修饰的红细胞及其治疗高尿酸血症和痛风的用途的制作方法

1.本公开一般地涉及修饰的红细胞(rbc)，并且更具体地涉及共价修饰的rbc及其治疗高尿酸血症和痛风的用途。背景
2.痛风是成人中、尤其男性中最常见形式的炎性关节炎，全球患病率为1％至4％。当尿酸单钠晶体(msu)在组织中沉积，造成痛风发作的炎症和强烈疼痛时，痛风发生。痛风的生物学前兆是血清尿酸(ua)水平升高(即，高尿酸血症)。尽管高尿酸血症是形成痛风的最强烈单一危险因素并且普遍存在于痛风患者中，但并非全部高尿酸血症个体形成痛风。近期工作已经强调先天免疫应答的重要性。
3.常规的降尿酸盐药如抗炎药(秋水仙碱)、黄嘌呤氧化酶抑制剂(别嘌呤醇、非布司他)或排尿酸药(丙磺舒、苯溴马隆)诱导ua沉积物非常缓慢地降低，不允许全部痛风患者的痛风石快速消散，并且主要在早期使用。
4.尿酸氧化酶(uox，尿酸酶)是将ua代谢成尿囊素的肝酶，尿囊素是一种由肾容易排泄的更水溶性化合物。全部哺乳动物均产生uox，例外是人和某些灵长类。相反，在进化期间，uox在人类中失活，这主要归因于编码这种酶的基因中错义突变和移码突变。当不可以使用常规降尿酸盐药时，尿酸酶无可置疑地代表慢性痛风石性痛风的一个有价值的治疗选项。
5.拉布立酶，一种来自黄曲霉(a.flavus)的重组uox，由欧洲药品管理局(emea)在2001年和美国食品药品监督管理局(fda)于2002年批准用于肿瘤溶解综合征。这种药物显著地降低血清ua水平并且比别嘌呤醇起效更快。推荐剂量是在儿童和成人中0.2mg/kg。然而，其生物半寿期短(仅21小时)，从而每天一次输注给予布立酶持续≤7天。另外，近期研究已经显示，重复uox注射可能造成变应性反应，产生中和uox酶活性的抗体[参考文献11-16]。
[0006]
培戈洛酶，一种含狒狒c端序列的重组猪uox，是经fda批准用于慢性痛风患者的修饰的聚乙二醇化重组uox，其开发成治疗难治性痛风的高尿酸血症的首种无免疫原性生物制品。一项对比安慰剂的6个月研究显示培戈洛酶(每2周按8mg输注)引起约40％患者中血浆ua显著降低(与痛风石溶解倾向性相关)。但是，剩余患者无反应，这与形成培戈洛酶抗体和输注反应相关。超过10％经培戈洛酶治疗的患者具有不良事件如肾结石、关节痛、贫血、肌痉挛、呼吸困难、头痛、恶心和发热[参考文献17-21]。
[0007]
可获得的重组uox(拉布立酶、培戈洛酶)药物是痛风的强力降尿酸药。但是，当前疗法存在数个局限性。首先，uox具有显著免疫原性并且它可能诱导重度过敏反应。使治疗性酶缀合于peg可以在患者中减少免疫应答。然而，研究显示许多经peg-缀合酶治疗的患者形成抗peg抗体。另外，peg可能不利地影响所缀合酶的活性，在治疗中导致疗效降低。第二，治疗用酶可能在体内失活或被消除，原因在于半衰期短、生物利用率有限和/或与血浆蛋白相互作用。其三，酶生产和纯化常常是费时，并且因此采用酶替代疗法的治疗非常昂贵。治疗费用(基于年度计算)对拉布立酶估计为约7200欧元，而对于培戈洛酶为41,240欧元。因
此，我们需要更有效且更安全的新型痛风疗法。
[0008]
来自黄曲霉的尿酸氧化酶是一种135kda同四聚体酶。每个单体由二个结构上等同的隧道折叠基序或t折叠基序组成，这些折叠基序包含反平行四链β-折叠连同一对层叠在该折叠凹陷侧上的反平行α-螺旋。二个t折叠基序的并置产生一个八条依次链的反平行β-折叠，而并列的二聚体因此由一个α8β16桶组成，该桶具有八个形成桶外部的螺旋。活性四聚体随后由按头-对-头布置的二聚体的二聚体形成，外部大小为及内部隧道长且直径为
[0009]
已经通过直接囊化、外来肽非共价结合或通过融合于rbc表面蛋白特异性抗体来安置蛋白质，将rbc作药物递送载体开发。已经展示这类修饰的rbc有体内应用局限性。例如，囊化将破坏细胞膜，这随后影响已工程化细胞的体内存活率。此外，聚合物粒子与rbc的非共价接合轻易地解离，并且负载将在体内迅速降解。
[0010]
细菌分选酶是能够以共价和位点特异性方式修饰蛋白质的转肽酶。来自金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)的野生型分选酶a(wt srta)识别lpxtg基序并且在苏氨酸和甘氨酸之间切割，以在酶和底物蛋白之间形成共价性酰基-酶中间体。这种中间体因通常情况下在n末端有三个连续甘氨酸残基(3
×
甘氨酸，g3)的肽或蛋白质亲核攻击而分解。先前研究已经在rbc上以遗传方式过量表达在其c末端上带lpxtg基序的膜蛋白kell，所述基序可以通过使用wt srta接合于3
×
甘氨酸修饰或g(n＝3)修饰的蛋白质/肽的n末端。这些携药rbc已经在动物模型上显示有效治疗疾病。然而，这需要工程化造血干细胞或祖细胞(hspc)并使这些细胞分化为成熟rbc的步骤，这显著地限制应用。
[0011]
因此，本领域仍需要治疗高尿酸血症和尤其痛风的改进策略。发明概述
[0012]
在一个通用方面，提供一种使试剂与之连接的红细胞(rbc)，其中该试剂通过分选酶介导的反应、优选通过分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合与至少一种内源性、非工程化rbc膜蛋白连接，并且其中该试剂包含尿酸降解多肽。
[0013]
在一些实施方案中，分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合至少发生在至少一种内源性、非工程化膜蛋白的胞外结构域内部位点处的甘氨酸(n)和/或赖氨酸ε-氨基上，优选地n为1或2。
[0014]
在一些实施方案中，rbc尚未经基因工程化以表达包含分选酶识别基序或亲核性接纳体序列的蛋白质，并且优选地rbc是天然rbc，如人天然rbc。
[0015]
在一些实施方案中，分选酶能够介导甘氨酸(n)缀合和/或赖氨酸侧链ε-氨基缀合，优选地在至少一种内源性、非工程化膜蛋白的胞外结构域内部位点处介导，优选地n为1或2。
[0016]
在一些实施方案中，分选酶是分选酶a(srta)，如金黄色葡萄球菌转肽酶a变体(mgsrta)。
[0017]
在一些实施方案中，mgsrta包含与如seq id no:3中所述的氨基酸序列具有至少60％同一性的氨基酸序列或基本上由其组成或由其组成。
[0018]
在一些实施方案中，与rbc连接之前，试剂在其c末端包含分选酶识别基序。
[0019]
在一些实施方案中，试剂包含(a1-sp)
m-m的结构，其中a1代表该试剂，sp代表任选的间隔子并且m代表分选酶识别基序；m为大于或等于1的整数，优选地m＝1至3。
[0020]
在一些实施方案中，分选酶识别基序包含选自以下的氨基酸序列或基本上由其组成或由其组成：lpxtg、lpxag、lpxsg、lpxlg、lpxvg、lgxtg、laxtg、lsxtg、npxtg、mpxtg、ipxtg、spxtg、vpxtg、ypxrg、lpxts和lpxta，其中x是任何氨基酸。
[0021]
在一些实施方案中，分选酶识别基序包含从分选酶识别基序n末端至c末端的方向位于位置5处的非天然氨基酸，其中非天然氨基酸是具有式ch2oh-(ch2)
n-cooh的任选取代的羟基羧酸，n是从0至3的整数，优选地n＝0。
[0022]
在一些实施方案中，分选酶识别基序包含选自以下的氨基酸序列或基本上由其组成或由其组成：lpxt*y、lpxa*y、lpxs*y、lpxl*y、lpxv*y、lgxt*y、laxt*y、lsxt*y、npxt*y、mpxt*y、ipxt*y、spxt*y、vpxt*y和ypxr*y，其中*代表任选取代的羟基羧酸；并且x和y独立地代表任何氨基酸。
[0023]
在一些实施方案中，分选酶识别基序包含选自以下的氨基酸序列或基本上由其组成或由其组成：lpxt*g、lpxa*g、lpxs*g、lpxl*g、lpxv*g、lgxt*g、laxt*g、lsxt*g、npxt*g、mpxt*g、ipxt*g、spxt*g、vpxt*g、ypxr*g、lpxt*s和lpxt*a，优选地，分选酶识别基序是*为2-羟基乙酸的lpet*g。
[0024]
在一些实施方案中，与brc表面上至少一种内源性、非工程化膜蛋白连接的试剂包含(a1-sp)
m-l1-p1的结构，其中l1与p1中的甘氨酸(n)连接，和/或(a1-sp)
m-l1-p2的结构，其中l1与p2中的赖氨酸侧链ε-氨基连接，其中n优选地是1或2，a1代表试剂，sp代表任选的间隔子，l1选自lpxt、lpxa、lpxs、lpxl、lpxv、lgxt、laxt、lsxt、npxt、mpxt、ipxt、spxt、vpxt和ypxr，p1和p2独立地代表至少一种内源性、非工程化膜蛋白的胞外结构域，并且x代表任何氨基酸；m为大于或等于1的整数，优选地m＝1至3。
[0025]
在一些实施方案中，sp选自由以下类型组成的群组：(1)零长度类型；(2)胺-硫氢基类型；(3)同双官能nhs酯类型；(4)同双官能酰亚胺酯类型；(5)羰基-硫氢基类型；(6)硫氢基反应性类型；和(7)硫氢基-羟基类型；和优选地一个或多个sp是nhs酯-马来酰亚胺异双官能交联剂如6-马来酰亚胺己酸和4-马来酰亚胺丁酸并且试剂包含暴露的硫氢基，优选地暴露的半胱氨酸，更优选地末端半胱氨酸，最优选地c末端半胱氨酸。
[0026]
在一些实施方案中，尿酸降解多肽包含一种或多种选自以下的多肽：尿酸酶、hiu水解酶、ohcu脱羧酶、尿囊素酶和尿囊酸酶，优选地尿酸酶包含seq id no:27中所述的氨基酸序列或其功能性变体或片段。
[0027]
在一些实施方案中，试剂额外地包含尿酸转运蛋白，所述尿酸转运蛋白优选地包含一种或多种选自以下的多肽：urat1、glut9、oat4、oat1、oat3、gal-9、abcg2、slc34a2、mrp4、oat2、npt1、npt4和mct9，优选地urat1包含seq id no:28中所述的氨基酸序列或其功能性变体或片段。
[0028]
在另一个方面，提供是一种组合物，所述组合物包含多个如本文所述的红细胞和生理可接受的载体。
[0029]
在另一个方面，提供是一种用于制备如本文所述红细胞的方法，所述方法包括将红细胞(rbc)与包含分选酶识别基序和试剂的分选酶底物在分选酶存在下，在适于分选酶通过分选酶介导的反应、优选地通过分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合，使分选酶底物缀合于至少一种内源性、非工程化rbc膜蛋白的条件下接触，其中试剂包含尿酸降解多肽，或尿酸降解多肽和尿酸转运蛋白的组合。
[0030]
在一些实施方案中，分选酶底物包含(a1-sp)
m-m的结构，其中a1代表试剂，sp代表任选的间隔子并且m代表分选酶识别基序；m为大于或等于1的整数，优选地m＝1至3。
[0031]
在一些实施方案中，分选酶识别基序包含选自以下的氨基酸序列或基本上由其组成或由其组成：lpxtg、lpxag、lpxsg、lpxlg、lpxvg、lgxtg、laxtg、lsxtg、npxtg、mpxtg、ipxtg、spxtg、vpxtg、ypxrg、lpxts和lpxta，其中x是任何氨基酸。
[0032]
在一些实施方案中，分选酶识别基序包含从分选酶识别基序n末端至c末端的方向位于位置5处的非天然氨基酸，其中非天然氨基酸是具有式ch2oh-(ch2)
n-cooh的任选取代的羟基羧酸，n是从0至3的整数，优选地n＝0。
[0033]
在一些实施方案中，分选酶识别基序包含选自以下的氨基酸序列或基本上由其组成或由其组成：lpxt*y、lpxa*y、lpxs*y、lpxl*y、lpxv*y、lgxt*y、laxt*y、lsxt*y、npxt*y、mpxt*y、ipxt*y、spxt*y、vpxt*y和ypxr*y，其中*代表任选取代的羟基羧酸；并且x和y独立地代表任何氨基酸。
[0034]
在一些实施方案中，分选酶识别基序包含选自以下的氨基酸序列或基本上由其组成或由其组成：lpxt*g、lpxa*g、lpxs*g、lpxl*g、lpxv*g、lgxt*g、laxt*g、lsxt*g、npxt*g、mpxt*g、ipxt*g、spxt*g、vpxt*g、ypxr*g、lpxt*s和lpxt*a，优选地，分选酶识别基序是*为2-羟基乙酸的lpet*g。
[0035]
在一些实施方案中，sp选自由以下类型组成的群组：(1)零长度类型；(2)胺-硫氢基类型；(3)同双官能nhs酯类型；(4)同双官能酰亚胺酯类型；(5)羰基-硫氢基类型；(6)硫氢基反应性类型；和(7)硫氢基-羟基类型；和优选地一个或多个sp是nhs酯-马来酰亚胺异双官能交联剂如6-马来酰亚胺己酸和4-马来酰亚胺丁酸并且试剂包含暴露的硫氢基，优选地暴露的半胱氨酸，更优选地末端半胱氨酸，最优选地c末端半胱氨酸。
[0036]
在另一个方面，提供一种用于有需求的受试者中治疗或预防与升高的尿酸水平相关的病症、病状或疾病的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所述的红细胞或组合物。
[0037]
在一些实施方案中，受试者在施用之前具有大于约8.0mg/dl的血清尿酸水平。
[0038]
在一些实施方案中，与升高的尿酸水平相关的病症、病状或疾病选自：高尿酸血症、痛风(例如，慢性顽固性痛风、痛风结节和痛风性关节炎)、代谢综合征、肿瘤溶解综合征、lesch-nyhan综合征、心血管疾病、糖尿病、高血压、肾脏疾病和尿酸肾石病。
[0039]
在另一个方面，提供如本文所述的红细胞或组合物在制造用于治疗或预防有需求的受试者中与升高的尿酸水平相关的病症、病状或疾病的药物中的用途。
[0040]
在一些实施方案中，受试者在施用之前具有大于约8.0mg/dl的血清尿酸水平。
[0041]
在一些实施方案中，与升高的尿酸水平相关的病症、病状或疾病选自：高尿酸血症、痛风(例如，慢性顽固性痛风、痛风结节和痛风性关节炎)、代谢综合征、肿瘤溶解综合征、lesch-nyhan综合征、心血管疾病、糖尿病、高血压、肾脏疾病和尿酸肾石病。
[0042]
在另一个方面，提供如本文所述的红细胞或组合物用于治疗或预防有需求的受试者中与升高的尿酸水平相关的病症、病状或疾病，所述病症、病状或疾病优选地选自：高尿酸血症、痛风(例如，慢性顽固性痛风、痛风结节和痛风性关节炎)、代谢综合征、肿瘤溶解综合征、lesch-nyhan综合征、心血管疾病、糖尿病、高血压、肾脏疾病和尿酸肾石病。附图简述
[0043]
在附图中，以举例方式说明本公开的实施方案。应当明确指出：说明书和附图仅用
于说明目的及作为理解过程的辅助，并且不意在限制本发明的范围。
[0044]
图1a-图1k.显示用野生型分选酶(wt srta或wtsrta)和突变体分选酶(mg srta或mgsrta)高效标记小鼠或人天然rbc表面上的肽和蛋白质。
[0045]
图1a和图1b.将109个/ml小鼠rbc(图1a)或人rbc(图1b)在4℃与500μm生物素-lpetg在具有或没有40μm野生型(wt)srta或mg srta的情况下孵育2小时。在酶促反应后，通过将rbc与pe缀合的链霉亲和素孵育并通过流式细胞术分析检测标记的效力。直方图显示经或未经mg分选酶或wt分选酶标记的rbc表面上的生物素信号。
[0046]
图1c.将109个/ml小鼠rbc与8μm生物素-lpetg肽和40μm mg srta或wt srta在37℃孵育2小时。通过采用链霉亲和素-hrp的免疫印迹法分析标记效力。使用血红蛋白亚基α1，hba1作为内参对照。
[0047]
图1d.处理109个/ml小鼠rbc以通过超速离心富集膜蛋白。通过slc4a1基因编码的rbc膜蛋白条带3的蛋白质印迹检测到膜蛋白明显富集。
[0048]
图1e.109个/ml小鼠rbc由mg srta生物素标记并经历膜蛋白富集。蛋白质印迹结果显示与未富集的样品相比，富集步骤后生物素信号明显升高。
[0049]
图1f.109个小鼠rbc借助生物素-lpetg由mg srta或wt srta分选标记。在分选标记后，将标记的rbc用dir染料染色并且静脉内注射入小鼠。在灌输后24小时对小鼠放血。将血样与fitc缀合的链霉亲和素在37℃孵育1小时，以检测生物素信号，并且在通过流式细胞术分析之前洗涤三次。选择dir阳性细胞以分析有生物素信号的rbc的百分数。
[0050]
图1g.在灌输后所示的时日对小鼠放血。dir阳性细胞指示循环中的已灌输rbc的百分数。
