabbani s等人，j biol.chem.,2018,293(5):1835-1849)，这些残基对大肠杆菌23-10具有特异性，这表明与大肠杆菌k12的fimh
ld
相比，在apo状态下，野生型fimh
ld 23-10蛋白具有略微不同的构象。
具体实施方式
20.本发明提供了包含fimh凝集素结构域的新型多肽，其中该fimh凝集素结构域“锁定”在对甘露糖具有低亲和力的构象中，在本文中也被称为“低亲和力构象”。本发明部分地基于以下观察：呈甘露糖低亲和力构象的fimh抗原能够诱导可抑制甘露糖苷介导的粘附的抗体。这些抗体具有高度抑制性并且在预防或治疗细菌感染方面具有增强的作用。在本文中发现具有f71y突变的fimh凝集素结构域具有期望性质的令人惊异的良好组合，该组合例如使其非常适合用于针对uti的疫苗中，例如以预防或减少复发性uti。
21.因此，在第一方面，本发明提供了一种多肽，优选免疫原性多肽，该多肽包含在与seq id no:1的参考氨基酸序列中的位置71相对应的位置处包含除苯丙氨酸(f)之外的氨基酸的fimh凝集素结构域。
22.在第二方面，本发明还提供了一种多肽，优选免疫原性多肽，该多肽包含在与seq id no:1的参考氨基酸序列中的位置71和144分别相对应的两个位置处包含除苯丙氨酸(f)之外的氨基酸的fimh凝集素结构域。该“双突变体”保持锁定于低亲和力构象，并且因此同样能够诱导可抑制甘露糖苷介导的粘附的抗体。除诱导这些抑制性抗体之外，本文还发现fimh凝集素结构域的f71y和f144v双突变体不能切换回使该双突变体具有令人惊讶的高稳定性的高亲和力构象。这种不能转换回高亲和性构象的性质是非常理想的，该特性使该双突变体非常适合例如用于针对uti的疫苗中，例如以预防或减少复发性uti，因为它尤其确保了不需要另外的品质或稳定性控制来测试构象在储存期间或在其他储存或使用条件下是否稳定。
23.如本文所用的氨基酸位置71和144分别是指seq id no:1的fimh凝集素结构域的参考氨基酸序列中的位置71和144。在除seq id no:1之外的本发明的氨基酸序列中，优选地，氨基酸位置71和144存在于分别对应于seq id no:1中的位置71和144(在序列比对中，优选在使用默认设置的clustalw(1.83)序列比对中)的其他氨基酸序列中的位置。技术人员将知道如何使用如上文所定义的氨基酸序列比对算法来鉴定除seq id no:1之外的fimh凝集素结构域氨基酸序列中的相应氨基酸位置。
24.贯穿本技术，包含在与seq id no:1的氨基酸序列中的位置71相对应的位置处包含除苯丙氨酸(f)之外的氨基酸的fimh凝集素结构域的本发明的多肽将在本文中被称为“fimh(f71mut)”。同样地，包含在与seq id no:1的氨基酸序列中的位置71和144分别相对应的两个位置处包含除苯丙氨酸(f)之外的氨基酸的fimh凝集素结构域的本发明的多肽将在本文中被称为“fimh(f71mut/f144mut)”。
25.在某些实施方案中，fimh(f71mut)在与seq id no:1中的位置71相对应的位置处包含选自酪氨酸(y)和色氨酸(w)的组的氨基酸。
26.在某些实施方案中，fimh(f71mut)在与seq id no:1中的位置71相对应的位置处包含酪氨酸(y)。
id no:1中的位置144相对应的位置处的苯丙氨酸(f)氨基酸残基的取代。优选地，位置144处的氨基酸被选自由以下组成的组的氨基酸取代：缬氨酸(v)、异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、甘氨酸(g)、甲硫氨酸(m)和丙氨酸(a)。在一个优选的实施方案中，fimh(f71mut/f144mut)在位置144处包含将苯丙氨酸(f)取代为缬氨酸(v)。
35.在某些实施方案中，fimh(f71mut/f144mut)是在位置71处包含酪氨酸且在位置144处包含缬氨酸的非天然存在的多肽。在某些实施方案中，fimh(f71mut/f144mut)在位置71处具有酪氨酸而不是天然存在的苯丙氨酸，并且在位置144处具有缬氨酸而不是天然存在的苯丙氨酸。在某些实施方案中，fimh(f71mut/f144mut)在位置71处具有酪氨酸而不是除苯丙氨酸之外的其他天然存在的氨基酸，并且在位置144处具有缬氨酸而不是除苯丙氨酸之外的其他天然存在的氨基酸。
36.全长fimh(fimh
fl
)由两个结构域组成：n端凝集素结构域(fimh
ld
)通过短四肽环接头连接至c端菌毛蛋白结构域(fimh
pd
)。在本发明的某些实施方案中，包含根据本发明的fimh凝集素结构域的多肽不包含fimh菌毛蛋白结构域。在本发明的另一个实施方案中，包含根据本发明的fimh凝集素结构域的多肽还包含fimh菌毛蛋白结构域。在一个实施方案中，fimh(f71mut)或fimh(f71mut/f144mut)是全长fimh多肽，其中该fimh凝集素结构域包含如上文分别针对fimh(f71mut)和fimh(f71mut/f144mut)定义的氨基酸序列。在本发明的某些实施方案中，包含根据本发明的fimh凝集素结构域的多肽是融合至另一多肽的fimh凝集素结构域的融合多肽，该其他多肽可以是任何所关注的多肽，并且这既不需要与fimh相关也不需要在本质上与fimh相关。在某些实施方案中，包含本发明的fimh凝集素结构域的多肽是还包含fimh菌毛蛋白结构域并且另外包含另一多肽的融合多肽，该其他多肽可以是任何所关注的多肽，并且这既不需要与fimh相关也不需要在本质上与fimh相关。本发明的融合多肽还可以例如用作免疫原，用于疫苗接种目的。
37.在一个实施方案中，fimh
fl
多肽包含与seq id no:2具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，由此，优选地位置71或71和144包含如上文分别针对fimh(f71mut)和fimh(f71mut/f144mut)定义的氨基酸残基。在某些实施方案中，fimh
fl
多肽可以包含具有seq id no:2的序列，除了如本文所述的f71y和任选的f144v取代。在另一个实施方案中，多肽是与seq id no:4具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性或优选地至少具有其氨基酸22-300的fimh
fl
，由此，位置71或71和144包含如上文分别针对fimh(f71mut)和fimh(f71mut/f144mut)定义的氨基酸残基。在某些实施方案中，fimh
fl
多肽可以包含具有seq id no:4或至少其氨基酸22-300的序列，除了如本文所述的f71y和/或f144v取代。
38.在某些实施方案中，fimh
fl
多肽包含与如us6,737,063(以其全文并入本文)中所述的seq id no:23-45和55具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，由此，位置71或71和144包含如上文分别针对fimh(f71mut)和fimh(f71mut/f144mut)定义的氨基酸残基。
39.fimh多肽在大肠杆菌的各种菌株之间高度保守，并且它们在广泛的革兰氏阴性细菌中也高度保守。而且，菌株之间发生的氨基酸变化通常发生在相似的氨基酸位置。由于大肠杆菌菌株之间fimh的高度保守，来自一种菌株的fimh多肽能够诱导抑制或预防其他大肠
杆菌菌株通过fimh凝集素与细胞结合的抗体应答和/或提供针对由其他大肠杆菌菌株引起的感染的保护和/或治疗。因此，在一个实施方案中，fimh
fl
多肽包含与seq id no:5具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性或优选地至少具有其氨基酸22-300的氨基酸序列，由此，位置71或71和144包含如上文分别针对fimh(f71mut)和fimh(f71mut/f144mut)定义的氨基酸残基。在某些实施方案中，fimh