[0051]
图1h.分析来自以上实验的血样的dir阳性rbc的生物素阳性细胞百分数。
[0052]
图1i.在注射后第4天，通过成像流式细胞术就rbc上的生物素分选标记分析血样。将血样与fitc缀合的链霉亲和素在37℃孵育1小时，以检测生物素信号，并且在通过流式细胞术分析之前洗涤三次。
[0053]
图1j.109个/ml小鼠rbc借助100μm egfp-lpetg由mg srta或wt srta在37℃分选标记2小时。通过流式细胞术分析缀合的效力。直方图显示经或未经mg分选酶或wt分选酶标记的rbc表面上的生物素信号。红色：无分选酶；蓝色：mg分选酶；橙色：wt分选酶。
[0054]
图1k.将109个egfp分选标记的小鼠rbc用dir染料染色并静脉内注射入小鼠。在注射后第7天，将小鼠放血并且通过成像流式细胞术就rbc表面上的egfp信号分析血样。
[0055]
图2显示静脉内注射ot-1-rbc在体内ot-1tcr t细胞中诱导免疫耐受。
[0056]
图2a.将纯化自cd45.1 ot-1tcr转基因小鼠的106个cd8+t细胞静脉内注入cd45.2受者小鼠。在24小时后，将2x 109个小鼠rbc借助mg srta介导经ot-1肽标记或未经其标记并且灌输至受者小鼠，所述小鼠将用ot-1肽随弗氏完全佐剂(cfa)一起攻击。在第15天，将这些小鼠安乐死并进行脾收获。
[0057]
图2b.通过流式细胞术分析从脾分离的悬浮细胞。首先选出cd8+t细胞以分析cd45.1+t细胞百分数，这展示过继转移的ot-1tcr cd8+t细胞存活。对cd45.1+cd8+t细胞进一步分析pd1和cd44表达。cd45.2：用于指示这个实验中内源t细胞的在许多造血细胞表面上表达的膜蛋白。cd44：t细胞活化标志物；pd-1：细胞凋亡和衰竭标志物。
[0058]
图3显示不可逆性接头6-mal-lpet*g(6-马来酰亚胺己酸-leu-pro-glu-thr-2-羟
基乙酸-gly；6-mal代表6-马来酰亚胺己酸)的化学结构。
[0059]
图4显示缀合不可逆性接头6-mal-lpet*g至已修饰蛋白质的反应方案。将两种反应底物混合并按比率1:4＝egfp-cys:6-mal-lpet*g反应以获得最终反应产物。
[0060]
图5显示不可逆性接头6-mal-k(6-mal)-ggg-k(6-mal)-gggsaa-lpet*g和6-mal-k(6-mal)-ggggggsaa-lpet*g的化学结构(顶部)和通过双头叉和三头叉缀合的蛋白质的示意图(底部)。
[0061]
图6显示通过质谱法鉴定的产物。色谱脱盐并分离蛋白质，随后在6230tof lc/ms光谱仪上分析蛋白质样品。熵并入bioconfirm 10.0软件。
[0062]
图7显示依据串联质谱法的egfp-cys蛋白质序列和蛋白质侧链修饰的检测结果。
[0063]
图8显示在天然rbc表面上通过突变体分选酶(mgsrta)有效标记egfp-cys-6-mal-lpet*g。将rbc与75μm egfp-cys-6-mal-lpet*g连同10μm mg srta一起在37℃孵育2小时。在酶促反应后，通过流式细胞术检测标记效力。直方图显示表面上的egpf信号。红色：未标记；蓝色：egfp-lpetg；橙色：egfp-cys-6-mal-lpet*g。
[0064]
图9显示由mg srta分选标记有egfp-cys-6-mal-lpet*g的109个小鼠rbc的结果。在分选标记后，将标记的rbc用dir染料染色并且静脉内注射入小鼠。在输注后24小时对小鼠放血。通过流式细胞术分析血样。选择dir阳性细胞以分析有egfp信号的rbc的百分数。
[0065]
图10显示如通过dir阳性细胞所示处于循环中的已输注rbc的百分数。在输注后所示的时日对小鼠放血。
[0066]
图11显示通过分析来自以上实验的血样的dir阳性rbc所获得的egfp阳性细胞百分数。
[0067]
图12显示细胞表面上egfp信号的成像分析。将109个egfp分选标记的小鼠rbc用dir染料染色并静脉内注射入小鼠。在注射后第7天，将小鼠放血并且通过成像流式细胞术就rbc表面上的egfp信号分析血样。
[0068]
图13显示天然rbc表面上由mg srta所致的uox-his
6-cys-lpet*g标记效率。直方图显示经mg分选酶(uox-rbc)标记或无mg分选酶情况下(对照)的rbc表面上的his标签信号(图13a：小鼠rbc；图13b：人rbc；图13c：大鼠rbc；图13d：食蟹猴rbc)。
[0069]
图14显示工程化红细胞的体外功能性分析。在指定的时间评价尿酸浓度以分别在体外确定由大鼠(图14a)和食蟹猴(图14b)的工程化rbc消耗ua的速率。
[0070]
图15显示工程化红细胞的体内存活和稳定性。使对照rbc和uox-rbc与far红反应并且借助静脉内注射法输注入食蟹猴。使用流式细胞术借助far红色荧光追踪rbc体内存活情况。
[0071]
图16描述食蟹猴中放射标记的uox-rbc的代表性pet图像。向食蟹猴静脉内注射放射标记的uox-rbc。在输注后0.5小时(图16a)、1小时(图16b)和3小时(图16c)获得pet扫描。pet显示uox-rbc在肝脏和脾脏中分布最明显，而在心脏、脑和肌肉中蓄积较少。
[0072]
图17显示工程化红细胞的体内功能性分析。在重复输注后，大鼠uox-rbc在大鼠高尿酸血症模型中降低ua浓度(图17a：第1次输注；图17b：第2次输注；图17c：第3次输注)。
[0073]
图18显示食蟹猴(图18a)和大鼠(图18b)中的抗uox igg抗体滴度。发明详述
[0074]
出于促进理解本公开的原理目的，现在将参考附图中所示的实施方案，并且专用
语言将会用来描述这些实施方案。然而，将理解，不意图因此限制本发明的范围。
[0075]
在本公开中，除非另外说明，否则本文所用的科学术语和技术术语具有如本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义。虽然任何与本文所述相似或等同的方法和材料都可以用于实施本发明，但本文描述了优选的方法和材料。因此，通过参考作为一个整体的说明书更充分地描述本文中定义的术语。
[0076]
如本文中所用，除非上下文另外明确指示，否则单数术语“一个(a)”、“一种(an)”和“该(an)”包括复数称谓。除非另外说明，核酸从左至右按5'至3'方向书写；氨基酸序列从左至右按氨基至羧基方向书写。应当理解，本发明不限于所述的具体方法体系、方案和试剂，因为这些可以根据本领域技术人员使用它们的背景变动。
[0077]
如本文所用，术语“基本上由
……
组成”在氨基酸序列的背景下意指所述氨基酸序列连同n末端或c末端处的额外一个、两个、三个、四个或五个氨基酸。
[0078]
除非上下文另有要求，否则术语“包括了”、“包含”和“包括”或相似术语意指非排斥性包括，从而一系列列举的要素或特征不仅仅包括那些载明或列出的元素，还可以包括未列出或载明的其他要素或特征。
[0079]
如本文所用，术语“患者”、“个体”和“受试者”在本文公开治疗或组合物的任何哺乳动物受者背景下使用。因此，本文公开的方法和组合物可以具有医学应用和/或兽医应用。在一个优选形式中，哺乳动物是人。
[0080]
如本文所用，术语“序列同一性”意在包括考虑使用标准算法适当比对、考虑序列在比较窗口范围内相同的范围时，确切核苷酸或氨基酸匹配的数目。因此，通过以下方式计算“序列同一性百分数”：在比较窗口范围内比较两个最佳对齐的序列；确定其中相同核酸碱基(例如，a、t、c、g)在两个序列中出现的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口(即，窗口大小)中位置总数并且将结果乘以100以产生序列同一性百分数。例如，例如，“序列同一性”可以理解为意指通过dnasis计算机程序(用于视窗系统的2.5版；从美国加利福尼亚州南旧金山日立软件工程化有限公司可获得)计算的“匹配百分数”。
[0081]
近期研究已经发现在基序识别方面具有不同特异性的突变体分选酶[4]。例如，ge等人证明一种演进的srta变体(mg srta)能够识别g1修饰肽的n末端，这不能为wt srta实现[5]。另外，n末端处有单个甘氨酸的膜蛋白比具有3
×
甘氨酸的那些膜蛋白丰富得多。gei等人对具有预测的n末端甘氨酸的人膜蛋白质组的n端序列进行分析。根据先前研究酶促移除信号肽或起始甲硫氨酸残基后，找到182种含有n端甘氨酸残基的蛋白质的一个列表[7]。在它们当中，176种蛋白质(96.70％)在n末端含有单个甘氨酸残基，4种蛋白质(2.20％)在n末端含有gg残基，而仅2种蛋白质(1.10％)在n末端含有g
(n≥3)
残基。已知182种蛋白质无一表达在成熟人红细胞的表面上。
[0082]
本文中，本公开是至少部分地基于令人惊讶的研究结果：尽管不存在已知的n末端甘氨酸，但可以通过至少在至少一种内源性、非工程化膜蛋白的胞外结构域内部位点处甘氨酸
(n＝1或2)
和赖氨酸ε-氨基上发生的分选酶介导甘氨酸缀合和/或分选酶介导赖氨酸侧链缀合，将分选酶底物缀合至天然人rbc至少一种内源性、非工程化膜蛋白。不受理论限制，构思分选酶的非典型功能能够实现使分选酶底物缀合至内源性、非工程化膜蛋白的胞外结构域中的内部甘氨酸
(n＝1或2)
和/或赖氨酸侧链ε-氨基。还构思，在不受任何理论限制下，红细胞
生成期间的广泛组织特异性mrna剪接和蛋白质翻译可能导致甘氨酸
(n＝1或2)
暴露。
[0083]
发明人因此开发了一种通过分选酶介导的反应，借助肽和/或小分子共价修饰天然rbc内源性、非工程化膜蛋白的新策略。该技术允许通过直接修饰天然rbc而非受其资源所限的hspc，产生rbc产物。另外，修饰的rbc良好保留其原始生物学特性并且作为其天然状态保持稳定。
[0084]
为了更有效增加产物的产量并且减少逆反应发生，本公开的发明人进一步惊讶地发现，通过化学偶联修饰蛋白质可以大幅度降低细胞标记过程期间要求的蛋白质浓度。
[0085]
为了实现通过分选酶标记rbc，将半胱氨酸残基掺入uox的每个单体的c端位置，以促进马来酰亚胺介导的lpetg肽缀合。二聚体的并列构型造成一个单体的第一β-链毗邻另一单体的最后β-链对齐，并且一个单体的n端区域紧邻隔壁单体的c末端尾。归因于这些独有结构特性，每个单体的n端残基应当保持不改变或略微截短，以避免过量残基阻碍分选酶与lpetg肽结合。另外，当使用imac作为重组蛋白纯化策略时，his 6标签可以插入单体c末端与半胱氨酸残基之间，并且在这个位置并入间隔子如纯化标签或等同长度的gs接头也维持酶离分选酶结合位点足够的距离，鉴于空间效应，这可能有利。发现如本文所述的策略标记可以在体外和体内以极高效率标记天然红细胞并且维持尿酸降解多肽(例如uox)的酶活性并且经尿酸降解多肽(例如uox)标记的rbc可以在体内成功地降低血液尿酸水平，而无明显不良作用，如依据可能归功于施用uox-rbc的血液学、凝血、血液生化和尿液分析的无变化所示。红细胞(rbc)
[0086]
在一些方面，本公开提供一种试剂与之连接的红细胞(rbc)，其中试剂通过分选酶介导的反应与至少一种内源性、非工程化rbc膜蛋白连接。在一些实施方案中，该试剂借助分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合与至少一种内源性、非工程化rbc膜蛋白连接。在一些实施方案中，分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合至少发生在至少一种内源性、非工程化膜蛋白的胞外结构域中(例如胞外结构域内部位点或胞外结构域n末端处)的甘氨酸(n)和/或赖氨酸ε-氨基上，优选地n为1或2。在一些实施方案中，不受任何理论限制，分选酶介导的甘氨酸缀合可以发生在因红细胞生成期间组织特异性mrna剪接和蛋白质翻译而暴露的先前未报道过的膜蛋白中的甘氨酸
(n＝1或2)
处。在一些实施方案中，暴露的甘氨酸
(n＝1或2)
可以是n末端暴露的甘氨酸
(n＝1或2)
。在一些实施方案中，分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合发生在胞外结构域的末端赖氨酸或内部赖氨酸的ε-氨基处。在一些实施方案中，分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合可以发生在至少一种内源性、非工程化膜蛋白的胞外结构域的末端(例如，n末端)位点和/或内部位点处的甘氨酸(n)和/或赖氨酸ε-氨基上，优选地n为1或2。
[0087]
除非另外说明或从上下文明确显而易见，倘若本公开涉及红细胞(rbc)，通常意指成熟红细胞。在某些实施方案中，rbc是人rbc，如人天然rbc。
[0088]
在一些实施方案中，rbc是这样一种红细胞，其尚未经基因工程化以表达包含分选酶识别基序或亲核性接纳体序列的蛋白质。在一些实施方案中，rbc尚未经基因工程化。除非另外说明或从上下文明确显而易见，倘若本公开涉及分选标记红细胞，通常意指红细胞尚未经基因工程化分选标记。在某些实施方案中，红细胞未经基因工程化。
[0089]
如果某红细胞细胞尚未经基因工程化以表达包含在分选酶催化的反应中的分选酶识别基序或亲核性接纳体序列的蛋白质，则该红细胞视为“未经基因工程化以进行分选标记”。
[0090]
在一些实施方案中，本公开提供借助分选酶介导的反应使试剂与之缀合的红细胞。在一些实施方案中，提供一种包含多个这类细胞的组合物。在一些实施方案中，该组合物中至少选定百分数的细胞受修饰，即，具有通过分选酶与之缀合的试剂。例如，在一些实施方案中，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的细胞让试剂与之缀合。在一些实施方案中，缀合的试剂可以是本文所述的一种或多种试剂。在一些实施方案中，试剂可以与如5表中列出的一个或多个或全部序列(例如，seq id nos:5-26)中的甘氨酸(n)和/或赖氨酸ε-氨基缀合。在一些实施方案中，试剂可以与包含seq id no:5的序列中的甘氨酸(n)和/或赖氨酸ε-氨基缀合。
[0091]
在一些实施方案中，本公开提供一种红细胞，其包含借助分选酶介导的反应与该细胞表达的非基因工程化内源多肽缀合的试剂。在一些实施方案中，该细胞表达的二种、三种、四种、五种或更多种不同的内源非工程化多肽已经借助分选酶介导的反应与试剂缀合。与不同多肽结合的试剂可以相同或可以用多种不同试剂分选标记细胞。
[0092]
在一些实施方案中，本公开提供一种红细胞(rbc)，其具有借助分选酶介导的反应与位于brc表面上至少一种内源性、非工程化膜蛋白的胞外结构域中任何位置(优选地为内部位点)的甘氨酸(n)或赖氨酸侧链连接的试剂，其中n优选地是1或2。在一些实施方案中，该试剂与胞外结构域中或其内部的一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)甘氨酸(n)或赖氨酸侧链ε-氨基连接。在某些实施方案中，至少一种内源性、非工程化膜蛋白可以选自下表5中列出的膜蛋白或其任意组合。在某些实施方案中，至少一种内源性、非工程化膜蛋白可以选自表5中列出的22种膜蛋白或其任意组合。在一些实施方案中，分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合可以发生在如5表中列出的一个或多个或全部序列(例如，seq id nos:5-26)中的甘氨酸(n)和/或赖氨酸ε-氨基处。在某些实施方案中，至少一种内源性非工程化膜蛋白可以包含胞外钙敏受体(casr)(甲状旁腺细胞钙敏受体，pcar1)。在某些实施方案中，连接可以是如下表5中所示的一个或多个或全部修饰。在某些实施方案中，连接可以发生在选自如表5中所列修饰位置中的一个或多个位置及其任意组合上，例如，包含casr的g526和/或k527位置；cd抗原cd3g的g158和/或k162；和/或trpc2的g950和/或k964的位置。
[0093]
在一些实施方案中，不限于任何理论，试剂可以与选自下表2、3和/或4中列出的蛋白质或其任意组合中的蛋白质连接。
[0094]