fl
多肽可以包含具有seq id no:5或至少其氨基酸22-300的序列，除了如本文所述的f71y取代和任选的f144v取代。在另一个实施方案中，fimh
fl
多肽包含与seq id no:6具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，由此，位置71或71和144包含如上文分别针对fimh(f71mut)和fimh(f71mut/f144mut)定义的氨基酸残基。在某些实施方案中，fimh
fl
多肽可以包含具有seq id no:6的序列，除了如本文所述的f71y取代和任选的f144v取代。
40.在某些实施方案中，fimh优选地是大肠杆菌fimh。
41.如本文所用，术语“周质伴侣”定义为位于细菌周质中的，能够通过识别一个共同的结合表位(或多个表位)而与多种伴侣结合蛋白形成复合物的蛋白质。伴侣充当模板，从细菌细胞输出到周质的蛋白质依靠这些模板折叠成它们的天然构象。伴侣结合蛋白与伴侣的缔合还用以保护结合蛋白免受定位于周质内的蛋白酶的降解，增加其在水溶液中的溶解度，并导致其依次正确地并入组装菌毛中。伴侣蛋白是革兰氏阴性细菌中的一类蛋白，它们通过介导菌毛的组装而参与此类组装，但并未并入该入结构中。fimc是fimh的周质伴侣蛋白。用于在本发明中使用的fimc多肽具有与seq id no:3具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，fimc多肽具有与如us6,737,063(以其全文并入本文)中所述的seq id no:29具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。fimc和fimh的非共价复合物被称为fimch。
42.因此，在另一方面，本发明提供了一种复合物，该复合物包含：多肽，该多肽包含如本文所定义的fimh(f71mut)或fimh(f71mut/f144mut)并且还包含fimh菌毛蛋白结构域或如本文所定义的全长fimh；以及如本文所定义的fimc多肽。
43.在本发明的一个实施方案中，fimh(f71mut)或fimh(f71mut/f144mut)凝集素结构域是还包含fimh菌毛蛋白结构域的多肽的一部分，该多肽与fimc复合形成fimch复合物。
44.本技术的发明人已经创建了具有不同氨基酸变化的几种fimh凝集素结构域变体，并且在各种测定中测试了它们的效率(参见实施例)。
45.本文所述的fimh(f71mut)和fimh(f71mut/f144mut)两者都能够形成fimch复合物。
46.在一个实施方案中，fimh(f71mut)或fimh(f71mut/f144mut)凝集素结构域是与seq id no:2具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的fimh
fl
多肽的一部分，该fimhfl多肽任选地与fimc多肽复合形成fimch复合物。最终形式的fimh
fl
多肽(即成熟fimh
fl
多肽)通常不包括信号肽，例如显示为seq id no:4和5的氨基酸1-21，即seq id no:4或seq id no:5的成熟fimh
fl
多肽应理解为包括这些序列的氨基酸22-300，而通常缺少其氨基酸1-21。为了重组产生fimh
fl
多肽，有用的是在重组宿主细胞中编码包括信号肽的成熟fimh
fl
多肽，以经由导致多肽周质定位(有时称为“周质表达”)的通用分泌途径跨内(细胞质)膜运输，但在作为分离形式并且例如用于药物组合物中的最终的成熟
fimh
fl
多肽中，由于表达该多肽的重组细胞进行加工，信号肽通常不再存在。
47.在一个实施方案中，fimch复合物包含fimc蛋白和fimh蛋白，或由fimc蛋白和fimh蛋白组成，该fimc蛋白与seq id no:3具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少约99％或100％序列同一性，该fimh蛋白包含如上文所定义的fimh(f71mut)或fimh(f71mut/f144mut)凝集素结构域。在某些实施方案中，fimch复合物包含fimc蛋白和fimh蛋白或fimh
fl
蛋白，或由fimc蛋白和fimh蛋白或fimhfl蛋白组成，该fimc蛋白与seq id no:3具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少约99％或100％序列同一性，该fimh蛋白或fimhfl蛋白包含如上文所定义的fimh(f71mut)或fimh(f71mut/f144mut)凝集素结构域，由此该fimh
fl
蛋白优选地包含f92取代(例如，在仍然包括信号肽的seq id no:4或5中)。任选地，fimch复合物包含fimc蛋白和fimh蛋白或全长fimh蛋白，或由fimc蛋白和fimh蛋白或全长fimh蛋白组成，该fimc蛋白与seq id no:3具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少约99％或100％序列，该fimh蛋白在凝集素结构域中包含f71(y)和f144(v)取代，该全长fimh蛋白包含f92(y)和f165(v)取代(例如，在仍然括信号肽的seq id no:4或5中)。
48.在仍将包括信号肽的全长fimh中，氨基酸位置92与fimh凝集素结构域中的氨基酸位置71相对应，氨基酸位置165与fimh凝集素结构域中的氨基酸位置144相对应。技术人员将知道如何使用如上文所定义的氨基酸序列比对算法来鉴定全长fimh氨基酸序列中以及fimh凝集素结构域氨基酸序列中的相应氨基酸位置。
49.在一个实施方案中，包含大肠杆菌伴侣fimc的复合物和包含fimh(f71mut)或fimh(f71mut/f144mut)的多肽可以通过从重组细胞中一起共表达包含fimh(f71mut)或包含fimh(f71mut/f144mut)的多肽与fimc来形成。
50.在一个实施方案中，fimch复合物包含源于一种细菌菌株的fimc，而fimh源于不同的细菌菌株。在另一个实施方案中，fimch复合物包含均源于相同细菌菌株的fimc和fimh。在某些实施方案中，fimh或fimc或fimh和fimc两者可以是并非来自于自然界中存在的实际细菌分离株的人工序列，例如它们也可以基于共有序列或天然分离株的组合。
51.在一个实施方案中，fimch复合物包含至少一种包含his标签的多肽。在一个实施方案中，如本文所述的全长fimh包含his标签，或者如本文所述的fimc包含his标签。优选地，在fimch复合物中，fimc包含his标签。如本文所用的his标签是一段组氨酸(his)残基，例如六个his残基，其可以添加在内部或优选地添加在蛋白质的n端或c端。此类标签具有易于纯化的熟知用途。
52.在另一方面，本发明涉及编码如上文所定义的包含fimh(f71mut)或fimh(f71mut/f144mut)凝集素结构域的多肽的多核苷酸。该多核苷酸的前面可以是与其可操作地连接的启动子。在某些实施方案中，启动子对于fimh编码序列是内源的。在某些实施方案中，启动子是驱动肠杆菌科细菌中的fimh表达的内源启动子。在其他实施方案中，启动子与fimh编码序列是异源的，例如使用技术人员已知的用于重组表达系统的强启动子。例如，包含诱导型lac启动子的pet-duet载体可以用于本发明的fimh(f71mut)或fimh(f71mut/f144mut)多肽的表达，和/或用于fimc多肽的表达。在诱导型启动子(诸如lac启动子或tac启动子)的情况下，iptg可用于诱导表达。优选地，多核苷酸从其天然环境中分离。在某些实施方案中，本发明提供了根据本发明的分离的多核苷酸。多肽可以是重组的、合成的或人工多核苷酸。多
核苷酸可以是任何形式的核酸，例如dna或rna，优选是dna。多核苷酸可以包含在天然存在的编码fimh的多核苷酸中不存在的一个或多个核苷酸。优选地，该多核苷酸在其5'末端和/或3'末端具有天然存在的编码fimh的多核苷酸中不存在的一个或多个核苷酸。所编码的成熟fimc和/或fimh的序列前面可以优选地是在相应多核苷酸所编码的多肽中的信号肽，并且信号肽可以分别是fimc和/或fimh多肽的内源信号肽(即对于这些蛋白而言如同在自然界中存在的信号肽)，或者它们可以是异源信号肽，即来自其他蛋白的信号肽或合成信号肽。信号肽可用于周质表达，但通常被切除并且分别不存在于最终产生和纯化的fimc和/或fimh中。
53.在另一方面，本发明涉及包含编码本发明的fimh(f71mut)或fimh(f71mut/f144mut)多肽的多核苷酸的载体。在某些实施方案中，载体是质粒或病毒载体，优选是质粒。载体优选地呈dna的形式，例如dna质粒。在某些实施方案中，载体包含与启动子可操作地连接的本发明的多核苷酸，这意味着多核苷酸受启动子的控制。启动子可以位于编码本发明的多肽的多核苷酸的上游，例如在质粒中的表达盒中。
54.在又一方面，本发明涉及包含编码本发明的fimh(f71mut)或fimh(f71mut/f144mut)多肽的多核苷酸的宿主细胞或如本文所述的载体。编码本发明的fimh(f71mut)或fimh(f71mut/f144mut)多肽的多核苷酸可以通过常见的分子生物学方法引入细胞。此类核酸可以是染色体外的，例如在质粒或其他载体上，或者此类核酸可以被整合到宿主细胞的基因组中。优选地，编码蛋白质的核酸可操作地偶合到驱动核酸在宿主细胞中表达的序列上，诸如偶合到启动子。启动子可以是组成型启动子，或者它可以是活性可以被调节的启动子，例如在某些条件(例如温度变化或细胞中某些化学物质或蛋白质的存在)下被遏制或诱导，所有这些同样都是本领域众所周知的。
55.宿主细胞可以是分离的细胞。宿主细胞可以在培养基中(例如在培养容器诸如生物反应器中)培养。细胞可以是任何微生物的、原核或真核细胞，这些细胞适合用于编码本发明的fimh(f71mut)或fimh(f71mut/f144mut)多肽的多核苷酸的表达。优选地，宿主细胞是细菌宿主细胞。优选地，细菌宿主细胞是革兰氏阴性细菌细胞。优选地，宿主细胞选自大肠杆菌和克雷伯氏菌(klebsiella)。优选地，宿主细胞是大肠杆菌。
56.如果要求和/或如果需要，可以通过添加药学上可接受的载剂将本发明的fimh(f71mut)或fimh(f71mut/f144mut)多肽或编码本发明的fimh(f71mut)或fimh(f71mut/f144mut)多肽的多核苷酸并入药学上活性混合物中。
57.因此，在另一方面，本发明还提供了一种组合物，优选药物组合物，该组合物包含本发明的fimh(f71mut)或fimh(f71mut/f144mut)多肽或编码本发明的fimh(f71mut)或fimh(f71mut/f144mut)多肽的多核苷酸。
58.本发明的(药物)组合物可以包含任何药学上可接受的赋形剂，包括载剂、填充剂、防腐剂、增溶剂和/或稀释剂。盐水溶液和右旋糖水溶液以及甘油溶液也可以用作液体载剂，特别是对于可注射溶液而言。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。合适的药物载剂的示例是已知的并且例如在教科书和手册中描述。
59.在某些实施方案中，本发明的组合物另外包含一种或多种缓冲液，例如tris缓冲盐水、磷酸盐缓冲液、hepes或蔗糖磷酸盐谷氨酸盐缓冲液。
6836.1000e113)，任选地与qs7组合(参见kensil等人，于vaccine design:the subunit and adjuvant approach中(powell和newman编辑，plenum press,ny,1995)；us 5,057,540)。在一些实施方案中，佐剂是弗氏佐剂(完全或不完全)。在某些实施方案中，佐剂包含quil-a，诸如例如可从brenntag(现croda)或invivogen商购获得。quila含有来自皂树molina树的皂苷的水可提取部分。这些皂苷属于三萜皂苷的组，这些三萜皂苷具有共同的三萜主链结构。已知皂苷诱导对t依赖性抗原以及t非依赖性抗原的强佐剂应答，以及强细胞毒性cd8+淋巴细胞应答，并且增强对粘膜抗原的应答。它们还可以与胆固醇和磷脂组合，以形成免疫刺激复合物(iscom)，其中quila佐剂可以活化对来自不同起源的广泛抗原的抗体介导的免疫应答和细胞介导的免疫应答两者。在某些实施方案中，佐剂是as01，优选是as01b。s01是含有mpl(3-o-去酰基-4'-单磷酰基脂质a)、qs21(皂树molina，级分21)和脂质体的佐剂系统。在某些实施方案中，as01是可商购获得的(gsk)或者可以如以引用方式并入本文的wo 96/33739中所述进行制备。某些佐剂包含乳剂，这些乳液是两种不混溶流体(例如油和水)的混合物，其中一种作为小液滴悬浮在另一种内部，并且通过表面活性剂稳定。水包油乳液具有形成连续相、围绕小油滴的水，而油包水乳液具有形成连续相的油。某些乳液包含角鲨烯(一种可代谢的油)。某些佐剂包含嵌段共聚物，这些嵌段共聚物是当两种单体聚集在一起并形成重复单元的嵌段时形成的共聚物。包含嵌段共聚物、角鲨烯和微粒稳定剂的油包水乳液的示例是其可以从sigma-aldrich商购获得。任选地，乳剂可以与另外的免疫刺激组分(诸如tlr4激动剂)组合或包含另外的免疫刺激组分。某些佐剂是也用于mf59(参见例如ep0399843、us 6299884、us6451325)和as03中的水包油乳剂(诸如角鲨烯或花生油)，任选地与免疫刺激剂(诸如单磷酰基脂质a和/或qs21组合(诸如在as02中)(参见stoute等人，1997,n.engl.j.med.336,86-91)。佐剂的其他示例是含有免疫刺激剂(诸如mpl和qs21)的脂质体，诸如在as01e和as01b中(例如us 2011/0206758)。佐剂的其他示例是cpg和咪唑并喹啉(诸如咪喹莫特和r848)。参见例如，reed g等人，2013,nature med,19:1597-1608。
70.在某些实施方案中，佐剂包含皂苷，优选地从皂树获得的皂苷的水可提取部分。在某些实施方案中，佐剂包含qs-21。
71.在某些实施方案中，佐剂含有toll样受体4(tlr4)激动剂。tlr4激动剂是本领域中熟知的，参见例如ireton gc和sg reed,2013,expert rev vaccines 12:793-807。在某些实施方案中，佐剂是包含脂质a或其类似物或衍生物的tlr4激动剂。
72.佐剂(例如包括tlr4激动剂)可以按各种方式配制在例如乳剂诸如油包水(w/o)乳剂或水包油(o/w)乳剂(示例是mf59、as03)、稳定(纳米)乳剂(se)、脂质悬浮液、脂质体、(聚合物)纳米颗粒、病毒颗粒、明矾吸附的水性配制品(af)等中，代表用于佐剂中的免疫调节分子和/或用于免疫原的各种递送系统(参见例如reed等人，2013，同上；alving cr等人，2012,curr opin immunol 24:310-315)。
73.免疫刺激性tlr4激动剂可以任选地与其他免疫调节组分组合，这些免疫调节组分诸如皂苷(例如quila、qs7、qs21、基质m、iscoms、iscomatrix等)、铝盐、其他tlr的活化剂(例如咪唑并喹啉、鞭毛蛋白、cpg、dsrna类似物等)以及类似物质(参见例如reed等人，2013，同上)。
74.如本文所用，术语“脂质a”是指lps分子的疏水性脂质部分，该疏水性脂质部分包