在一些实施方案中，本公开提供一种红细胞(rbc)，其具有与brc表面上至少一种内源性、非工程化膜蛋白连接的试剂。在一些实施方案中，该试剂借助分选酶识别基序与至少一种内源性、非工程化膜蛋白连接。在一些实施方案中，分选酶识别基序可以选自lpxtg、lpxag、lpxsg、lpxlg、lpxvg、lgxtg、laxtg、lsxtg、npxtg、mpxtg、ipxtg、spxtg、vpxtg、ypxrg、lpxts和lpxta，其中x是任何氨基酸。在一些实施方案中，分选酶识别基序可以包含从分选酶识别基序n末端至c末端的方向位于位置5处的非天然氨基酸，其中非天然氨基酸是具有式ch2oh-(ch2)
n-cooh的任选取代的羟基羧酸，n是从0至3的整数，优选地n＝0。在一些实施方案中，包含非天然氨基酸的分选酶识别基序可以选自lpxt*y、lpxa*y、lpxs*y、
lpxl*y、lpxv*y、lgxt*y、laxt*y、lsxt*y、npxt*y、mpxt*y、ipxt*y、spxt*y、vpxt*y和ypxr*y，其中*代表任选取代的羟基羧酸；并且x和y独立地代表任何氨基酸。在一些实施方案中，包含非天然氨基酸的分选酶识别基序可以选自lpxt*g、lpxa*g、lpxs*g、lpxl*g、lpxv*g、lgxt*g、laxt*g、lsxt*g、npxt*g、mpxt*g、ipxt*g、spxt*g、vpxt*g、ypxr*g、lpxt*s和lpxt*a，优选地m是lpet*g，同时*优选地是2-羟基乙酸。
[0095]
可以理解，在试剂与膜蛋白连接后，从分选酶识别基序的第5位置(从n末端至c端方向)起最后一个或两个残基由其上出现连接的氨基酸替换，如本文他处描述。例如，与至少一种内源性、非工程化膜蛋白连接的试剂包含(a1-sp)
m-l
1-p1，其中l1与p1中的甘氨酸
(n)
连接，和/或(a
1-sp)
m-l
1-p2的结构，其中l1与p2中的赖氨酸侧链ε-氨基连接，其中n优选地是1或2；l1选自lpxt、lpxa、lpxs、lpxl、lpxv、lgxt、laxt、lsxt、npxt、mpxt、ipxt、spxt、vpxt和ypxr；a1代表试剂；sp代表任选的间隔子；m是大于或等于1的整数，优选地m＝1至3；p1和p2独立地代表至少一种内源性、非工程化膜蛋白；并且x代表任何氨基酸。在一些实施方案中，与至少一种内源性、非工程化膜蛋白连接的试剂包含(a
1-sp)
m-lpxt-p1，其中lpxt与p1中的甘氨酸
(n)
连接，和/或(a
1-sp)
m-lpxt-p2的结构，其中lpxt与p2中的赖氨酸侧链ε-氨基连接，其中n优选地是1或2，a1代表试剂，sp代表间隔子；m是大于或等于1的整数，优选地m＝1至3；p1和p2独立地代表至少一种内源性、非工程化膜蛋白，并且x代表任何氨基酸。在一些实施方案中，p1和p2可以相同或不同。在一些实施方案中，该试剂与至少一种内源性、非工程化膜蛋白的胞外结构域中或其内部的一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个或更多个)甘氨酸
(n)
或赖氨酸侧链ε-氨基连接。在某些实施方案中，至少一种内源性、非工程化膜蛋白可以选自下表5中列出的膜蛋白或其任意组合。在某些实施方案中，至少一种内源性、非工程化膜蛋白可以选自表5中列出的22种膜蛋白或其任意组合。在一些实施方案中，分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合可以发生在如5表中列出的一个或多个或全部序列(例如，seq id nos:5-26)中的甘氨酸
(n)
和/或赖氨酸ε-氨基处。在某些实施方案中，至少一种内源性非工程化膜蛋白可以包含胞外钙敏受体(casr)(甲状旁腺细胞钙敏受体，pcar1)。在某些实施方案中，连接可以是如下表5中所示的一个或多个或全部修饰。在某些实施方案中，连接可以发生在选自如表5中所列修饰位置中的一个或多个位置及其任意组合上，例如，包含casr的g526和/或k527位置；cd抗原cd3g的g158和/或k162；和/或trpc2的g950和/或k964的位置。
[0096]
在一些实施方案中，通过以下方式修饰基因工程化的红细胞：使用分选酶使分选酶底物与该细胞的非基因工程化内源多肽接合。红细胞可以例如已经过基因工程化以表达广泛种类产物中任一者，例如，多肽或非编码rna，可以经基因工程化以缺失一个或多个基因的至少一部分，和/或可以经基因工程化以在一个或多个内源性基因的序列中具有一个或多个精确改变。在某些实施方案中，这类基因工程化细胞的非工程化内源多肽用本文所述多种试剂中任一者分选标记。
[0097]
在一些实施方案中，本公开构思使用自体红细胞，所述自体红细胞分离自待施用这类已分离红细胞(经体外修饰后)的个体。在一些实施方案中，本公开构思使用免疫相容性红细胞，所述免疫相容性红细胞具有与待施用这类细胞的个体相同的血型(例如，至少相对于abo血液类型系统而言，并且在一些实施方案中，相对于d血型系统而言)或可以具有相容性血型。
内源性、非工程化膜蛋白
[0098]
如本文所用的术语“非工程化”、“非基因修饰”和“非重组性”可互换并且指未经基因工程化、不存在基因修饰等。非工程化膜蛋白涵盖内源蛋白。在某些实施方案中，非基因工程化的红细胞不含有非内源核酸，例如，源自载体、来自不同物种或包含人工序列的dna或rna，例如，人工引入的dna或rna。在某些实施方案中，非工程化细胞尚未在适于细胞摄取核酸的条件下有意地与能够造成可遗传性遗传变异的核酸接触。
[0099]
在一些实施方案中，内源非工程化膜蛋白可以涵盖下表5中列出的膜蛋白或其任意组合中任一者或至少一者。在某些实施方案中，内源非工程化膜蛋白可以涵盖表5中列出的22种膜蛋白或其任意组合中任一者或至少一者。在某些实施方案中，内源性非工程化膜蛋白可以涵盖胞外钙敏受体(casr)(甲状旁腺细胞钙敏受体，pcar1)。分选酶
[0100]
作为“分选酶”鉴定的酶已经分离自多种革兰氏阳性菌。本领域普通技术人员熟知分选酶、分选酶介导的转酰基反应及其在蛋白质工程中的用途(参见，例如，pct/us2010/000274(wo/2010/087994)和pct/us2011/033303(wo/2011/133704))。基于61种来自革兰氏阳性细菌基因组的分选酶的序列比对和系统进化分析，已经将分选酶划分成4类，命名为a、b、c和d(dramsi s,trieu-cuot p,bierne h,sorting sortases:a nomenclature proposal for the various sortases of gram-positive bacteria.res microbiol.156(3):289-97,2005)。本领域技术人员可以基于其序列和/或其他特征(如上文drami等人中描述的那些)，轻易将分选酶归属至正确的分类。如本文所用的术语“分选酶a”指任何具体细菌物种中的a类分选酶，通常命名为srta，例如，来自金黄色葡萄球菌或化脓性链球菌(s.pyogenes)的srta。
[0101]
术语“分选酶”(也称作转酰胺基酶)指具有转酰胺基酶活性的酶。分选酶识别包含分选酶识别基序(例如，氨基酸序列lpxtg)的底物。本文中由分选酶识别(即，包含分选酶识别基序)的分子有时称作“分选酶底物”。分选酶耐受靠近切割位点的广泛种类的部分，因此允许通用性缀合多样实体，只要底物含有适当暴露的分选酶识别基序且合适的亲核体可提供即可。术语“分选酶介导的转酰基反应”、“分选酶催化的转酰基反应”、“分选酶介导的反应”、“分选酶催化的反应”、“分选酶反应”、“分选酶介导的转肽反应”等术语在本文中可互换地用来指这种反应。术语“分选酶识别基序”、“分选酶识别序列”和“转酰胺基酶识别序列”相对于转酰胺基酶或分选酶识别的序列而言在本文中互换使用。术语“亲核性接纳体序列”指能够在分选酶催化的反应中充当亲核体的氨基酸序列，例如，包含n末端甘氨酸(例如，1、2、3、4或5个n末端甘氨酸)或在一些实施方案中包含内部甘氨酸
(n＝1或2)
或赖氨酸侧链ε-氨基的序列。
[0102]
本公开涵盖了涉及本领域已知分选酶类别中任一者(例如，来自任何细菌物种或菌株的分选酶a、b、c或d)的实施方案。在一些实施方案中，使用分选酶a，如来自金黄色葡萄球菌的srta。在一些实施方案中，构思使用两种或更多种分选酶。在一些实施方案中，分选酶可以利用不同的分选酶识别序列和/或不同的亲核性接纳体序列。
[0103]
在一些实施方案中，分选酶是分选酶a(srta)。srta识别基序lpxtg，共同识别基序例如为lpktg、lpatg、lpntg。在一些实施方案中，使用lpetg。然而，也可以识别落于这种共有序列之外的基序。例如，在一些实施方案中，该基序在位置4包含
‘
a’、
‘
s’、
‘
l’或
‘v’
而非
‘
t’，例如，lpxag、lpxsg、lpxlg或lpxvg，例如，lpnag或lpesg、lpelg或lpevg。在一些实施方案中，该基序在第5位置包含'a'而非'g'，例如，lpxta，例如，lpnta。在一些实施方案中，基序在第2位置包含
‘
g’或
‘
a’而非
‘
p’，例如，lgxtg或laxtg，例如，lgatg或laetg。在一些实施方案中，基序在第1位置包含
‘
i’或
‘
m’而非'l'，例如，mpxtg或ipxtg，例如，mpktg、ipktg、ipntg或ipetg。pishesha等人2018中描述了分选酶a的多样识别基序。
[0104]
在一些实施方案中，分选酶识别序列是lpxtg，其中x是标准氨基酸或非标准氨基酸。在一些实施方案中，x选自d、e、a、n、q、k或r。在一些实施方案中，识别序列选自lpxtg、lpxag、lpxsg、lpxlg、lpxvg、lgxtg、laxtg、lsxtg、npxtg、mpxtg、ipxtg、spxtg、vpxtg、ypxrg、lpxts和lpxta，其中x可以是任何氨基酸，如在某些实施方案中选自d、e、a、n、q、k或r的那些。
[0105]
在一些实施方案中，分选酶可以识别包含非天然氨基酸的基序，所述非天然氨基酸优选地位于从分选酶识别基序n末端至c末端的方向位置5处。非天然氨基酸是具有式ch2oh-(ch2)
n-cooh的取代或未取代的羟基羧酸，n是从0至5的整数，例如0、1、2、3、4和5，优选地n＝0。在一些实施方案中，非天然氨基酸是取代的羟基羧酸并且在一些其他实施方案中，羟基羧酸由一个或多个选自卤素、c
1-6
烷基、c
1-6
卤代烷基、羟基、c
1-6
烷氧基、和c
1-6
卤代烷氧基的取代基取代。术语“卤”或“卤素”意指氟、氯、溴或碘，并且优选是氟和氯。术语“烷基”本身或作为另一个取代基的部分，指式c
nh2n+1
的烃基原子团，其中n是大于或等于1的数字。在一些实施方案中，可用于本公开中的烷基包含1至6个碳原子、优选地1个至4个碳原子、更优选地1个至3个碳原子、仍然更优选地1至2个碳原子。烷基可以为直链或分枝并且可以如本文所示进一步取代。c
x-y
烷基指包含x至y个碳原子的烷基。合适的烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基、戊基及其异构体(例如正戊基、异戊基)和己基及其异构体(例如正己基、异己基)。优选的烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。术语“卤代烷基”单独或在组合下，指具有如上文所定义含义的烷基，其中一个或多个氢以如上所定义的卤素替换。这类卤代烷基原子团的非限制性示例包括氯甲基、1-溴乙基、氟代甲基、二氟甲基、三氟甲基、1,1,1-三氟乙基等。
[0106]
在一些实施方案中，包含非天然氨基酸的分选酶识别基序可以选自lpxt*y、lpxa*y、lpxs*y、lpxl*y、lpxv*y、lgxt*y、laxt*y、lsxt*y、npxt*y、mpxt*y、ipxt*y、spxt*y、vpxt*y和ypxr*y，其中*代表任选取代的羟基羧酸；并且x和y独立地代表任何氨基酸。在一些实施方案中，包含非天然氨基酸的分选酶识别基序可以选自lpxt*g、lpxa*g、lpxs*g、lpxl*g、lpxv*g、lgxt*g、laxt*g、lsxt*g、npxt*g、mpxt*g、ipxt*g、spxt*g、vpxt*g、ypxr*g、lpxt*s和lpxt*a，优选地m是lpet*g，同时*优选地是2-羟基乙酸。
[0107]
在一些实施方案中，本公开构思使用天然存在的分选酶的变体。在一些实施方案中，该变体能够介导甘氨酸
(n)
缀合和/或赖氨酸侧链ε-氨基缀合，优选地在红细胞的至少一种内源性、非工程化膜蛋白的胞外结构域内部位点处介导，优选地n为1或2。可以通过诸如定向进化、位点特异性修饰等过程产生这类变体。可获得关于分选酶(例如，分选酶a酶)的大量结构信息，包括单独或与分选酶识别序列结合的srta的nmr或晶体结构(参见，例如，zong y等人.j.biol chem.2004,279,31383-31389)。已经鉴定金黄色葡萄球菌srta的活性部位和底物结合袋。本领域普通技术人员可以例如通过采用避开会破坏或大幅度改动分选酶活性部位或底物结合袋的缺失或置换，产生功能性变体。在一些实施方案中，可以通过利
用chen等人,sci.rep.2016,6(1),31899中描述的基于fret(荧光共振能量转移)的选择测定法对srta实施定向进化。在一些实施方案中，金黄色葡萄球菌srta的功能性变体可以是在cn106191015a和cn109797194a中描述的那些。在一些实施方案中，金黄色葡萄球菌srta变体可以是从n末端移除例如25-60个(例如，30、35、40、45、50、55、59或60个)氨基酸的截短变体。
[0108]
在一些实施方案中，可用于本公开中的金黄色葡萄球菌srta的功能性变体可以是在氨基酸位置d124、y187、e189和f200上包含一个或多个突变(d124g、y187l、e189r和f200l)并且任选地还包含p94s/r、d160n、d165a、k190e和k196t中一个或多个突变的金黄色葡萄球菌srta变体。在某些实施方案中，金黄色葡萄球菌srta变体可以包含d124g；d124g和f200l；p94s/r、d124g、d160n、d165a、k190e和k196t；p94s/r、d160n、d165a、y187l、e189r、k190e和k196t；p94s/r、d124g、d160n、d165a、y187l、e189r、k190e和k196t；d124g、y187l、e189r和f200l；或p94s/r、d124g、d160n、d165a、y187l、e189r、k190e、k196t和f200l。在一些实施方案中，金黄色葡萄球菌srta变体在n末端移除59或60个(例如，25、30、35、40、45、50、55、59或60个)氨基酸。在一些实施方案中，上文突变的氨基酸位置根据例如如seq id no:1中所示的野生型金黄色葡萄球菌srta的编号法编号。在一些实施方案中，野生型金黄色葡萄球菌srta的全长核苷酸序列显示在例如seq id no:2中。seq id no:1(全长，genbank登录号.：caa3829591.1)1mkkwtnrlmt iagvvlilva aylfskphid nylhdkdkde kieqydknvk51eqaskdkkqq akpqipkdks kvagyieipd adikepvypg patpeqlnrg101vsfaeenesl ddqnisiagh tfidrpnyqf tnlkaakkgs mvyfkvgnet151rkykmtsird vkptdvgvld eqkgkdkqlt litcddynek tgvwekrkif201vatevkseq id no:2(全长，野生型)atgaaaaaatggacaaatcgattaatgacaatcgctggtgtggtacttatcctagtggcagcatatttgtttgctaaaccacatatcgataattatcttcacgataaagataaagatgaaaagattgaacaatatgataaaaatgtaaaagaacaggcgagtaaagataaaaagcagcaagctaaacctcaaattccgaaagataaatcgaaagtggcaggctatattgaaattccagatgctgatattaaagaaccagtatatccaggaccagcaacacctgaacaattaaatagaggtgtaagctttgcagaagaaaatgaatcactagatgatcaaaatatttcaattgcaggacacactttcattgaccgtccgaactatcaatttacaaatcttaaagcagccaaaaaaggtagtatggtgtactttaaagttggtaatgaaacacgtaagtataaaatgacaagtataagagatgttaagcctacagatgtaggagttctagatgaacaaaaaggtaaagataaacaattaacattaattacttgtgatgattacaatgaaaagacaggcgtttgggaaaaacgtaaaatctttgtagctacagaagtcaaa