含葡萄糖胺并且通过酮苷键连接至lps分子的内核中的酮基-去氧辛酮糖酸，该酮苷键将lps分子锚定在革兰氏阴性细菌的外膜的外小叶中。关于lps和脂质a结构的合成的概述，参见例如，raetz,1993,j.bacteriology 175:5745-5753；raetz cr和c whitfield,2002,annu rev biochem 71:635-700；us 5,593,969和us 5,191,072。如本文所用的脂质a包括天然存在的脂质a、其混合物、类似物、衍生物和前体。该术语包括单糖，例如被称为脂质x的脂质a的前体；二糖脂质a；七酰基脂质a；六酰基脂质a；五酰基脂质a；四酰基脂质a，例如脂质a的四酰基前体，称为脂质iva；去磷酸化脂质a；单磷酰基脂质a；二磷酰基脂质a，例如来自大肠杆菌和类球红细菌(rhodobacter sphaeroides)的脂质a。若干免疫活化脂质a结构含有6个酰基链。直接附接至葡萄糖胺糖上的四个一级酰基链是通常长度在10-16个碳之间的3-羟基酰基链。两个另外的酰基链通常附接至一级酰基链的3-羟基基团。例如，大肠杆菌脂质a通常具有四个附接至糖的c14 3-羟基酰基链，以及分别在2'和3'位置附接至一级酰基链的3-羟基基团的一个c12和一个c14。
75.如本文所用，术语“脂质a类似物或衍生物”是指类似于脂质a的结构和免疫活性、但不一定天然存在于自然界中的分子。类脂a类似物或衍生物可以被修饰成例如缩短或缩合，和/或使其葡萄糖胺残基被另一个胺糖残基(例如半乳糖胺残基)取代，以在还原端含有2-去氧-2-胺基葡糖酸代替葡萄糖胺-1-磷酸，在位置4’带有半乳糖醛酸部分而不是磷酸。脂质a类似物或衍生物可以从分离自细菌的脂质a制备，例如通过化学衍生；或化学合成，例如通过首先确定优选的脂质a的结构并合成其类似物或衍生物。脂质a类似物或衍生物还可以用作tlr4激动剂佐剂(参见，例如gregg ka等人，2017,mbio 8,edd492-17,doi:10.1128/mbio.00492-17)。例如，脂质a类似物或衍生物可以通过野生型脂质a分子的去酰化，例如通过碱处理而获得。脂质a类似物或衍生物可以例如由分离自细菌的脂质a制备。此类分子也可以化学合成。脂质a类似物或衍生物的另一个示例是从细菌细胞分离的脂质a分子，这些细菌细胞含有参与脂质a生物合成和/或脂质a修饰的酶中的突变或缺失或插入。mpl和3d-mpl是经修饰以减弱脂质a毒性的脂质a类似物或衍生物。脂质a、mpl和3d-mpl具有糖主链，长脂肪酸链附接到该糖主链上，其中该主链含有糖苷键连中的两个6-碳糖以及4位置处的磷酰基部分。通常，五至八个长链脂肪酸(通常12-14个碳原子)附接至糖主链。由于天然来源的衍生，mpl或3d-mpl可以作为多种脂肪酸取代模式(例如七酰基、六酰基、五酰基等)的复合物或混合物存在，具有不同的脂肪酸长度。对于本文所述的一些其他脂质a类似物或衍生物也是如此，然而合成脂质a变体还可以是限定的和均匀的。mpl及其制造例如在us 4,436,727中进行了描述。3d-mpl例如在us 4,912,094b1中进行了描述，并且与mpl的不同之处在于选择性去除与位置3处的还原端葡萄糖胺酯连接的3-羟基肉豆蔻酰基残基，(比较例如us 4,912,094b1的第1列中的mpl对比第6列中的3d-mpl的结构)。在本领域中，通常使用3d-mpl，但是有时称为mpl(例如，ireton gc和sg reed,2013，同上的表1中的第一结构，这种结构被称为但实际上描绘了3d-mpl的结构)。根据本发明的脂质a(类似物、衍生物)的示例包括mpl、3d-mpl、rc529(例如ep1385541)、pet-脂质a、gla(吡喃糖基脂质佐剂，一种合成的二糖糖脂；例如us20100310602、us8722064)、sla(例如carter d等人，2016,clin transl immunology5:e108(doi:10.1038/cti.2016.63))、phad(磷酸化的六酰基二糖；其结构与gla的结构相同)、3d-phad、3d-(6-酰基)-phad(3d(6a)-phad)(phad、3d-phad和3d(6a)phad是合成的脂质a变体，参见例如avantilipids.com/divisions/adjuvants，其
还提供这些分子的结构)、e6020(cas编号287180-63-6)、ono4007、om-174等。关于3d-mpl、rc529、pet-脂质a、gla/phad、e6020、ono4007和om-174的示例性化学结构，参见例如ireton gc和sg reed,2013，同上的表1。关于sla的结构，参见例如reed sg等人，2016,curr opin immunol 41:85-90中的图1。在某些优选的实施方案中，tlr4激动剂佐剂包含选自3d-mpl、gla或sla的脂质a类似物或衍生物。
76.包含类脂a类似物或衍生物的示例性佐剂包括gla-lsq(合成mpl[gla]、qs21、脂质，配制为脂质体)、sla-lsq(合成mpl[sla]、qs21，脂质，配制为脂质体)、gla-se(合成mpl[sla]，角鲨烯油/水乳液)、sla-se(合成mpl[sla]，角鲨烯油/水乳液)、sla-纳米明矾(合成mpl[sla]，铝盐)、gla-纳米明矾(合成mpl[gla]，铝盐)、sla-af(合成mpl[sla]，水性悬浮液)、gla-af(合成mpl[gla]，水性悬浮液)、sla-明矾(合成mpl[sla]，铝盐)、gla-明矾(合成mpl[gla]，铝盐)以及gsk asxx系列佐剂中的几种，包括as01(mpl、qs21，脂质体)、as02(mpl、qs21，油/水乳液)、as25(mpl，油/水乳液)、as04(mpl，铝盐)和as15(mpl、qs21、cpg，脂质体)。参见例如，wo 2013/119856、wo 2006/116423、us 4,987,237、u.s.4,436,727、us 4,877,611、us 4,866,034、us 4,912,094、us 4,987,237、us5191072、us5593969、us 6,759,241、us 9,017,698、us 9,149,521、us 9,149,522、us 9,415,097、us 9,415,101、us 9,504,743；reed g，等人，2013，同上；johnson等人，1999,j med chem,42:4640-4649；以及ulrich和myers,1995,vaccine design:the subunit and adjuvant approach；powell和newman编辑；plenum:new york,495-524。
[0077]
非糖脂分子也可以用作tlr4激动剂佐剂，例如合成分子诸如neoseptin-3或天然分子诸如leif，参见例如reed sg等人，2016，同上。
[0078]
在另一方面，本发明涉及用作药物的本发明的fimh(f71mut)或fimh(f71mut/f144mut)多肽、编码本发明的fimh(f71mut)或fimh(f71mut/f144mut)多肽的多核苷酸或本发明的药物组合物。
[0079]
在另一方面，本发明涉及本发明的fimh(f71mut)或fimh(f71mut/f144mut)多肽、编码本发明的fimh(f71mut)或fimh(f71mut/f144mut)多肽的多核苷酸或本文所述的药物组合物作为用于诱导针对肠杆菌科的革兰氏阴性细菌的免疫应答的药物的用途。
[0080]
如本文所用，术语“免疫原”或“免疫原性”或“抗原”可互换使用以描述单独或连同佐剂一起施用于受试者，或在展示媒介物上呈现时能够诱导针对自身的免疫学应答的分子。
[0081]
如本文所用，对抗原或组合物的“免疫学应答”或“免疫应答”是指在受试者中发展对该抗原或该组合物中存在的抗原的体液和/或细胞免疫应答。