[0109]
在一些实施方案中，如与野生型金黄色葡萄球菌srta相比，金黄色葡萄球菌srta变体可以在一个或多个与seq id no:1的94、105、108、124、160、165、187、189、190、196和200对应的位置包含一个或多个突变。在一些实施方案中，如与野生型金黄色葡萄球菌srta
相比，金黄色葡萄球菌srta变体可以包含一个或多个与p94s/r、e105k、e108a、d124g、d160n、d165a、y187l、e189r、k190e、k196t和f200l对应的突变。在一些实施方案中，如与野生型金黄色葡萄球菌srta相比，金黄色葡萄球菌srta变体可以包含一个或多个与d124g、y187l、e189r和f200l对应的突变并且任选地还包含一个或多个与p94s/r、d160n、d165a、k190e和k196t对应的突变以及进一步任选地包含一个或多个与e105k和e108a对应的突变。在某些实施方案中，如与野生型金黄色葡萄球菌srta相比，金黄色葡萄球菌srta变体可以包含与d124g；d124g和f200l；p94s/r、d124g、d160n、d165a、k190e和k196t；p94s/r、d160n、d165a、y187l、e189r、k190e和k196t；p94s/r、d124g、d160n、d165a、y187l、e189r、k190e和k196t；d124g、y187l、e189r和f200l；或p94s/r、d124g、d160n、d165a、y187l、e189r、k190e、k196t和f200l对应的突变。在一些实施方案中，金黄色葡萄球菌srta变体可以相对于seq id no:1包含以下一个或多个突变：p94s/r、e105k、e108a、d124g、d160n、d165a、y187l、e189r、k190e、k196t和f200l。在一些实施方案中，相对于seq id no:1，金黄色葡萄球菌srta变体可以包含d124g、y187l、e189r和f200l并且任选地还包含以下一个或多个突变：p94s/r、d160n、d165a、k190e和k196t以及任选地还包含e105k和/或e108a。在某些实施方案中，金黄色葡萄球菌srta变体可以相对于seq id no:1包含d124g；d124g和f200l；p94s/r、d124g、d160n、d165a、k190e和k196t；p94s/r、d160n、d165a、y187l、e189r、k190e和k196t；p94s/r、d124g、d160n、d165a、y187l、e189r、k190e和k196t；d124g、y187l、e189r和f200l；或p94s/r、d124g、d160n、d165a、y187l、e189r、k190e、k196t和f200l。在一些实施方案中，突变e105k和/或e108a/q允许分选酶介导的反应不依赖ca
2+
。在一些实施方案中，如本文所述的金黄色葡萄球菌srta变体可以让25-60个(例如，25、30、35、40、45、50、55、56、57、58、59、或60个)氨基酸从n末端移除。在一些实施方案中，上文突变的氨基酸位置例如根据如seq id no:1中所示的全长野生型金黄色葡萄球菌srta的编号法编号。
[0110]
在一些实施方案中，可用于本公开中的金黄色葡萄球菌srta的功能性变体可以是包含以下一个或多个突变的金黄色葡萄球菌srta变体：p94s/r、e105k、e108a/q、d124g、d160n、d165a、y187l、e189r、k190e、k196t和f200l。在某些实施方案中，金黄色葡萄球菌srta变体可以包含p94s/r、e105k、e108q、d124g、d160n、d165a、y187l、e189r、k190e、k196t和f200l；或p94s/r、e105k、e108a、d124g、d160n、d165a、y187l、e189r、k190e、k196t和f200l。在一些实施方案中，金黄色葡萄球菌srta变体可以相对于seq id no:1包含以下一个或多个突变：p94s/r、e105k、e108a/q、d124g、d160n、d165a、y187l、e189r、k190e、k196t和f200l。在某些实施方案中，金黄色葡萄球菌srta变体可以相对于seq id no:1包含p94s/r、e105k、e108q、d124g、d160n、d165a、y187l、e189r、k190e、k196t和f200l；或相对于seq id no:1包含p94s/r、e105k、e108a、d124g、d160n、d165a、y187l、e189r、k190e、k196t和f200l。在一些实施方案中，金黄色葡萄球菌srta变体从n末端移除25-60个(例如，25、30、35、40、45、50、55、56、57、58、59、或60个)氨基酸。在一些实施方案中，上文突变的氨基酸位置根据例如如seq id no:1中所示的野生型金黄色葡萄球菌srta的编号法编号。
[0111]
在一些实施方案中，本公开构思金黄色葡萄球菌srta变体(mg srta)包含与如seq id no:3中所述的氨基酸序列具有至少60％(例如，至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或更高)同一性的氨基酸序列或基本上由其组成或由其组成。在一些实施方案中，seq id no:3是截短的srta并且
与野生型srta对应的突变在下文以粗体和下划线显示。在一些实施方案中，srta变体包含与如seq id no:3中所述的氨基酸序列具有至少60％(例如，至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或更高)同一性的氨基酸序列或基本上由其组成或由其组成；并且包含突变p94r/s、d124g、d160n、d165a、y187l、e189r、k190e、k196t和f200l和任选地e105k和/或e108a/q(根据seq id no:1的编号法编号)。seq id no:3(突变以粗体和加下划线显示)
[0112]
在一些实施方案中，本公开提供编码金黄色葡萄球菌srta变体的核酸，并且在一些实施方案中核酸按seq id no:4中所述。seq id no:4aaaccacatatcgataattatcttcacgataaagataaagatgaaaagattgaacaatatgataaaaatgtaaaagaacaggcgagtaaagataaaaagcagcaagctaaacctcaaattccgaaagataaatcgaaagtggcaggctatattgaaattccagatgctgatattaaagaaccagtatatccaggaccagcaacacgtgaacaattaaatagaggtgtaagctttgcagaagaaaatgaatcactagatgatcaaaatatttcaattgcaggacacactttcattggccgtccgaactatcaatttacaaatcttaaagcagccaaaaaaggtagtatggtgtactttaaagttggtaatgaaacacgtaagtataaaatgacaagtataagaaatgttaagcctacagctgtaggagttctagatgaacaaaaaggtaaagataaacaattaacattaattacttgtgatgatcttaatcgggagacaggcgtttgggaaacacgtaaaatcttggtagctacagaagtcaaa
[0113]
在一些实施方案中，分选酶a变体可以包含以下任一者或多者：位置94处的s残基(s94)或位置94处的r残基(r94)、位置105处的k残基(k105)、位置108处的a残基(a108)或位置108处的q残基(q108)、位置124处的g残基(g124)、位置160处的n残基(n160)、位置165处的a残基(a165)、位置189处的r残基(r189)、位置190处的e残基(e190)、位置196处的t残基(t196)和位置200处的l残基(l200)(根据野生型srta(例如，seq id no:1)的编号法编号)，任选地约25-60个(例如，25、30、35、40、45、50、55、56、57、58、59或60个)氨基酸从野生型金黄色葡萄球菌srta的n末端移除。例如，在一些实施方案中，分选酶a变体相对于野生型金黄色葡萄球菌srta(例如，seq id no:1)包含两个、三个、四个或五个前文提到的突变。在一些实施方案中，分选酶a变体相对于野生型金黄色葡萄球菌srta(例如，seq id no:1)包含位置94处的s残基(s94)或位置94处的r残基(r94)，并且还包含位置160处的n残基(n160)、位置165处的a残基(a165)和位置196处的t残基(t196)。例如，在一些实施方案中，分选酶a变体相对于野生型金黄色葡萄球菌srta(例如，seq id no:1)包含p94s或p94r，并且还包含d160n、d165a和k196t。在一些实施方案中，分选酶a变体相对于野生型金黄色葡萄球菌srta(例如，seq id no:1)包含位置94处的s残基(s94)或位置94处的r残基(r94)，并且还包含位置160处的n残基(n160)、位置165处的a残基(a165)、位置190处的e残基和位置196处的t残
基。例如，在一些实施方案中，分选酶a变体相对于野生型金黄色葡萄球菌srta(例如，seq id no:1)包含p94s或p94r，并且还包含d160n、d165a、k190e和k196t。在一些实施方案中，分选酶a变体相对于野生型金黄色葡萄球菌srta(例如，seq id no:1)包含位置94处的r残基(r94)、位置160处的n残基(n160)、位置165处的a残基(a165)、位置190处的e残基和位置196处的t残基。在一些实施方案中，分选酶相对于野生型金黄色葡萄球菌srta(例如，seq id no:1)包含p94r、d160n、d165a、k190e和k196t。在一些实施方案中，金黄色葡萄球菌srta变体可以从n末端移除25-60个(例如，25、30、35、40、45、50、55、56、57、58、59、或60个)氨基酸。
[0114]
在一些实施方案中，可以使用比天然存在分选酶a具有更高转酰胺基酶活性的分选酶a变体。在一些实施方案中，分选酶a变体的活性是野生型金黄色葡萄球菌分选酶a的活性的至少约10、15、20、40、60、80、100、120、140、160、180或200倍。在一些实施方案中，这种分选酶变体用于本公开的组合物或方法中。在一些实施方案中，分选酶变体相对于野生型金黄色葡萄球菌srta包含以下置换中任一者或多者：p94s/r、e105k、e108a、e108q、d124g、d160n、d165a、y187l、e189r、k190e、k196t和f200l突变。在一些实施方案中，srta变体可以从n末端移除25-60个(例如，30、35、40、45、50、55、59或60个)氨基酸。
[0115]
在一些实施方案中，通过比对亲本金黄色葡萄球菌srta(从中衍生如本文所述的金黄色葡萄球菌srta变体)与seq id no:1的多肽，确定氨基酸突变位置，即，seq id no:1的多肽用来确定亲本金黄色葡萄球菌srta中的相应氨基酸序列。本领域熟知用于确定与如本文所述的突变位置对应的氨基酸位置的方法。可以通过使用如emboss软件包(emboss:the european molecular biology open software suite(emboss:欧洲分子生物学开放软件包)，rice等人,2000,trends genet.16:276-277)的needle程序，优选地3.0.0版或更新版本中所执行的needleman-wunsch算法(needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.48:443-453)确认对另一种多肽中相应氨基酸残基的鉴定。基于以上的熟知计算机程序，确定如本文所述目的多肽的氨基酸位置是本领域技术人员的例行工作。
[0116]
在一些实施方案中，分选酶变体可以进一步包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个保守的氨基酸突变。本领域熟知将基本上不影响蛋白质活性的保守氨基酸突变。
[0117]
在一些实施方案中，本公开提供一种鉴定分选酶变体候选物以使试剂与红细胞的至少一种内源性、非工程化膜蛋白缀合的方法，所述方法包括将红细胞(rbc)与包含分选酶识别基序的分选酶底物和试剂在分选酶变体候选物存在下，在适于该分选酶变体候选物通过分选酶介导的反应、优选地通过分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合，使分选酶底物缀合于至少一种内源性、非工程化rbc膜蛋白的条件下接触。在一些实施方案中，分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合至少发生在至少一种内源性、非工程化膜蛋白的胞外结构域内部位点处的甘氨酸(n)和/或赖氨酸ε-氨基上，优选地n为1或2。在一些实施方案中，该方法还包括选择能够使试剂与红细胞的至少一种内源性、非工程化膜蛋白缀合的分选酶变体。
[0118]
在一些实施方案中，本公开构思施用分选酶和分选酶底物至受试者以在体内使分选酶底物缀合于红细胞。为此目的，合乎需要的是使用已经过进一步修饰以提高其在循环下的稳定作用和/或降低其免疫原性的分选酶。本领域熟知稳定化循环中的酶并且降低酶免疫原性的方法。例如，在一些实施方案中，分选酶已经聚乙二醇化和/或在将基本上不影
响分选酶活性的位置与fc片段连接。不可逆性接头
[0119]
由于srta介导的蛋白质-细胞缀合过程是可逆反应，为了改进细胞标记效率，最大限度减少逆反应出现将有益。一个增加产物产率的解决方案是升高反应底物的浓度，但在实际应用中可能难以实现大分子蛋白质的极高浓度；并且即使可以达到高浓度，但高成本可能限制这项技术的使用。另一个解决方案是从反应体系连续取出产物，从而反应将不因平衡而停止，但是由于在细胞上实施反应，产物分离可能困难。本技术的发明人惊讶地发现，对于细胞标记，可以通过引入不作为逆反应底物的羟乙酰基样副产物阻止逆反应，因此使得标记反应不可逆。
[0120]
为了获得羟乙酰基样副产物，本公开构思使用一种包含非天然氨基酸的分选酶识别基序，所述非天然氨基酸优选地位于从分选酶识别基序n末端至c末端的方向位置5处。在一些实施方案中，非天然氨基酸是具有式ch2oh-(ch2)
n-cooh的取代或未取代的羟基羧酸，n是从0至5的整数，例如0、1、2、3、4和5，优选地n＝0。在一些实施方案中，包含非天然氨基酸的分选酶识别基序可以选自lpxt*y、lpxa*y、lpxs*y、lpxl*y、lpxv*y、lgxt*y、laxt*y、lsxt*y、npxt*y、mpxt*y、ipxt*y、spxt*y、vpxt*y和ypxr*y，其中*代表任选取代的羟基羧酸；并且x和y独立地代表任何氨基酸。在一些实施方案中，包含非天然氨基酸的分选酶识别基序可以选自lpxt*g、lpxa*g、lpxs*g、lpxl*g、lpxv*g、lgxt*g、laxt*g、lsxt*g、npxt*g、mpxt*g、ipxt*g、spxt*g、vpxt*g、ypxr*g、lpxt*s和lpxt*a，优选地m是lpet*g，同时*优选地是2-羟基乙酸。在一些实施方案中，使用leu-pro-glu-thr-2-羟基乙酸-gly(lpet-(2-羟基乙酸)-g)作为确保副产物将使反应不可逆的接头。
[0121]
为了向试剂引入不可逆性接头，在一些实施方案中，包含非天然氨基酸作为接头的分选酶识别基序经化学合成并且可以与试剂如蛋白质或多肽直接缀合。
[0122]
在一些实施方案中，包含非天然氨基酸的分选酶识别基序可以通过产生预期分选酶底物的多种化学手段与试剂缀合。这些方法可以包括采用双官能交联剂(如，例如，nhs酯-马来酰亚胺异双官能交联剂)的化学缀合以连接还原型硫醇基和伯胺基。其他分子融合物可以在分选酶识别基序和试剂之间形成，例如借助间隔子形成。
[0123]
可以用于本公开中的多种化学缀合手段，双官能交联剂或间隔子包括但不限于：(1)零-长度类型(例如，edc；edc加磺基nhs；cmc；dcc；dic；n,n'-羰基二咪唑；woodward试剂k)；(2)胺-硫氢基类型如nhs酯-马来酰亚胺异双官能交联剂(例如，马来酰亚胺碳酸(c
2-8
)(例如，6-马来酰亚胺己酸和4-马来酰亚胺丁酸)；emcs；spdp、lc-spdp、磺基-lc-spdp；smpt和磺基-lc-smpt；smcc、lc-smcc和磺基-smcc；mbs和磺基-mbs；siab和磺基-siab；smpb和磺基-smpb；gmbs和磺基-gmbs；siax和siaxx；siac和siacx；npia)；(3)同双官能nhs酯类型(例如，dsp；dtssp；dss；dst和磺基-dst；bsocoes和磺基-bsocoes；egs和磺基-egs)；(4)同双官能酰亚胺酯类型(例如，dma；dmp；dms；dtbp)；(5)羰基-硫氢基类型(例如，kmuh；emch；mpbh；m2c2h；pdph)；(6)硫氢基反应性类型(例如，dpdpb；bmh；hbvs)；(7)硫氢基-羟基类型(例如，pmpi)等。
[0124]
在一些实施方案中，胺-硫氢基类型或nhs酯-马来酰亚胺异双官能交联剂是特别优选的间隔子，所述特别优选的间隔子可以在本文用来缀合尿酸降解肽至如本文中所述的包含非天然氨基酸的分选酶识别基序。在某些实施方案中，nhs酯-马来酰亚胺异双官能交
联剂如6-马来酰亚胺己酸和4-马来酰亚胺丁酸是特别可用于构建预期分选酶底物的间隔子。nhs酯-马来酰亚胺异双官能交联剂如6-马来酰亚胺己酸和4-马来酰亚胺丁酸可能与暴露的硫氢基发生麦克尔加成反应，例如，在暴露的半胱氨酸上发生，但这种反应将不与未暴露的半胱氨酸发生。在一个实施方案中，在本公开的不可逆性接头中引入6-马来酰亚胺己酸，以获得如图3中所示的6-马来酰亚胺己酸-leu-pro-glu-thr-2-羟基乙酸-gly。在一些实施方案中，半胱氨酸残基是或已经添加至试剂c端以提供暴露的半胱氨酸。
[0125]
在一些实施方案中，间隔子可以额外包括用来维持酶离分选酶结合位点足够距离的纯化标签(用于表达后纯化)或接头，鉴于空间效应，这可能有利。示例性接头包括但不限于，多甘氨酸多丝氨酸接头(例如，(gs)3、ggggsgggg、ggggsggggs)和其他示例性接头如pststst和eidkpsq。
[0126]
通过使用如本文所述的间隔子，尤其nhs酯-马来酰亚胺异双官能交联剂如6-马来酰亚胺己酸和4-马来酰亚胺丁酸，发明人成功地设计了具有不同结构(包括双头叉、三头叉和多头叉)的接头。这些不同的接头可以用来根据实际需求标记rbc，例如以获得多模态治疗药。在一些实施方案的多头叉结构设计中，一个或多个间隔子可以与n端氨基酸的氨基和/或赖氨酸侧链的氨基连接并且相同或不同的试剂如蛋白质或多肽可以与一个或多个间隔子连接，如图5中所示。这项技术可能进一步扩展标记细胞的试剂(如蛋白质)的种类并且改进rbc工程化的效率。
[0127]
上文描述的间隔子也可以用来将目的试剂与无如本文上述非天然氨基酸的分选酶识别基序缀合。分选酶底物
[0128]
可能轻易地设计适于分选酶介导的缀合过程的底物。分选酶底物可以包含分选酶识别基序和试剂。例如，试剂如多肽可以经修饰以在其c末端或其附近包含分选酶识别基序，因而允许它们充当分选酶的底物。该分选酶识别基序无需正好位于底物的c末端处，但一般应当是酶充分可及的，以参与分选酶反应。在一些实施方案中，如果在分选酶识别基序中最n末端氨基酸(例如，l)与多肽的c端氨基酸之间存在不多于5、6、7、8、9、10个氨基酸，则认定分选酶识别基序“靠近”c末端。可以通过并入或接合广泛种类部分(例如，肽、蛋白质、化合物、核酸、脂质、小分子和糖)中任一者，修饰包含分选酶识别基序的多肽。
[0129]
在一些实施方案中，本公开提供分选酶底物包含结构物(a
1-sp)
m-m，其中a1代表试剂，sp代表任选的间隔子，m为大于或等于1的整数，优选地m＝1至3；并且m代表分选酶识别基序或包含如本文中所述非天然氨基酸的分选酶识别基序。
[0130]
在一些实施方案中，sp选自由以下类型交联剂组成的群组：(1)零长度类型；(2)胺-硫氢基类型；(3)同双官能nhs酯类型；(4)同双官能酰亚胺酯类型；(5)羰基-硫氢基类型；(6)硫氢基反应性类型；和(7)硫氢基-羟基类型；优选地一个或多个sp是nhs酯-马来酰亚胺异双官能交联剂如6-马来酰亚胺己酸和4-马来酰亚胺丁酸并且试剂包含暴露的硫氢基，优选地暴露的半胱氨酸，更优选地末端半胱氨酸，最优选地c末端半胱氨酸。在一些实施方案中，当存在两个或更多个间隔子时，与间隔子连接的试剂可以相同或不同。试剂
[0131]
在一些实施方案中，试剂包含尿酸降解多肽或尿酸降解多肽和尿酸转运蛋白的组合。
fastidiosus)和蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus))的细菌；铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、产黄纤维单胞菌(cellumonas flavigena)或大肠杆菌(e.coli)。
[0140]
在一些实施方案中，尿酸酶或尿酸酶变体衍生自哺乳动物，例如猪、牛、羊、山羊、狒狒、恒河猴(猕猴(macaca mulatto))、小鼠(例如，小家鼠(mus musculus))、兔、斑马鱼(印度斑马鱼(danio rerio))或家养动物。
[0141]
在一些实施方案中，尿酸酶包含如下文所述的seq id no:27的氨基酸序列：msavkaarygkdnvrvykvhkdektgvqtvyemtvcvllegeietsytkadnsvivatdsikntiyitakqnpvtppelfgsilgthfiekynhihaahvnivchrwtrmdidgkphphsfirdseekrnvqvdvvegkgidiksslsgltvlkstnsqfwgflrdeyttlketwdrilstdvdatwqwknfsglqevrshvpkfdatwatarevtlktfaednsasvqatmykmaeqilarqqlietveyslpnkhyfeidlswhkglqntgknaevfapqsdpnglikctvgrsslksklaa
[0142]
在一些实施方案中，尿酸酶包括与seq id no:27的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的尿酸酶变体。在一些实施方案中，尿酸酶变体拥有从中衍生该变体的尿酸酶的功能(例如，催化尿酸(尿酸盐)氧化成5-羟异尿酸的能力)。
[0143]
在一些实施方案中，尿酸酶包含野生型尿酸酶的片段。在一些实施方案中，尿酸酶片段包含seq id no:27或其变体的至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150或至少160个氨基酸残基(例如，连续氨基酸残基)。在一些实施方案中，如与从中衍生尿酸酶片段或变体的尿酸酶相比，尿酸酶片段或变体保留至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的功能(例如，催化尿酸(尿酸盐)氧化成5-羟异尿酸的能力)。
[0144]
如本文所用，术语“尿酸转运蛋白”指能够调节尿酸转运并因而调节血浆尿酸水平的多肽。
[0145]
在一些实施方案中，与本公开中提供的rbc连接的试剂额外地包含尿酸转运蛋白或其变体。在一些实施方案中，试剂额外地包含至少一种(例如，一、二、三、四或更多种)包含尿酸转运蛋白的多肽。
[0146]
在另一个方面，本公开提供具有尿酸降解多肽(例如，尿酸酶)或其变体或片段和尿酸转运蛋白或其变体或片段的组合与之连接的红细胞(rbc)。不希望受任何具体理论约束，具有尿酸降解多肽和尿酸转运蛋白二者与之连接的brc可以通过促进尿酸从尿酸转运蛋白转移至尿酸降解多肽改进尿酸周转(例如，尿酸的催化)。
[0147]
在一些实施方案中，尿酸转运蛋白选自urat1(也称作尿酸转运蛋白1；slc22a12；溶质载体家族22成员12)、glut9(也称作slc2a9；溶质载体家族2成员9)、oat4(也称作有机阴离子转运蛋白4；slc22a9；溶质载体家族22成员11)、oat1(也称作有机阴离子转运蛋白1；slc22a6；溶质载体家族22成员6)、oat3(也称作有机阴离子转运蛋白3；slc22a8；溶质载体家族22成员8)、gal-9(也称作半乳糖凝集素-9；uat；结合半乳糖苷的可溶性凝集素9)、abcg2(也称作atp结合盒亚家族g成员2)、slc34a2(也称作钠依赖性磷酸转运蛋白1；溶质载体家族34成员2)、mrp4(也称作多药耐药性相关蛋白4；abcc4)、oat2、npt1(也称作na(+)/pi
协同转运蛋白1、溶质载体家族17成员1、slc17a1和napi-l)、npt4(也称作na(+)/pi协同转运蛋白4、溶质载体家族17成员3、slc17a3和gout4)和mct9(也称作单羧酸转运蛋白9、溶质载体家族16成员9、slc16a9)。在一些实施方案中，尿酸转运蛋白是人尿酸转运蛋白。
[0148]
在一些实施方案中，尿酸转运蛋白包含一种包含下文seq id no:28所述氨基酸序列的urat1：masdvgggrvtmamvsmwctsmnsaavshrcwadnstaasgssaasgnrhcrrrwdnatatswsadtcvdgwvydrststvakwnvcdshakmasyagvgaaacgasdrwasarwttgrdwgwrvaangkgavdttvsamrsmgasgtrmgrrtcstcwagtgadagsnmgvvdakmgashgrrtaasagcantvhmgarsaavgggvgaatytysstvrmtavggmaarggagvrgvhgwvygtvvsgaatsdtdvnavkkathgtgnsvkst
[0149]
在一些实施方案中，尿酸转运蛋白包括与seq id no:28的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的urat1变体。在一些实施方案中，尿酸转运蛋白变体拥有从中衍生该变体的野生型尿酸转运蛋白的功能(例如，输入尿酸的能力)。
[0150]
在一些实施方案中，尿酸转运蛋白包含urat1、glut9、oat4、oat1、oat3、gal-9、abcg2、slc34a2、mrp4、oat2、npt1、npt4或mct9的片段。在一些实施方案中，尿酸转运蛋白片段包含seq id no:28或其变体的至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150或至少160个氨基酸残基(例如，连续氨基酸残基)。在一些实施方案中，如与从中衍生它们的尿酸转运蛋白相比，尿酸转运蛋白片段或变体保留至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的功能(例如，输入尿酸的能力)。用于共价修饰rbc的内源性、非工程化膜蛋白的方法
[0151]
在一个方面本公开提供一种共价修饰红细胞的至少一种内源性、非工程化膜蛋白的方法，所述方法包括将rbc与包含分选酶识别基序的分选酶底物和如本文所述的试剂在分选酶存在下，在适于该分选酶通过分选酶介导的反应、优选地通过分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链缀合，使分选酶底物缀合于至少一种内源性、非工程化rbc膜蛋白的条件下接触。在一些实施方案中，分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合至少发生在至少一种内源性、非工程化膜蛋白的胞外结构域中(例如胞外结构域内部位点)的甘氨酸
(n)
和/或赖氨酸ε-氨基上，优选地n为1或2。在一些实施方案中，不受理论限制，分选酶介导的甘氨酸缀合还可以发生在先前未报道过的因红细胞生成期间组织特异性mrna剪接和蛋白质翻译膜蛋白中而暴露的甘氨酸
(n＝1或2)
处。在一些实施方案中，分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合发生在胞外结构域的末端赖氨酸或内部赖氨酸的ε-氨基处。
[0152]
将理解，普通技术人员能够根据分选酶底物性质、分选酶类型等选择适于分选酶使分选酶底物缀合于至少一种内源性、非工程化膜蛋白的条件(例如，最佳温度、ph)。用途
[0153]
在一些方面，本公开提供一种用于有需求的受试者中治疗或预防与升高的尿酸水平相关的病症、病状或疾病的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所述的红细胞或组合物。
[0154]
如本文所用，术语“升高的尿酸水平”指受试者血清中可能导致不利结果或将由临
床医务人员认定为升高的任何尿酸水平。在一个实施方案中，升高的尿酸水平指由临床医务人员认定高于正常的尿酸水平。在一个实施方案中，受试者可以具有》5mg/dl、》6mg/dl、》7mg/dl或8mg/dl的血清尿酸水平。
[0155]
与升高的尿酸水平相关的病症、病状或疾病可以包括高尿酸血症、痛风(例如，慢性顽固性痛风、痛风结节和痛风性关节炎)、代谢综合征、肿瘤溶解综合征、lesch-nyhan综合征、心血管疾病、糖尿病、高血压、肾脏疾病或尿酸肾石病。这类病症可以用具有尿酸降解多肽或尿酸降解多肽和尿酸转运蛋白多肽的组合与之连接的红细胞治疗。
[0156]
如本文所用，术语“高尿酸血症”指一般与升高的水平尿酸相关的疾病或病症。如本文所用，术语“痛风”通常指与尿酸积累(如组织和关节中尿酸晶体沉积和/或有临床意义的血清尿酸水平升高)相关的疾病或条件。
[0157]
在一些实施方案中，本公开提供供一种用于有需求的受试者中降低升高的尿酸水平的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所述的红细胞或组合物。在一些实施方案中，接受治疗的受试者中尿酸水平降低达至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％，或降至正常水平。
[0158]
如本文所用，“处理”、“治疗”或“处置”指至少部分减轻、消除或减少病原体相关疾病、病症或病状在已经开始形成后的症状或病态体征的治疗性干预。治疗无需绝对有益于受试者。可以使用普通技术人员已知的任何方法或标准确定有益作用。
[0159]
如本文所用，“预防”、“防止”或“阻止”指行动过程，所述行动过程在遭病原体或其分子组分感染或与其接触之前和/或在疾病、病症或病状的症状或病态体征发作之前启动，从而防止感染和/或减少症状或病态体征。应当理解这类预防无需绝对有益于受试者。“预防性”治疗是一种治疗，其中向未显示疾病、病症或病状的体征或仅显示早期体征的受试者施用所述治疗，旨在降低形成疾病、病症或病状的症状或病态体征的风险。
[0160]
在一些实施方案中，如本文所述的方法还包括通过注射或输注施用缀合红细胞至受试者，例如，直接进入循环系统，例如，静脉内。
[0161]