[0082]
在另一方面，本发明涉及本发明的fimh(f71mut)或fimh(f71mut/f144mut)多肽、编码本发明的fimh(f71mut)或fimh(f71mut/f144mut)多肽的多核苷酸或本文所述的药物组合物，用于在诱导针对由肠杆菌科的革兰氏阴性细菌引起的细菌感染的免疫应答中使用。在某些实施方案中，细菌感染由克雷伯氏菌属或大肠杆菌引起。在一个优选的实施方案中，细菌感染由大肠杆菌引起。因此，在一个实施方案中，本发明涉及本发明的fimh(f71mut)或fimh(f71mut/f144mut)多肽、本发明的fimh(f71mut)或fimh(f71mut/f144mut)多肽或本文所述的药物组合物作为用于诱导针对大肠杆菌或克雷伯氏菌，优选地大肠杆菌免疫应答的药物的用途。
[0083]
在优选的实施方案中，由肠杆菌科的革兰氏阴性细菌引起的细菌感染是大肠杆菌，例如expec的感染，例如该感染可以是尿路感染(uti)。在一个实施方案中，本发明涉及如本文所述的包含fimh凝集素结构域的多肽、如本文所述的多核苷酸或本文所述的药物组合物，用于治疗、预防或抑制受试者中与uti相关的症状和/或后遗症。在某些实施方案中，所述uti是ruti。大肠杆菌是uti和ruti的主要病原体之一，是年轻女性和老年人中的重要医疗保健问题。因此，在优选的实施方案中，细菌感染是由大肠杆菌引起的uti或ruti。
[0084]
在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗、预防或抑制有需要的受试者中与肠杆菌相关病症有关的症状和/或后遗症的方法。该方法包括向受试者施用有效量的本发明的fimh(f71mut)或fimh(f71mut/f144mut)多肽、编码本发明的fimh(f71mut)或fimh(f71mut/f144mut)多肽的多核苷酸或本文所述的药物组合物。优选地，施用诱导在治疗或预防肠杆菌相关病症方面有效的免疫应答。优选地，肠杆菌相关病症是泌尿生殖道感染，更特别地是uti或ruti。
[0085]
本发明还涉及本发明的fimh(f71mut)或fimh(f71mut/f144mut)多肽、编码本发明的fimh(f71mut)或fimh(f71mut/f144mut)多肽的多核苷酸或本文所述的药物组合物用于制造用于治疗、预防或抑制由肠杆菌科的革兰氏阴性细菌引起的细菌感染，优选地由大肠杆菌引起的细菌感染的药物的用途。更优选地，细菌感染是由大肠杆菌引起的uti或复发性uti(ruti)。
[0086]
本发明还涉及一种用于产生本发明的多肽的方法，该方法包括培养重组细胞，该重组细胞含有编码本发明的fimh(f71mut)或fimh(f71mut/f144mut)多肽的多核苷酸和/或如本文所述的载体，其中培养在有利于多肽产生的条件下发生。
[0087]
在某些实施方案中，该方法还包括回收多肽，然后任选地配制成药物组合物。
[0088]
优选地，在用于产生本发明的fimh(f71mut)或fimh(f71mut/f144mut)多肽的方法中使用大肠杆菌细胞，例如大肠杆菌bl21衍生细胞。
[0089]
多肽的回收优选地包括纯化和/或分离步骤，该步骤可以使用本领域公知的常规蛋白质纯化方法进行。此类方法可以例如包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子和/或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法、羟基磷灰石色谱法和/或凝集素色谱法。
[0090]
用于此类纯化和/或分离的典型示例可以利用针对蛋白质或针对作为蛋白质结构的一部分表达的his标签或可切割前导序列或尾的抗体。在某些实施方案中，本文所述的多肽包含有his标签，并通过诸如imac亲和纯化等方法纯化。在某些实施方案中，本文所述的多肽不包含his标签，在此类情况下，可通过色谱法，例如离子交换色谱法(iex)、疏水相互作用色谱法(hic)和/或尺寸排阻色谱法进行纯化。
[0091]
定义
[0092]
背景以及说明书全篇中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一者全文均以引用方式并入本文。本说明书中包括的对文件、行为、材料、装置、文章等的讨论旨在为本发明提供上下文。此类讨论并不是承认这些事项中的任一事项或全部事项均相对于所公开或受权利要求书保护的任何发明形成现有技术的一部分。
[0093]
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。否则，本文引用的某些术语具有本说明书中所述
的含义。本文引用的所有专利、公布的专利申请和出版物均以引用方式并入本文，如同在本文中进行了充分阐述。应该注意的是，除非上下文清楚地指明，否则如本文和所附权利要求中所用的单数形式“一个/一种”和“所述/该”包括复数引用物。
[0094]
贯穿本具体实施方式和随后的权利要求书，除非上下文另有要求，否则词语“包括”以及诸如“包含”和“含有”等变型形式将被理解为暗示包括所陈述的整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。当在本文使用时，术语“包含”可用术语“含有”或“包括”替代，或者有时在本文使用时用术语“具有”替代。
[0095]
当在本文使用时，“由
……
组成”排除权利要求要素中未指定的任何要素、步骤或成分。当在本文使用时，“基本上由
……
组成”不排除没有实质上影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。每当在本文中用于本发明的一个方面或实施方案的情境时，任何前述术语“包含”、“含有”、“包括”和“具有”均可用术语“由
……
组成”或“基本上由
……
组成”替代以改变本公开的范围。
[0096]
如本文所用，多个列举的要素之间的连接术语“和/或”被理解为包含单个选项和组合选项两者。例如，在两个要素由“和/或”连接的情况下，第一种选项是指在没有第二个要素的情况下适用第一个要素。第二种选项是指在没有第一个要素的情况下适用第二个要素。第三种选项是指适合一起使用第一要素和第二要素。这些选项中的任一种均被理解为落在含义内，并且因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。多于一种选项的并行适用性也被理解为落在含义内，并且因此满足术语“和/或”的要求。
[0097]
如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指不干扰根据本发明的组合物的效果或根据本发明的组合物的生物活性的非毒性材料。“药学上可接受的载剂”可以包括任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、类脂、含脂质囊泡、微球体、脂质体包囊或本领域熟知的用于在药物配制品中使用的其他材料。应当理解，药学上可接受的载剂的特性将取决于具体应用的施用途径。根据本公开，根据具体实施方案，适合用于疫苗的任何药学上可接受的载剂均可用于本发明。合适的赋形剂包括但不限于无菌水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等以及它们的组合，以及稳定剂，例如人血清白蛋白(hsa)或其他合适的蛋白质和还原糖。
[0098]
如本文所用，术语“有效量”是指在受试者中引起期望的生物学或药物学应答的活性成分或组分的量。关于所阐述的目的，有效量可以根据经验并且以常规方式来确定。例如，可任选地采用体外测定来帮助确定最佳剂量范围。
[0099]