在一些实施方案中，受试者在一个疗程内接受单剂细胞，或接受多剂细胞，例如，2和5之间、10、20剂或更多剂。在一些实施方案中，剂量或总细胞数目可以表述为细胞/kg。例如，一个剂量可以是约103、104、105、106、107、108个细胞/kg。在一些实施方案中，一个疗程持续约1周至12个月或更多时间，例如，1、2、3或4周或2个、3个、4个、5个或6个月。在一些实施方案中，可以约每2-4周治疗受试者。本领域普通技术人员将理解可以基于多种因素如受试者体重和/或血液容积、正在接受治疗的病状、受试者响应等选择细胞数目、剂量和/或给药间隔。所要求的确切细胞数目可以在受试者之间变动，这取决于多种因素，如受试者的物种、年龄、重量、性别和总体状况、疾病或病症严重程度、具体细胞、与细胞缀合的试剂的身份和活性、施用模式、共存疗法等。组合物
[0162]
在另一个方面，本公开提供一种组合物，其包含如本文所述的红细胞和任选地生理可接受载体，如处于药物组合物、递送组合物或诊断性组合物或试剂盒形式。
[0163]
在一些实施方案中，该组合物可以包含多个红细胞。在一些实施方案中，该组合物中至少选定百分数的细胞受修饰，即，具有通过分选酶与之缀合的试剂。例如，在一些实施方案中，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或更多的细胞具有试剂与之缀合。在一些实施方案中，包括与不同试剂缀合的两种或更多种红细胞或红细胞群体。
[0164]
在一些实施方案中，组合物包含分选标记的血液红细胞，其中细胞用任何目的试剂分选标记。在一些实施方案中，组合物包含有效量的细胞，例如，多达约10
14
个细胞，例如，约10、102、103、104、105、5
×
105、106、5
×
106、107、5
×
107、108、5
×
108、109、5
×
109、10
10
、5
×
10
10
、10
11
、5
×
10
11
、10
12
、5
×
10
12
、10
13
、5
×
10
13
或10
14
个细胞。在一些实施方案中，细胞数目可以介于任何两个上述数字之间。
[0165]
如本文所用，术语“有效量”指足以实现目的生物学反应或效果(例如，减少疾病或病状的一种或多种症状或表现或调节免疫应答)的量。在一些实施方案中，施用至受试者的组合物包含多达约10
14
个细胞，例如，约103、104、105、106、107、108、109、10
10
、10
11
、10
12
、10
13
或10
14
个细胞，或任何居间数目或范围的细胞。
[0166]
在另一个方面，该方面的组合物可以包含分选酶和分选酶底物但是无红细胞。将在受试者中施用组合物至循环系统并且一旦在体内接触红细胞，则分选酶通过如本文所述的分选酶介导的反应使分选酶底物缀合于红细胞的至少一种内源性、非工程化膜蛋白。在这种形式的组合物，将不存在红细胞不相容性风险以及其他风险，如来自供体细胞的细菌污染或病毒污染。在一些实施方案中，已经进一步修饰分选酶以通过例如聚乙二醇化或与fc片段融合增强其在循环下的稳定作用和/或降低其免疫原性。
[0167]
如本文所用，术语“生理可接受载体”意指可能在全身性施用时安全使用的固态或液态填料、稀释剂或包囊化。取决于具体给药途径，可以使用本领域熟知的多种溶媒、稀释剂和辅料。这些材料可以选自包括以下的群组：糖、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、滑石、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、海藻酸、磷酸盐缓冲溶液、乳化剂、等渗盐水与盐如无机酸盐，包括盐酸盐、溴化物和硫酸盐、有机酸如乙酸酯、丙酸酯和丙二酸酯、水和无热原水。
[0168]
本领域技术人员将领会，也可以实施本文所述实施方案的其他变例，而不脱离本发明的范围。其他修饰因此是可能的。
[0169]
尽管已经按示例性形式以某种具体程度描述并说明本公开，应当指出已仅通过举例方式给出说明和附图。可以在结构和诸部分和步骤的组合与排列方面产生多种变化。因此，这类变化意在纳入本发明，本发明的范围由权利要求限定。
实施例
实施例1.mg srta介导的蛋白质-细胞缀合方法在大肠杆菌中表达和纯化重组蛋白
[0170]
将mg srta(seq id no:3/4)、wt srta(从n末端移除25个氨基酸的seq id no:1)和egfp-lpetg cdna(seq id no:35/36)克隆于pet载体中并在大肠杆菌bl21(de3)细胞中转化以表达蛋白质。将转化的细胞在37℃培养直至od
600
达到0.6-0.8并且随后添加500μm iptg在37℃持续4小时。此后，将细胞通过离心收获并且用预冷的裂解缓冲液(20mm tris-hcl，ph 7.8，100mm nacl)裂解。裂解物继续在冰上超声处理(5秒开，5秒关，60个循环，25％功率，branson sonifier 550ultrasonic cell disrupter)。在4℃按14,000g离心40分钟
后，用0.22μm滤器过滤全部上清液。将过滤的上清液加载到连接于设计色谱体系的histrap ff 1ml柱(ge healthcare)上。用含有20mm tris-hcl ph 7.8、100mm nacl和300mm咪唑的洗脱缓冲液洗脱蛋白质。全部洗脱级分均在12％sds-page凝胶上分析。
[0171]
egfp-leptg的氨基酸序列如下文seq id no:35中显示：mhhhhhhmvskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelykaalpetgg*
[0172]
egfp-leptg的核苷酸序列如下文seq id no:36中显示：atgcaccaccaccaccaccacatggttagtaaaggggaagaattatttaccggcgtggtgccgattctggttgaactggacggcgacgtgaacggccacaaattcagcgttagcggcgagggcgaaggtgacgcgacctacggcaagctgaccctgaaatttatctgcaccaccggcaagctgccggtgccgtggccgaccctggttaccaccctgacctacggtgttcagtgcttcagccgttatccggaccacatgaagcaacacgatttctttaaaagcgcgatgccggagggctacgtgcaggaacgtaccatcttctttaaggacgatggtaactataaaacccgtgcggaagtgaagttcgaaggcgacaccctggttaaccgtatcgagctgaagggtattgactttaaagaagatggcaacattctgggtcacaaactggagtacaactataacagccacaacgtgtatatcatggcggataagcagaaaaacggcattaaggttaacttcaaaatccgtcacaacattgaagacggtagcgtgcaactggcggatcactaccagcaaaacaccccgattggcgacggtccggttctgctgccggataaccactatctgagcacccaaagcgcgctgagcaaggacccgaacgagaaacgtgatcacatggtgctgctggaatttgttaccgcggcgggtatcaccctgggtatggacgaactgtataaggcggcgctgccggagaccggcggttaa
[0173]
wt srta介导或mg srta介导的膜蛋白酶促标记物
[0174]
反应按总体积200μl在37℃于pbs缓冲液中进行2小时，同时按10rpm的速度转动。wt srta或mg srta的浓度是20-40μm并且生物素-lpetg或gfp-lpetg底物在200-1000μm范围。在酶促反应之前，用pbs洗涤人或小鼠rbc两次。反应中rbc的浓度是1
×
106/ml至1
×
10
10
/ml。在反应后，将rbc洗涤三次并且与链霉亲和素-藻红蛋白(pe)在室温孵育10分钟，之后用beckman coulter cytoflex lx或merck amnis image stream markii分析。rbc膜蛋白富集
[0175]
将生物素标记的rbc重悬于pbs中并在冰上超声处理(10秒开，10秒关，3次循环，25％功率，sonics vcx150)通过在4℃，300
×
g离心15分钟移除完好细胞。通过冷冻和冻干，获得干燥的粉末，随后与50ml冰冷的0.1m碳酸钠(ph＝11)在4℃孵育1小时，同时按速度10rpm温和转动。通在4℃按125,000
×
g超速离心1小时，将膜级分沉淀下来并且随后用milli-q水按相同速度持续30分钟洗涤两次。随后将样品与2ml冰冷的80％的丙酮在-20℃孵育2小时用于沉淀蛋白质。在4℃通过130,000
×
g离心15分钟，收集膜蛋白。将膜蛋白样品重溶于1％sds中并通过使用12％sds-page的凝胶电泳分析。凝胶内消化
[0176]
将完整凝胶用考马斯蓝(h2o、0.1％w/v考马斯亮兰r250、40％v/v甲醇和10％v/v乙酸)在室温染色，伴以温和振摇过夜，随后用脱色液(水中40％v/v甲醇和10％v/v乙酸)脱色。凝胶在蒸馏水中于室温10分钟再水化三次，伴以温和搅拌。将蛋白质条带切下并且切小成大约1
×
1mm2小片，随后在25℃用25mm nh4hco3的10mm tcep还原30分钟、在25℃暗处用
25mm nh4hco3中的55mm iaa烷基化30分钟，并随后在37℃用浓度100单位/ml的rpngase f消化4小时，并且随后在37℃用浓度12.5ng/ml的胰蛋白酶消化过夜(第1次消化4小时和第2次消化12小时)。随后通过使用50％acn/2.5％fa从凝胶小片提取胰蛋白酶解肽三次并且在真空下干燥肽溶液。通过pierce c18离心柱(thermo fisher,usa)纯化干肽。质谱分析
[0177]
将biognosys-11irt肽(biognosys,schlieren,ch)按终浓度10％内标入肽样品，之后ms上样供rt校验。用配备经1.9μmc18装填的15cm
×
75μm id熔融二氧化硅柱的ultimate 3000nanolc-ms/ms系统(dionex lc-packings,thermo fisher scientific
tm
,san jose,usa)分离肽。在上样后，在经0.1％甲酸，2％acn中液态3μmc18aqua装填的20mm
×
75μm id截获柱中以6μl/分钟截获500ng肽。用60分钟3
–
28％线性lc梯度(缓冲液a：2％acn、0.1％甲酸(fisher scientific)；缓冲剂b：98％acn、0.1％甲酸)按流量300nl/分钟(总计108分钟上样对上样)分离肽。将洗脱肽按+1.8kv的电势离子化进入q-exactive hf质谱仪(thermo fisher scientific
tm
,san jose,usa)。使用3e6电荷的agc目标值和80毫秒的最大离子注入时间，在orbitrap按60,000的分离度(在m/z 200时)测量完整质量。将前20个肽信号(电荷状态高于2+和低于+6)提交至hcd池中ms/ms(1.6amu分离宽度，27％归一化碰撞能量)。使用1e5电荷的agc目标值和100毫秒的最大离子注入时间，在orbitrap按30,000的分离度(在m/z 200时)采集ms/ms谱。以重复计数1和排除时间30秒应用动态排除。使用maxquant(版本1.6.2.6)作为搜索引擎，以半胱氨酸(cys)脲甲基作为固定修饰并且甲硫氨酸(met)氧化作为可变修饰。可变修饰含有氧化(m)、脱酰胺化(nq)、gx808-g-n、gx808-g-任何位置、gx808-k-侧链(详见表1)。其他参数如默认那样进行。对2018年9月swissprot小鼠数据库搜索数据并用fdr≤1％进一步过滤数据。结果
[0178]
我们首先在rbc膜上表征了mg srta介导标记的效力。使用wt srta作为对照，因其识别蛋白质或肽的n末端处的三个甘氨酸。我们的结果显示》99％的小鼠或人天然rbc在体外通过mg srta被生物素标记。相反，未在用wt srta处理的小鼠或人rbc的表面上检出明显生物素信号，在无酶的模拟对照组亦如此(图1a和图1b)。蛋白质印迹分析也支持我们的流式细胞结果，该结果显示小鼠rbc的mg srta介导的生物素标记情况(图1c)。为了进一步验证这个结果，如[6]所述那样通过超速离心从mg srta标记组或模拟对照组富集小鼠天然rbc的膜蛋白(图1d)。如预期，在富集rbc膜蛋白后mg srta标记组中检出生物素信号明显增加[6](图1e)。为了体内评估这些表面修饰的rbc的寿命，我们接下来向野生型受者小鼠中输注生物素lpetg标记的小鼠rbc，所述rbc用荧光染料dir(1,1
′‑
双十八烷基-3,3,3
′
,3
′‑
四甲基吲哚三碳菁碘化物)标记。定期分析体内dir阳性和生物素阳性rbc的百分数。我们发现，借助mg srta生物素标记的rbc不仅显示与对照组相同的寿命，还在循环期间保持90％的生物素阳性(图1f、1g和图1h)。成像分析还显示细胞表面上令人信服的生物素信号和mg分选酶标记的rbc形态正常(图1i)。我们还用egfp-lpetg分选标记rbc并将它们输注入野生型小鼠。如预期，体内检出通过mg srta与egfp缀合的rbc，但是对于wt srta而言未检出，并且检出的rbc显示正常的细胞形态(图1j和图1k)。总之，我们的数据表明mg srta在体外和体内介导高效标记天然rbc表面上的肽和蛋白质。
[0179]
先前的研究已经证明结合特定抗原的rbc能够在数个动物疾病模型中诱导免疫耐
受[8]。体外生成的经ot-1肽(其为具有siinfekl序列的卵清蛋白(ova)表位)标记的小鼠rbc在自身免疫疾病小鼠模型中带有识别h-2k
b-siinfekl的转基因tcr的cd8+t细胞内诱导免疫耐受[8]。我们将纯化自ot1 tcr小鼠的cd8
+
cd45.1 t细胞过继转移至cd45.2受者小鼠中(图2a)。24小时后，将相同数目的借助mg srta经ot-1肽修饰或未其修饰的天然小鼠rbc注入受者小鼠。ot-1肽攻击后，与经未修饰rbc注射的小鼠相比，接受ot-1-rbc的受者小鼠中cd8
+
cd45.1t细胞的数目约较少7倍。值得注意地，与注射天然rbc的受者小鼠相比，接受ot-1-rbc的小鼠中pd1
+
cd8
+
cd45.1
+
t细胞的百分数多4倍。两个组中t细胞上cd44表达水平无变化，这与先前研究一致[8][9]。这些数据表明，mg srta修饰的携带ot-1肽的rbc可能诱导ot-1tcr t细胞耗竭，但对于各应用比先前策略更便利和更高效[8]。
[0180]
我们接下来意在鉴定充当mg分选酶介导反应的底物的rbc膜蛋白。通过质谱法(ms)分析借助mg srta做生物素标记的rbc；检测到一系列122种可能在甘氨酸(g)或赖氨酸(k)侧链上经生物素分子修饰的候选蛋白质(表1)。这些蛋白质中68蛋白质和54蛋白质分别在甘氨酸和赖氨酸侧链处受修饰(表2和3)。检测到已鉴定蛋白质中18种蛋白质有两种修饰(表4)。在鉴定的蛋白质总体当中，22种如表5中所示的蛋白质注释为膜蛋白。例如，钙敏受体(casr)是感测循环中钙浓度的g-蛋白偶联受体。先前研究已经鉴定casr作为rbc表面上调节红细胞稳态的膜蛋白存在[10]。有趣地，在g526和k527位置检测到生物素信号，两个位置均不接近于casr的n末端。另外，其余21种膜蛋白也无一者在n末端具有生物素修饰的甘氨酸。因此，我们已经鉴定到rbc表面上可能与生物素分子共价连接的膜蛋白，包括casr。
[0181]
表1中显示对rbc上生物素标记的膜蛋白的鉴定。从图1e富集的生物素标记或天然的rbc膜蛋白经历ms分析。将富集的rbc膜蛋白载入1d凝胶电泳以进行最后凝胶内消化，之后注入ms仪器。显示了maxquant软件上的构型，其是在n末端和任何位置的甘氨酸和赖氨酸上递增的分子量(808g/mol)，并且肽搜索以uniprot蛋白质数据库为基础。表1用maxquant(版本1.6.2.6)搜索到的可变修饰
[0182]
表2.一系列来自rbc在甘氨酸上经生物素-肽修饰的68种蛋白质候选物。
。
[0183]
表3一系列来自rbc在赖氨酸侧链上经生物素-肽修饰的54种蛋白质候选物。
[0184]
表4.一系列来自rbc在甘氨酸和赖氨酸侧链上经生物素-肽修饰的18种蛋白质候选物。
[0185]
表5中显示一系列来自rbc在甘氨酸和赖氨酸侧链上经生物素-肽修饰的22种膜蛋白质候选物表5.
实施例2.借助不可逆性接头的mg srta介导型蛋白质-细胞缀合方法大肠杆菌中表达和纯化重组蛋白
[0186]
将mg srta和egfp-cys cdna(seq id no:37/38)克隆于pet载体中并在大肠杆菌bl21(de3)细胞中转化以表达蛋白质。将转化的细胞在37℃培养直至od
600
达到0.6-0.8并且随后添加500μm iptg。将细胞与iptg一起在37℃培养4小时直到通过离心收获并且用预冷的裂解缓冲液(20mm tris-hcl，ph7.8，500mm nacl)裂解。裂解物在冰上超声处理(5秒开，5秒关，60个循环，25％功率，branson sonifier 550ultrasonic cell disrupter)。在4℃按14,000g离心40分钟后，用0.45μm滤器过滤全部上清液。将过滤的上清液加载到连接于设计色谱体系的histrap ff 1ml柱(ge healthcare)上。用含有20mm tris-hcl ph 7.8、500mm nacl和300mm咪唑的洗脱缓冲液洗脱蛋白质。全部洗脱级分均在sds-page凝胶上分析。
[0187]
egfp-cys的氨基酸序列如下文seq id no:37中显示：mhhhhhhmvskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelykc*
[0188]
egfp-cys的核苷酸序列如下文seq id no:38中显示：atgcaccaccaccaccaccacatggttagtaaaggggaagaattatttaccggcgtggtgccgattctg
gttgaactggacggcgacgtgaacggccacaaattcagcgttagcggcgagggcgaaggtgacgcgacctacggcaagctgaccctgaaatttatctgcaccaccggcaagctgccggtgccgtggccgaccctggttaccaccctgacctacggtgttcagtgcttcagccgttatccggaccacatgaagcaacacgatttctttaaaagcgcgatgccggagggctacgtgcaggaacgtaccatcttctttaaggacgatggtaactataaaacccgtgcggaagtgaagttcgaaggcgacaccctggttaaccgtatcgagctgaagggtattgactttaaagaagatggcaacattctgggtcacaaactggagtacaactataacagccacaacgtgtatatcatggcggataagcagaaaaacggcattaaggttaacttcaaaatccgtcacaacattgaagacggtagcgtgcaactggcggatcactaccagcaaaacaccccgattggcgacggtccggttctgctgccggataaccactatctgagcacccaaagcgcgctgagcaaggacccgaacgagaaacgtgatcacatggtgctgctggaatttgttaccgcggcgggtatcaccctgggtatggacgaactgtataagtgttaa不可逆性接头通过半胱氨酸偶联与蛋白质缀合
[0189]
按超过99％纯度合成不可逆性接头6-马来酰亚胺己酸-leu-pro-glu-thr-2-羟基乙酸-gly(6-马来酰亚胺己酸-lpet-(2-羟基乙酸)-g、6-mal-lpet*g)。反应按总体积1ml在室温于pbs缓冲液中进行1小时，同时按10rpm的速度转动。6-mal-lpet*g和egfp-cys蛋白的浓度分别是2mm和500μm。这种方法使用相对于egfp-cys蛋白四倍过量的不可逆性接头。在反应后，借助透析和超滤通过移除过量的不可逆性接头收集egfp-cys-6-mal-lpet*g产物。mg srta-介导的膜蛋白酶促标记
[0190]
反应按总体积200μl在37℃于pbs缓冲液中进行2小时，同时按10rpm的速度转动。mg srta的浓度是10μm并且egfp-cys-6-mal-lpet*g底物在25-75μm范围。在酶促反应之前，用pbs洗涤人或小鼠rbc两次。反应中rbc的浓度是1
×
109/ml。在反应后，用beckman coulter cytoflex lx或merck amnis image stream markii分析rbc的标记效率。通过质谱法鉴定的产物
[0191]
蛋白质的色谱脱盐和分离在配备zorbax 300sb-c3柱(2.1
×
150mm)(agilent technologies)的1260infinity ii系统(agilent technologies)上进行。1μg蛋白质加载于色谱柱上并且按流量0.4ml/分钟用流动相a(水，0.1％甲酸)和流动相b(乙睛，0.08％甲酸)的梯度与干扰种类分离。梯度是12分钟内5％-95％相b。色谱分离后，在配备双esi离子源的6230tof lc/ms光谱仪(agilent technologies)上分析蛋白质样品。tof-ms谱是从总离子色谱图(tic)提取并且使用bioconfirm 10.0软件(agilent technologies)中并入的maximum entropy反卷积。凝胶内消化
[0192]
将完整凝胶用考马斯蓝(h2o、0.1％w/v考马斯亮兰r250、40％v/v甲醇和10％v/v乙酸)在室温染色，伴以温和振摇过夜，并且随后用脱色液(水中40％v/v甲醇和10％v/v乙酸)脱色。凝胶在蒸馏水中于室温10分钟再水化三次，伴以温和搅拌。将蛋白质条带切下并且切成大约1
×
1mm2小片，随后在25℃用25mm nh4hco3的10mm tcep还原30分钟、在25℃暗处用25mm nh4hco3中的55mm iaa烷基化30分钟，随后在37℃用浓度100单位/ml的rpngase f消化4小时，并且在37℃用浓度12.5ng/ml的胰蛋白酶消化过夜(第1次消化4小时和第2次消化12小时)。随后通过使用50％acn/2.5％fa从凝胶小片提取胰蛋白酶解肽三次并且在真空下干燥肽溶液。通过pierce c18 spin tips柱(thermo fisher,usa)纯化干肽。结果
[0193]
我们首先表征用于蛋白质缀合的不可逆性接头。egfp用来测试反应的缀合效率。
我们表达并纯化c末端带半胱氨酸的egfp(egfp-cys)。我们还合成了不可逆性接头，6-mal-lpet*g。这两种反应底物按比率1:4＝egfp-cys:6-mal-lpet*g混合用于反应(图4)。收集反应终产物用于质谱法鉴定。结果显示，反应产物的分子量是反应底物和不可逆性接头的总和(图6)。根据egfp的结构分析，c端半胱氨酸暴露用于反应。为了进一步核实反应是否发生在c端半胱氨酸的硫氢基上，我们进行串联质谱法。结果显示全部修饰均在c端半胱氨酸上(图7)。
[0194]
随后，我们在rbc膜上表征不同种类egfp的标记效力。使用egfp-lpetg作为可逆底物的对照。我们的结果显示，》75％的天然rbc在体外通过mg srta被egfp-cys-6-mal-lpet*g标记。相反，通过使用可逆性底物egfp-lpetg在rbc的表面上检出仅约30％信号(图8)。
[0195]
为了体内评估这些表面修饰的rbc的寿命，我们接下来向野生型受者小鼠中输注egfp-cys-6-mal-lpet*g标记的小鼠rbc，后者同时用荧光染料dir(1,1
′‑
双十八烷基-3,3,3
′
,3
′‑
四甲基吲哚三碳菁碘化物)标记。定期分析体内dir阳性和egfp-cys-6-mal-lpet*g阳性rbc的百分数。我们发现，通过mg srta的egfp-cys-6-mal-lpet*g标记的rbc不仅显示与对照组相同的寿命，还在循环中显示持续35天持久的egfp-cys-6-mal-lpet*g信号(图9、图10和图11)。成像分析还显示细胞表面上令人信服的egfp-cys-6-mal-lpet*g信号和通过mg srta标记的加egfp-cys-6-mal-lpet*g标签的rbc形态正常(图12)。实施例3.借助不可逆性接头的mg srta介导的uox-细胞缀合方法大肠杆菌中表达和纯化mg srta
[0196]
将mg srta cdna(seq id no:3)克隆于pet载体中并在大肠杆菌bl21(de3)细胞中转化以表达蛋白质。将转化的细胞在37℃培养直至od
600
达到0.6-0.8并且随后添加500μm iptg在37℃持续4小时。此后，将细胞通过离心收获并且用预冷的裂解缓冲液(20mm tris-hcl，ph 7.8，500mm nacl)裂解。裂解物继续在冰上超声处理(5秒开，5秒关，60个循环，25％功率，branson sonifier 550ultrasonic cell disrupter)。在4℃按14,000g离心40分钟后，用0.22μm滤器过滤全部上清液。将过滤的上清液加载到连接于设计色谱体系的histrap ff 1ml柱(ge healthcare)上。用含有20mm tris-hcl ph7.8、500mm nacl和300mm咪唑的洗脱缓冲液洗脱蛋白质。全部洗脱级分均在12％sds-page凝胶上分析。大肠杆菌中表达和纯化uox-cys或uox-his
6-cys or uox-(gs)
3-cys
[0197]
uox(黄曲霉尿酸酶)的编码序列(seq id no:27)经密码子优化以便在大肠杆菌中表达并且由genscript合成。将亚克隆用标准pcr程序生成并插入带c端his6或(gs)3接头、后为额外半胱氨酸残基的pet-30a载体中。将全部构建体通过测序核实并且随后在大肠杆菌bl21(de3)中转化用于蛋白质表达。
[0198]
将转化的单菌落接种入补充氨苄青霉素(100μg/ml)的10ml luria-bertani(lb)培养基中，220转/分振摇下37℃培育过夜。将这种10ml培养物转移至1l新鲜的lb培养基并将培养物以220rpm振摇在37℃培育直至od
600
达到0.6。温度随后降至20℃并且添加1mm iptg用于诱导。
[0199]
通过在4℃按8,000rpm离心10分钟，在诱导后20小时收获细胞。对于无his6标签的蛋白质，将细胞沉淀物重悬于低盐裂解缓冲液(50mm tris 7.5，50mm nacl)中并用超声处理裂解。按10,000rpm离心1小时后收集的上清液加载于spa缓冲液(20mm tris 7.5)预平衡
的sp琼脂糖凝胶ff柱(cytiva,marlborough,usa)中。将柱用spa缓冲液洗涤直至280nm处吸光度和电导率变得稳定并且随后使用20mm tris 7.5中0-1m nacl的线性梯度洗脱。通过sds-page分析与洗脱峰对应的级分并且汇集最纯的级分。为了避免半胱氨酸氧化，将2mm tcep添加至合并的级分并且使用amicon ultra-15离心滤器装置(millipore，达姆施塔特，德国)进行样品浓缩。将浓缩的蛋白质加载到pbs预平衡的ezload 16/60chromdex 200pg(bestchrom,上海,中国)上，并且收集蛋白质目标峰。对于有his6标签的蛋白质，将细胞沉淀物重悬于裂解缓冲液(50mm tris 7.5，200mm nacl，5mm咪唑)中并用超声处理裂解。在ni sepharose 6ff亲和柱(cytiva)和阴离子交换柱上纯化加标签的蛋白质，随后进行大小排阻色谱。全部蛋白质均储存在-80℃。
[0200]
如所述那样通过使用uplc测量因尿酸的酶促氧化所致293nm处吸光度下降，测量uox-cys或uox-his
6-cys或uox-(gs)
3-cys的酶活性。
[0201]
下文显示uox-cys或uox-his
6-cys和uox-(gs)
3-cys的氨基酸序列与编码uox-cys或uox-his
6-cys和uox-(gs)
3-cys的核酸序列：seq id no:29(uox-cys的氨基酸序列)：msavkaarygkdnvrvykvhkdektgvqtvyemtvcvllegeietsytkadnsvivatdsikntiyitakqnpvtppelfgsilgthfiekynhihaahvnivchrwtrmdidgkphphsfirdseekrnvqvdvvegkgidiksslsgltvlkstnsqfwgflrdeyttlketwdrilstdvdatwqwknfsglqevrshvpkfdatwatarevtlktfaednsasvqatmykmaeqilarqqlietveyslpnkhyfeidlswhkglqntgknaevfapqsdpnglikctvgrsslksklaacseq id no:30(编码uox-cys的核酸序列)：atgtcagcagtaaaggcagcaagatacggtaaagataatgtcagagtctacaaggttcacaaggacgaaaaaactggtgttcaaacagtttacgaaatgactgtttgtgttttgttggaaggtgaaatcgaaacttcttacacaaaggctgataactcagttattgttgcaacagattctattaaaaatactatctatatcacagctaagcaaaacccagttactccaccagaattgttcggttcaatcttgggtacacatttcatcgaaaagtacaaccatatccatgctgcacatgttaacatcgtttgtcatagatggactagaatggatattgatggtaaaccacatccacattcttttattagagattcagaagaaaagagaaatgttcaagttgatgttgttgagggtaaaggtatcgatatcaagtcttcattgtcaggtttaactgttttgaagtctacaaattcacaattttggggtttcttgagagatgaatacactacattgaaggaaacatgggatagaattttatctactgatgttgatgctacatggcaatggaagaacttctcaggtttgcaagaagttagatctcatgttccaaaatttgatgctacttgggctacagcaagagaagttactttgaagacattcgcagaagataactctgcttcagttcaagcaactatgtacaagatggctgaacaaatcttggcaagacaacaattgatcgaaacagttgaatattcattaccaaataagcattacttcgaaatcgatttgtcttggcataagggtttgcaaaacactggtaaaaatgctgaagttttcgcaccacaatctgatccaaatggtttgattaaatgcacagtcggtagatcctctttgaagtccaagttagcagcacac
catcatcatcaccattgctgaseq id no:31(氨基酸序列uox-his
6-cys)：msavkaarygkdnvrvykvhkdektgvqtvyemtvcvllegeietsytkadnsvivatdsikntiyitakqnpvtppelfgsilgthfiekynhihaahvnivchrwtrmdidgkphphsfirdseekrnvqvdvvegkgidiksslsgltvlkstnsqfwgflrdeyttlketwdrilstdvdatwqwknfsglqevrshvpkfdatwatarevtlktfaednsasvqatmykmaeqilarqqlietveyslpnkhyfeidlswhkglqntgknaevfapqsdpnglikctvgrsslksklaahhhhhhcseq id no:32(编码uox-his
6-cys的核酸序列)：atgtcagcagtaaaggcagcaagatacggtaaagataatgtcagagtctacaaggttcacaaggacgaaaaaactggtgttcaaacagtttacgaaatgactgtttgtgttttgttggaaggtgaaatcgaaacttcttacacaaaggctgataactcagttattgttgcaacagattctattaaaaatactatctatatcacagctaagcaaaacccagttactccaccagaattgttcggttcaatcttgggtacacatttcatcgaaaagtacaaccatatccatgctgcacatgttaacatcgtttgtcatagatggactagaatggatattgatggtaaaccacatccacattcttttattagagattcagaagaaaagagaaatgttcaagttgatgttgttgagggtaaaggtatcgatatcaagtcttcattgtcaggtttaactgttttgaagtctacaaattcacaattttggggtttcttgagagatgaatacactacattgaaggaaacatgggatagaattttatctactgatgttgatgctacatggcaatggaagaacttctcaggtttgcaagaagttagatctcatgttccaaaatttgatgctacttgggctacagcaagagaagttactttgaagacattcgcagaagataactctgcttcagttcaagcaactatgtacaagatggctgaacaaatcttggcaagacaacaattgatcgaaacagttgaatattcattaccaaataagcattacttcgaaatcgatttgtcttggcataagggtttgcaaaacactggtaaaaatgctgaagttttcgcaccacaatctgatccaaatggtttgattaaatgcacagtcggtagatcctctttgaagtccaagttagcagcatgctgaseq id no:33(uox-gs