如本文所用，“受试者”或“患者”意指将或已经通过根据本发明的实施方案的方法或组合物疫苗接种的任何动物，优选地哺乳动物，最优选地人。如本文所用，术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的示例包括但不限于牛、马、绵羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、天竺鼠、猴、人等，最优选地人。在某些实施方案中，受试者是成人。如本文所用，术语“成人”是指18岁或以上的人。在某些实施方案中，受试者小于18岁，例如0-18岁，例如9-18岁，或12-18岁。在某些实施方案中，受试者是约18岁至约50岁的人类受试者。在某些实施方案中，受试者是约50岁至约100岁的人，例如50-85岁、60-80岁、50岁或以上、55岁或以上、60岁或以上、65岁或以上、70岁或以上、75岁或以上、80岁或以上、85岁或以上的人。在其一些实施方案中，受试者不大于85岁、不大于80岁、不大于75岁。在某些实施方案中，人类受试者是男性。在某些实施方案中，人类受试者是女性。
[0100]
如本文所用，“uti”意指肾脏、膀胱、输尿管或尿道的感染。uti的症状可以包括以下中的一者或多者：排尿时的灼热感，频繁或强烈的排尿冲动，膀胱排空不完全，尿液外观和/或气味异常，尿液中白细胞升高，感到疲倦或发抖，感觉迷失，发烧或发冷，背部、小腹、骨盆或膀胱不适、疼痛或压迫。然而，在一些患者中，症状可能不存在或没有特异性。uti的后遗症可包括系统性并发症，诸如侵袭性疾病和败血症。在某些实施方案中，uti在临床和/或微生物学上记录，例如用尿细菌培养和/或用分子或其他方法证实。在某些实施方案中，受试者是先前已经患有或目前患有uti的人类受试者。在某些实施方案中，受试者在过去两年、过去一年或过去6个月内患有uti。在某些实施方案中，受试者已经患有或目前患有复发性uti(ruti)。如本文所用的“ruti”意指六个月内至少两次感染或一年内至少三次uti。在某些实施方案中，施用了本发明的fimh(f71mut)或fimh(f71mut/f144mut)、本发明的fimch复合物、本发明的融合多肽或本发明的组合物的受试者在过去两年、过去一年或过去六个月内已经遭受了至少两次uti。在某些实施方案中，受试者已经遭受了复杂的uti。如本文所用，“复杂的uti”意指与如泌尿生殖道的结构或功能异常或潜在疾病的存在等状况相关的uti。在某些实施方案中，uti导致尿中白细胞数量升高或其他尿液异常。在某些实施方案中，患有uti的受试者尿液中具有许多细菌，即，尿液不是无菌的，例如细菌细胞计数为至少约10个细胞/ml、至少约100个细胞/ml、至少约103个细胞/ml，例如至少约104个细胞/ml，例如至少约105个细胞/ml。
[0101]
如本文所用，对抗原或组合物的“免疫学应答”或“免疫应答”是指在受试者中发展对该抗原或该组合物中存在的抗原的体液和/或细胞免疫应答。
[0102]
除非另有说明，否则在一系列元素之前的术语“至少”应理解为指代系列中的每个元素。
[0103]
词语“约”或“大约”在与数值结合使用时(例如约10)，优选地意指该值可为给定值(为10)，该给定值为该值的10％以上或以下，优选地为该值的5％以上或以下。
[0104]
术语“同源性”、“序列同一性”等在本文中可互换使用。序列同一性在本文中定义为通过序列比较所确定的两个或更多个氨基酸(多肽或蛋白质)序列或者两个或更多个核酸(多核苷酸)序列之间的关系。在本领域中，“同一性”还意指视情况而定，通过氨基酸或核酸序列串之间的匹配而确定的此类序列之间的序列相关性程度。两个氨基酸序列之间的“相似性”是通过将一个多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代物与第二个多肽的序列进行比较来确定的。可以通过已知方法容易地计算“同一性”和“相似性”。
[0105]
可以根据两个序列的长度，使用全局或局部比对算法通过比对两个肽或两个核苷酸序列来确定“序列同一性”和“序列相似性”。优选地使用全局比对算法(例如needleman wunsch)对相似长度的序列进行比对，该全局比对算法优选地在整个长度上比对序列，而优选地使用局部比对算法(例如smith waterman)对长度大不相同的序列进行比对。当序列(例如，通过程序gap或bestfit使用预设参数进行最佳比对时)至少共有某一最小百分比的序列同一性(如下文所定义)时，则可以将序列称为“基本上相同”或“基本上相似”。gap使用needleman和wunsch全局比对算法来在两个序列的整个长度(全长)上比对两个序列，从而将匹配数最大化并且将空位数最小化。全局比对适合在两个序列具有相似长度时，用于确定序列同一性。通常，使用gap默认参数，空位产生罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白质)，空位延伸罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。对于核苷酸，使用的默认得分矩阵是nwsgapdna，而对于蛋白
质，默认得分矩阵是blosum62(henikoff和henikoff,1992,pnas 89,915-919)。序列比对和百分比序列同一性的得分可以如下确定：使用计算机程序，诸如gcg wisconsin套装软件，10.3版，可从accelrys inc.,9685scranton road,san diego,ca 92121-3752usa获得，或使用开源软件，诸如embosswin 2.10.0版中的程序“needle”(使用全局needleman wunsch算法)或“water”(使用局部smith waterman算法)，使用与上述gap相同的参数，或使用默认设置(两者对于“needle”和“water”而言并且两者对于蛋白质和dna比对而言，默认空位开放罚分为10.0且默认空位延伸罚分为0.5；默认得分矩阵对于蛋白质而言是blosum62，而对于dna而言是dnafull)。当序列的总体长度大不相同时，优选的是局部比对，诸如使用smith waterman算法的那些。
[0106]
另选地，可以使用如fasta、blast等算法，通过针对公共数据库进行搜索来确定相似性或同一性百分比。因此，本发明的核酸和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”以针对公共数据库进行搜索，以例如鉴定其他家族成员或相关序列。可以使用altschul等人(1990)j.mol.biol.215:403—10的blastn和blastx程序(2.0版)进行此类搜索。blast核苷酸检索可以用nblast程序、得分＝100、字长＝12进行以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。blast蛋白质检索可以用blastx程序、得分＝50、字长＝3进行，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以如altschul等人，(1997)nucleic acids res.25(17):3389-3402中所述，利用空位blast。当利用blast和空位blast程序时，可以使用相应程序(例如，blastx和blastn)的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov/上国家生物技术信息中心的主页。
[0107]
序列描述
[0108]
表1：序列
[0109]
[0110][0111]
fimh多肽的序列的其他示例在us6,737,063中有描述，例如其中的seq id no:23-45或55中的任何一个，并且这些都以引用方式并入本文。
[0112]
实施例
[0113]
本发明的以下实施例旨在进一步说明本发明的性质。应当理解，以下实施例不限制本发明，并且本发明的范围由所附权利要求书确定。
[0114]
为了理解fimh构象变化对疫苗功效的影响，设计了几种含有可能将蛋白质锁定在低亲和力状态的不同突变的fimh变体，目的在于鉴定诱导能够减少细菌向膀胱的粘附和定殖的功能性抗体的改善的fimh变体。为了优化找到合适的fimh凝集素结构域变体的机会，选择具有不同预测作用模式的变体。将先前描述的突变体fimh_q133k和fimh_r60p以及野生型(wt)fimh作为对照。
[0115]
实施例1：诱导抑制性抗体的能力
[0116]
已经证实针对呈低亲和力构象的fimh产生的抗体能够阻断细菌细胞并减少膀胱中的菌落形成。因此，作为第一步，通过使用粘附抑制测定(aia)，我们评价了由锁定于低亲和力构象的fimh的不同变体诱导的抗体的功能性。
[0117]
材料和方法
[0118]
fimh设计和表达
[0119]
使用用于在周质中表达的异源信号序列和用于使用固定化金属亲和色谱法(imac)进行亲和纯化的fimc上的c端his标签，使fimc和fimh在pet-duet或pet-22b载体中
表达。使用iptg诱导表达，提取蛋白质并使用imac纯化法(塔隆(talon))纯化。
[0120]
免疫
[0121]
wistar大鼠在第0天、第7天、第10天和18天接受了4次肌内(i.m.)免疫接种与非弗氏佐剂组合的不同的fimh变体(每种变体60μg/剂)(speedy大鼠28天模型，eurogentec)。如下所述，在第0天(免疫接种前)和第28天(免疫接种后)通过粘附抑制测定(aia)研究血清抗体的功能性。
[0122]
粘附抑制测定(aia)
[0123]
用异硫氰酸荧光素(fitc)标记细菌(大肠杆菌菌株j96)。将标记的细菌与膀胱尿道上皮细胞(5637细胞系)一起在37℃下孵育1小时。通过流式细胞术测量粘附细菌的％。为了评价血清抑制，将细菌先与血清样品在37℃下孵育30分钟，并且然后与5637细胞混合。
[0124]
elisa
[0125]
将96孔板用1ug/ml的fimh包被过夜。在洗涤后，将包被的孔与封闭缓冲液[磷酸盐缓冲盐水(pbs)+2％牛血清白蛋白(bsa)]一起在室温下孵育1小时。在用pbs+0.05％吐温20洗涤后，将血清添加至板中，然后将这些板在室温下孵育1小时。在洗涤后，将在含有2％ bsa的pbs中稀释的与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗大鼠抗体添加至各孔中，在室温下保持1小时。在最终洗涤后，用四甲基联苯胺底物使反应物显影。用1m磷酸终止反应，并在450nm处测量吸光度。
[0126]
结果
[0127]
基于四参数逻辑(4pl)回归模型，将血清抗体抑制滴度计算为半最大抑制浓度(ic50)。另外，通过elisa评价由不同的fimh变体诱导的血清抗体水平(总igg)。基于使用4pl非线性回归模型进行分析的6步重复滴定曲线，计算ic50滴度(定义为半最大有效浓度)。
[0128]
在初步实验中，测试了几种不同的fimh变体的诱导抑制性抗体的能力。正如在图1a中可见的，变体fimh(f71y)、fimh(f144v)诱导最高水平的功能性抗体。fimh(f144v)变体先前描述于ep专利申请案号20152217(于2020年1月16日以janssen pharmaceuticals,inc的名义提交)中，其以引用方式并入本文。然而，fimh(f71y)将诱导类似高水平的抑制性抗体，这在本发明之前是令人惊讶且完全不可预测的。
[0129]
为了证实初步结果，用大量动物重复了aia测定，在该实验中，证实了fimh(f71y)和fimh(f144v)均能够可靠地诱导高水平的抑制性抗体(图1b)。
[0130]
fimh(f71y)和fimh(f144v)变体似乎通过不同的诱导结合口袋的构象变化的机制锁定于低亲和力构象。fimh(f71y)变体中的取代防止残基折叠成使张紧状态更有利的疏水口袋(放松状态)，然而在fimh(f144v)变体中，取代的位置相对靠近于使低亲和力构象稳定的甘露糖结合口袋。因为这两种不同的机制导致了低亲和力状态的构象变化，我们猜想包含f71y和f144v取代两者的凝集素结构域能够甚至更加稳定地锁定于低亲和力构象，这将为该类型的fimh变体提供额外的优势。为了检验这个猜想，我们创造了fimh双突变体，该fimh双突变体包含在其凝集素结构域(fimh(f71y/f144v))中的f71y和f144v取代两者。正如在图1b中可见的，fimh(f71y/f144v)同样能够诱导高水平的抑制性抗体。
[0131]
基于这些结果，选择fimh(f71y)和fimh(f71y/f144v)作为首要候选物。如下所述，进一步分析它们的特性。
[0132]
实施例2：设计新型变体-spr数据
[0133]
spr
[0134]
为了深入了解fimh凝集素结构域变体与正庚基-α-d-吡喃甘露糖苷配体的相互作用的结合亲和力和动力学，进行了表面等离子体共振(spr)测量。简言之，将fimh变体滴定到甘露糖苷配体5表面(rabbani s等人，j biol.chem.,2018,293(5):1835-1849)，其在hbs-n(0.01m hepes(ph 7.4)、0.15m nacl、3mm edta、0.05％表面活性剂p20)中的最高浓度为3μm或10μm。使用单循环动力学进样法进样0.12μm至10μm或0.036μm至3.0μm的蛋白质。
[0135]
结果
[0136]
先前描述的突变体fimh_q133k和fimh_r60p在结合口袋中的甘露糖相互作用残基中具有突变。预计这些突变会直接影响与甘露糖的结合相互作用。将这些突变体作为阳性对照。连同双突变体r60p_q133k以检查潜在的增强作用。另外，将野生型(wt)fimh凝集素结构域作为阴性对照。
[0137]
使用spr评估变体与甘露糖结合的亲和力。表2中呈现了结果。正如所期望的，在fimh的甘露糖苷结合口袋中具有突变(q133k和r60p_q133k)的凝集素结构域变体完全不与甘露糖苷结合。正如所期望的，r60p突变体对甘露糖苷显示出低亲和力。
[0138]
尽管能够诱导高水平的抑制性抗体，包含f71y取代的变体仍对甘露糖苷显示出某种亲和力，这表明该突变未完全消除对甘露糖苷的结合。在包含f144v取代的fimh凝集素结构域变体中，完全消除了对甘露糖苷的结合(如先前针对单个f144v突变体在ep专利申请案号20152217(于2020年1月16日以janssen pharmaceuticals,inc的名义提交)中揭露的，其以引用方式并入本文)。在包含f71y和f144v两者的突变体中，也完全消除了对甘露糖苷的结合。
[0139]
表2：fimh
ld
变体与甘露糖苷的亲和力测量
[0140][0141]
*低亲和力kd≥1000nm；中等亲和力kd在100-1000nm之间；高亲和力kd≤100nm
[0142]
实施例3：结合经表征的抑制性mab 475和926的能力
[0143]
fimh的凝集素结构域中的突变可导致在引发强烈的功能性免疫应答方面至关重要的表位，诸如存在于fimh结合口袋中的表位的损失。为了确保通过本文所述的突变不损害结合口袋的完整性，评估了单克隆抗体(mab)mab475和mab926与突变的fimh凝集素结构域的结合。mab475和mab926识别fimh凝集素结构域上fimh的甘露糖结合口袋中重叠但不同的表位(kisiela等人，2013和2015)。
[0144]
结果
[0145]
突变的fimh凝集素结构域先前已在wo02102974中有所描述。wo02102974描述了大
多数未指定突变的广泛的可能突变列表(在长约159个氨基酸的fimh凝集素结构域中提出了65个可能的突变位点)。然而，wo02102974指出在位置54、133或135处具有氨基酸取代的fimh凝集素结构域是最有前景的候选物，明确提到fimh_q133k是高度优选的选项。因此，非常令人惊讶的是，功能性mab475不识别fimh-23-10_q133k，指出了结合口袋的完整性问题(表3)。相比之下，fimh(f71y)和fimh(f144v)两者均被mab475和mab926两者识别，这表明结合口袋仍然非常完好(表3)。fimh(f71y/f144v)双突变体也仍然被两种抗体识别，这表明在该双突变体中结合口袋也仍然完好(表3)。
[0146]
表3：结合经表征的抑制性mab 475和926的能力
[0147][0148]
实施例4：通过nmr对fimh凝集素结构域变体的构象状态分析
[0149]
在不存在和存在正庚基-α-d-哌喃甘露糖苷配体的情况下，测量了均匀地经
15
n标记的fimh
ld
变体(如向生长培养基中添加
15
n的方法部分所述产生)的1h,
15
n异核单量子相干核磁共振(hsqc nmr)谱，以在基于残基水平上评估结构的差异。将蛋白质浓缩至150μm，并在20mm磷酸缓冲液(ph 7.4，含有7％-10％d2o)中测量。将正庚基-α-d-吡喃甘露糖苷配体溶解在d2o中并且逐步添加到蛋白质中，直至10倍的摩尔过量。将每个样品的谱与可公开获得的参考谱进行比较(rabbani s等人，j biol.chem.,2018,293(5):1835-1849)。
[0150]
结果
[0151]
分析了fimh变体fimh(f71y)、fimh(f144v)和fimh(f71y/f144v)在存在甘露糖苷配体的情况下保持低亲和力构象的能力。在不存在配体的情况下，当对已知表示高亲和力状态的残基的化学位移进行比较时，所有三种变体均处于低亲和力构象(rabbani s等人，j biol.chem.,2018,293(5):1835-1849)。相比之下，在不存在甘露糖苷配体的情况下，fimh
ld
23-10野生型锁定于高亲和力构象。然而，在存在配体的情况下，fimh(f71y)和fimh(f144v)切换回高亲和力构象，而fimh(f71y/f144v)保持低亲和力构象，例如，在向fimh(f71y/f144v)中添加配体后未观察到化学位移(图2和表4)。
[0152]
表4：通过nmr测量的选定氨基酸残基的化学位移的表格表示。
[0153][0154]
除了与k12野生型不同的两个未知残基之外，fimh
ld
23-10野生型被认为在没有配体的情况下已经处于高亲和力(h)构象。单突变变体f71y和f144v在没有配体的情况下处于低亲和力(l)构象但在存在配体的情况下切换到h构象，而双突变变体f71y/f144v甚至在存在配体的情况下仍保持l构象。对于用于疫苗的药物组合物而言，这种不能切换回高亲和力构象的特性使fimh(f71y/f144v)尤其具有吸引力，因为它例如确保了不需要另外的品质或稳定性控制来测试构象在储存期间或在其他储存条件下是否稳定。另外，不能切换回高亲和力构象的特性允许使用fimh(f71y/f144v)作为研究工具来研究作用机制或获得构象知识，并且它允许使用fimh(f71y/f144v)来生成具有有用的研究、诊断和可能的药物应用的特定抗体。
[0155]
因此，作为结论，在所有测试的fimh变体中，fimh(f71y)、fimh(f144v)和fimh(f71y/f144v)能够诱导最高水平的功能性抑制性抗体，同时保持fimh结合口袋的完整。fimh(f71y/f144v)具有完全消除与甘露糖苷的结合的另外的优势和即使在存在配体的情况下仍保持锁定于低亲和力构象的另外的优势。

技术特征：
1.一种多肽，所述多肽包含在与seq id no:1中的位置71相对应的位置处包含酪氨酸(y)或色氨酸(w)的fimh凝集素结构域。2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述fimh凝集素结构域在与seqid no:1中的位置71相对应的位置处包含酪氨酸(y)。3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中所述多肽还在与seq id no:1的氨基酸序列中的位置144相对应的位置处包含除苯丙氨酸(f)之外的氨基酸。4.根据权利要求3所述的多肽，其中所述多肽在与seq id no:1中的位置144相对应的位置处包含选自由以下组成的组的氨基酸：缬氨酸(v)、异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、甘氨酸(g)、甲硫氨酸(m)和丙氨酸(a)。5.根据权利要求3或4所述的多肽，其中所述fimh凝集素结构域在与seq id no:1中的位置144相对应的位置处包含缬氨酸(v)。6.根据权利要求1-5中任一项所述的多肽，其中所述fimh凝集素结构域具有与seq id no:1具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，优选地其中所述fimh凝集素结构域包含seq id no:1，其中位置71处的苯丙氨酸残基被酪氨酸取代。7.根据权利要求6所述的多肽，其中所述fimh凝集素结构域包含seqid no:1，其中位置71处的苯丙氨酸残基被酪氨酸取代，并且其中位置144处的苯丙氨酸残基被缬氨酸取代。8.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽还包含fimh菌毛蛋白结构域。9.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽是与seq id no:2具有至少90％序列同一性的全长fimh，优选地其中所述fimh凝集素结构域包含seq id no:2，其中位置71处的苯丙氨酸残基被酪氨酸取代，并且其中更优选地所述fimh凝集素结构域包含seq id no:2，其中位置71处的苯丙氨酸残基被酪氨酸取代，并且其中位置144处的苯丙氨酸残基被缬氨酸取代。10.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求1-9中任一项所述的多肽。11.一种载体，所述载体包含根据权利要求10所述的多核苷酸。12.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含根据权利要求10所述的多核苷酸或根据权利要求11所述的载体。13.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-9中任一项所述的多肽、根据权利要求10所述的多核苷酸或根据权利要求11所述的载体。14.根据权利要求1-9所述的多肽、根据权利要求10所述的多核苷酸、根据权利要求11所述的载体或根据权利要求12所述的药物组合物，用于在诱导针对肠杆菌科细菌的免疫应答中使用，优选地，其中所述细菌是大肠杆菌或克雷伯氏菌，优选地是大肠杆菌。15.根据权利要求1-9所述的多肽、根据权利要求10所述的多核苷酸、根据权利要求11所述的载体或根据权利要求12所述的药物组合物，用于预防或治疗受试者中由大肠杆菌引起的尿路感染。16.一种用于产生包含fimh凝集素结构域的多肽的方法，所述方法包括从含有根据权利要求10所述的多核苷酸和/或根据权利要求11所述的载体的重组细胞表达所述多肽，任选地所述方法还包括回收和纯化所述多肽，然后任选地配制成所述多肽的药物组合物。

技术总结
本发明描述了包含FimH凝集素结构域的多肽，该FimH凝集素结构域包含导致该FimH凝集素结构域呈对甘露糖低亲和力的构象的至少一个氨基酸突变。还描述了包含此类多肽的药物组合物和通过施用该多肽在有需要的受试者中刺激免疫应答的方法。免疫应答的方法。


技术研发人员：J
受保护的技术使用者：杨森制药公司
技术研发日：2022.01.11
技术公布日：2023/10/15