3-cys的氨基酸序列)：msavkaarygkdnvrvykvhkdektgvqtvyemtvcvllegeietsytkadnsvivatdsikntiyitakqnpvtppelfgsilgthfiekynhihaahvnivchrwtrmdidgkphphsfirdseekrnvqvdvvegkgidiksslsgltvlkstnsqfwgflrdeyttlketwdrilstdvdatwqwknfsglqevrshvpkfdatwatarevtlktfaednsasvqatmykmaeqilarqqlietveyslpnkhyfeidlswhkglqntgknaevfapqsdpnglikctvgrsslksklaagsgsgscseq id no:34(编码uox-gs
3-cys的核酸序列)：atgtcagcagtaaaggcagcaagatacggtaaagataatgtcagagtctacaaggttcacaaggacgaaaaaactggtgttcaaacagtttacgaaatgactgtttgtgttttgttggaaggtgaaatcgaaacttcttacacaaaggctgataactcagttattgttgcaacagattctattaaaaatactatctatatcacagctaagcaaaacccagttactccaccagaattgttcggttcaatcttgggtacacatttcatcgaaaagtacaaccatatccatgctgcacatgtt
aacatcgtttgtcatagatggactagaatggatattgatggtaaaccacatccacattcttttattagagattcagaagaaaagagaaatgttcaagttgatgttgttgagggtaaaggtatcgatatcaagtcttcattgtcaggtttaactgttttgaagtctacaaattcacaattttggggtttcttgagagatgaatacactacattgaaggaaacatgggatagaattttatctactgatgttgatgctacatggcaatggaagaacttctcaggtttgcaagaagttagatctcatgttccaaaatttgatgctacttgggctacagcaagagaagttactttgaagacattcgcagaagataactctgcttcagttcaagcaactatgtacaagatggctgaacaaatcttggcaagacaacaattgatcgaaacagttgaatattcattaccaaataagcattacttcgaaatcgatttgtcttggcataagggtttgcaaaacactggtaaaaatgctgaagttttcgcaccacaatctgatccaaatggtttgattaaatgcacagtcggtagatcctctttgaagtccaagttagcagcaggttctggttctggttcttgctga不可逆性接头通过半胱氨酸偶联与uox-cys或uox-his
6-cys或uox-(gs)
3-cys缀合
[0202]
按超过99％纯度合成不可逆性接头6-马来酰亚胺己酸-leu-pro-glu-thr-2-羟基乙酸-gly(6-马来酰亚胺己酸-lpet-(2-羟基乙酸)-g、6-mal-lpet*g)。反应按总体积1ml在室温于pbs缓冲液中进行1小时，同时按10rpm的速度转动。6-mal-lpet*g和uox-cys(uox-his6或uox-(gs)
3-cys)蛋白的浓度分别是2mm和500μm。这种方法使用相对于uox-cys、uox-his
6-cys和uox-(gs)
3-cys蛋白两倍过量的不可逆性接头。在反应后，借助透析和超滤通过移除过量的不可逆性接头收集uox-cys-6-mal-lpet*g或uox-his
6-cys-6-mal-lpet*g或uox-(gs)
3-cys-6-mal-lpet*g产物。rbc借助mg分选酶介导的反应与uox-cys-6-mal-lpet*g或uox-his
6-cys-6-mal-lpet*g或uox-(gs)
3-cys-6-mal-lpet*g缀合
[0203]
反应按总体积200μl～15ml在37℃于pbs缓冲液中进行2小时，同时按10rpm的速度转动。mg srta的浓度是10μm并且uox-cys-6-mal-lpet*g底物或uox-his
6-cys-6-mal-lpet*g底物或uox-(gs)
3-cys-6-mal-lpet*g底物在10-100μm范围。在酶促反应之前，用pbs洗涤人或小鼠或大鼠或食蟹猴rbc两次。反应中rbc的浓度是5
×
109～1
×
10
10
/ml。工程化红细胞的体内存活和稳定性
[0204]
将far红标记的工程化红细胞通过静脉内注射注入c57/b6小鼠、大鼠或食蟹猴。通过流式细胞术分析工程化红细胞的体内存活。基于pet的生物分布分析
[0205]
将7.5ml工程化的rbc和20mci氟脱氧葡萄糖(18-fdg)移入反应小瓶并用pbs(67.5ml)稀释。在37℃孵育反应混合物小瓶。1小时孵育后，通过离心法纯化反应混合物并且移除上清液。用放射性活度计测定放射化学产率。最后，用pbs(15ml)稀释放射标记的uox-rbc。
[0206]
在预定时间点(输注工程化的rbc后0.5小时、1小时和3小时)，在生物安全水平3级设施内部将动物镇静并用pet-ct(ge discovery pet/ct elite)成像。通过将目的区域和suv(标准摄取体积)绘图，测量fdg亲合力。体外分析工程化红细胞的功能
[0207]
在37℃于300μm尿酸存在下孵育工程化rbc。在指定的时间评价尿酸浓度以体外确定由工程化rbc消耗ua的速率。体内分析工程化红细胞的功能
[0208]
我们在高尿酸血症大鼠模型中评估uox-rbc的治疗性功能。通过次黄嘌呤(500mg/
his
6-cys-lpet*g在具有或没有10μm mg srta的情况下孵育2小时。在酶促反应后，通过将rbc与pe缀合的抗his标签抗体孵育检测并通过流式细胞术分析标记效力。我们的结果显示》99％的小鼠或人或大鼠或食蟹猴天然rbc在体外通过mg srta被uox标记。相反，无mg srta酶情况下，用模拟对照组未在小鼠或人或大鼠或食蟹猴rbc的表面上检出明显his标签信号。
[0216]
我们还体外分析了uox-rbc的尿酸降解速率。在37℃约400μm尿酸存在下孵育工程化rbc。uox-rbc具有42.12nmol/h/μl uox-rbc的尿酸酶活性，如图14中所示。
[0217]
为了体内评估这些表面修饰的rbc的寿命，我们接下来输注uox-lpet*g标记的食蟹猴rbc，后者同时用荧光染料far红标记。定期分析体内far红和his标签阳性rbc的百分数。我们发现，借助mg srta做uox标记的rbc显示与对照组相同的寿命(图15)。
[0218]
图16显示食蟹猴中多个时间点处
18
fdg标记的uox-rbc注射后的代表性pet图像。pet显示肝脏和脾脏中分布最明显，而在心脏、脑和肌肉中蓄积低。
[0219]
在重复输注后，大鼠uox-rbc在大鼠高尿酸血症模型中降低ua浓度。如前述通过次黄嘌呤(500mg/kg)和氧嗪酸(250mg/kg)诱导大鼠出现高尿酸血症[22,23]并且1小时后，将1ml(约5％)或200μl(约1％)或100μl(约0.5％)有功能的大鼠uox-rbc经静脉内注入这些大鼠中，在0、3和6小时分析其血清ua浓度。uox-rbc在高尿酸血症大鼠模型中显著减轻血清ua升高(图17)
[0220]
在猴中，当血清样品稀释至1:1000时，uox-rbc输注的猴中观察到对uox—cys-6-mal-lpet*g有反应的阳性igg抗体。而对于大鼠，当血清样品稀释至1:1000时，还观测到对uox-cys-6-mal-lpet*g的阳性igg抗体，表明uox-rbc在大鼠(图18a)和食蟹猴中有免疫原性(图18b，uox-rbcs-1和uox-rbcs-2是两个重复)。我们还确定免疫应答是否有中和性。我们将这些血清样品在37℃与uox孵育1小时并且无酶活性差异，表明大鼠或猴任一者中不存在中和抗体。
[0221]
全部食蟹猴在治疗阶段结束时均存活。研究期间常规血液学、凝集、血液生化和常规尿分析方面没有与uox-rbc相关的变化(参见，表7、表8和表9)。
[0222]
尽管已经说明并描述了本发明的实施方案，但这些实施方案不意在显示并描述本发明的全部可能形式。相反，说明书中所用的语词是描述性而非限制性语词，并且可以理
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技术特征：
1.一种使试剂与之连接的红细胞(rbc)，其中试剂通过分选酶介导的反应、优选通过分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合与至少一种内源性、非工程化rbc膜蛋白连接，并且其中试剂包含尿酸降解多肽。2.根据权利要求1所述的红细胞，其中分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合至少发生在至少一种内源性、非工程化膜蛋白的胞外结构域内部位点处的甘氨酸(n)和/或赖氨酸ε-氨基上，优选地n为1或2。3.根据权利要求1或2所述的红细胞，其中rbc尚未经基因工程化以表达包含分选酶识别基序或亲核性接纳体序列的蛋白质，并且优选地rbc是天然rbc，如人天然rbc。4.根据权利要求1-3中任一项所述的红细胞，其中分选酶能够介导甘氨酸(n)缀合和/或赖氨酸侧链ε-氨基缀合，优选地在至少一种内源性、非工程化膜蛋白的胞外结构域内部位点处介导，优选地n为1或2。5.根据权利要求4所述的红细胞，其中分选酶是分选酶a(srta)如金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)转肽酶a变体(mgsrta)。6.根据权利要求5所述的红细胞，其中mgsrta包含与如seq id no:3中所述的氨基酸序列具有至少60％同一性的氨基酸序列或基本上由其组成或由其组成。7.根据权利要求1-6中任一项所述的红细胞，其中与rbc连接之前，试剂在其c末端包含分选酶识别基序。8.根据权利要求7所述的红细胞，其中试剂包含(a
1-sp)
m-m的结构，其中a1代表该试剂，sp代表任选的间隔子并且m代表分选酶识别基序；m为大于或等于1的整数，优选地m＝1至3。9.根据权利要求8所述的红细胞，其中分选酶识别基序包含选自以下的氨基酸序列或基本上由其组成或由其组成：lpxtg、lpxag、lpxsg、lpxlg、lpxvg、lgxtg、laxtg、lsxtg、npxtg、mpxtg、ipxtg、spxtg、vpxtg、ypxrg、lpxts和lpxta，其中x是任何氨基酸。10.根据权利要求8所述的红细胞，其中分选酶识别基序包含从分选酶识别基序n末端至c末端的方向位于位置5处的非天然氨基酸，其中非天然氨基酸是具有式ch2oh-(ch2)
n-cooh的任选取代的羟基羧酸，n是从0至3的整数，优选地n＝0。11.根据权利要求10所述的红细胞，其中m包含选自以下的氨基酸序列或基本上由其组成或由其组成：lpxt*y、lpxa*y、lpxs*y、lpxl*y、lpxv*y、lgxt*y、laxt*y、lsxt*y、npxt*y、mpxt*y、ipxt*y、spxt*y、vpxt*y和ypxr*y，其中*代表任选取代的羟基羧酸；并且x和y独立地代表任何氨基酸。12.根据权利要求11所述的红细胞，其中m包含选自以下的氨基酸序列或基本上由其组成或由其组成：lpxt*g、lpxa*g、lpxs*g、lpxl*g、lpxv*g、lgxt*g、laxt*g、lsxt*g、npxt*g、mpxt*g、ipxt*g、spxt*g、vpxt*g、ypxr*g、lpxt*s和lpxt*a，优选地m是*为2-羟基乙酸的lpet*g。13.根据权利要求1-12中任一项所述的红细胞，其中与brc表面上至少一种内源性、非工程化膜蛋白连接的试剂包含(a
1-sp)
m-l
1-p1的结构，其中l1与p1中的甘氨酸
(n)
连接，和/或包含(a
1-sp)
m-l
1-p2的结构，其中l1与p2中的赖氨酸侧链ε-氨基连接，其中n优选地是1或2，a1代表试剂，sp代表任选的间隔子，l1选自lpxt、lpxa、lpxs、lpxl、lpxv、lgxt、laxt、lsxt、npxt、mpxt、ipxt、spxt、vpxt和ypxr，p1和p2独立地代表至少一种内源性、非工程化膜蛋白的胞外结构域，并且x代表任何氨基酸；m为大于或等于1的整数，优选地m＝1至3。
14.根据权利要求8-13中任一项所述的红细胞，其中sp选自由以下类型组成的群组：(1)零长度类型；(2)胺-硫氢基类型；(3)同双官能nhs酯类型；(4)同双官能酰亚胺酯类型；(5)羰基-硫氢基类型；(6)硫氢基反应性类型；和(7)硫氢基-羟基类型；和优选地一个或多个sp是nhs酯-马来酰亚胺异双官能交联剂如6-马来酰亚胺己酸和4-马来酰亚胺丁酸并且试剂包含暴露的硫氢基，优选地暴露的半胱氨酸，更优选地末端半胱氨酸，最优选地c末端半胱氨酸。15.根据权利要求1-14中任一项所述的红细胞，其中尿酸降解多肽包含一种或多种选自以下的多肽：尿酸酶、hiu水解酶、ohcu脱羧酶、尿囊素酶和尿囊酸酶，优选地尿酸酶包含seq id no:27中所述的氨基酸序列或其功能性变体或片段。16.根据权利要求1-15中任一项所述的红细胞，其中试剂额外地包含尿酸转运蛋白，所述尿酸转运蛋白优选地包含一种或多种选自以下的多肽：urat1、glut9、oat4、oat1、oat3、gal-9、abcg2、slc34a2、mrp4、oat2、npt1、npt4和mct9，优选地urat1包含seq id no:28中所述的氨基酸序列或其功能性变体或片段。17.组合物，其包含多个根据权利要求1-16中任一项所述的红细胞和生理可接受的载体。18.用于制备根据权利要求1-16中任一项所述的红细胞的方法，包括将红细胞(rbc)与包含分选酶识别基序的分选酶底物和试剂在分选酶存在下，在适于分选酶通过分选酶介导的反应、优选地通过分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合，使分选酶底物缀合于至少一种内源性、非工程化rbc膜蛋白的条件下接触，其中试剂包含尿酸降解多肽。19.根据权利要求18所述的方法，其中分选酶底物包含(a
1-sp)
m-m的结构，其中a1代表试剂，sp代表任选的间隔子并且m代表分选酶识别基序；m为大于或等于1的整数，优选地m＝1至3。20.根据权利要求19所述的方法，其中分选酶识别基序包含选自以下的氨基酸序列或基本上由其组成或由其组成：lpxtg、lpxag、lpxsg、lpxlg、lpxvg、lgxtg、laxtg、lsxtg、npxtg、mpxtg、ipxtg、spxtg、vpxtg、ypxrg、lpxts和lpxta，其中x是任何氨基酸。21.根据权利要求19所述的方法，其中分选酶识别基序包含从分选酶识别基序n末端至c末端的方向位于位置5处的非天然氨基酸，其中非天然氨基酸是具有式ch2oh-(ch2)
n-cooh的任选取代的羟基羧酸，n是从0至3的整数，优选地n＝0。22.据权利要求21所述的方法，其中m包含选自以下的氨基酸序列或基本上由其组成或由其组成：lpxt*y、lpxa*y、lpxs*y、lpxl*y、lpxv*y、lgxt*y、laxt*y、lsxt*y、npxt*y、mpxt*y、ipxt*y、spxt*y、vpxt*y和ypxr*y，其中*代表任选取代的羟基羧酸；并且x和y独立地代表任何氨基酸。23.根据权利要求22所述的方法，其中m包含选自以下的氨基酸序列或基本上由其组成或由其组成：lpxt*g、lpxa*g、lpxs*g、lpxl*g、lpxv*g、lgxt*g、laxt*g、lsxt*g、npxt*g、mpxt*g、ipxt*g、spxt*g、vpxt*g、ypxr*g、lpxt*s和lpxt*a，优选地m是*为2-羟基乙酸的lpet*g。24.根据权利要求19-22中任一项所述的方法，其中sp选自由以下类型组成的群组：(1)零长度类型；(2)胺-硫氢基类型；(3)同双官能nhs酯类型；(4)同双官能酰亚胺酯类型；(5)
羰基-硫氢基类型；(6)硫氢基反应性类型；和(7)硫氢基-羟基类型；和优选地一个或多个sp是nhs酯-马来酰亚胺异双官能交联剂如6-马来酰亚胺己酸和4-马来酰亚胺丁酸，并且试剂包含暴露的硫氢基，优选地暴露的半胱氨酸，更优选地末端半胱氨酸，最优选地c末端半胱氨酸。25.用于有需求的受试者中治疗或预防与升高的尿酸水平相关的病症、病状或疾病的方法，包括向受试者施用根据权利要求1-16中任一项所述的红细胞或根据权利要求17所述的组合物。26.根据权利要求25所述的方法，其中受试者在施用之前具有大于约8.0mg/dl的血清尿酸水平。27.根据权利要求25或26所述的方法，其中与升高的尿酸水平相关的病症、病状或疾病选自：高尿酸血症、痛风(例如，慢性顽固性痛风、痛风结节和痛风性关节炎)、代谢综合征、肿瘤溶解综合征、lesch-nyhan综合征、心血管疾病、糖尿病、高血压、肾脏疾病和尿酸肾石病。28.根据权利要求1-16中任一项所述的红细胞或根据权利要求17所述的组合物的用途，用于制造在有需求的受试者中治疗或预防与升高的尿酸水平相关的病症、病状或疾病的药物。29.根据权利要求28所述的用途，其中受试者在施用之前具有大于约8.0mg/dl的血清尿酸水平。30.根据权利要求28或29所述的用途，其中与升高的尿酸水平相关的病症、病状或疾病选自：高尿酸血症、痛风(例如，慢性顽固性痛风、痛风结节和痛风性关节炎)、代谢综合征、肿瘤溶解综合征、lesch-nyhan综合征、心血管疾病、糖尿病、高血压、肾脏疾病和尿酸肾石病。31.根据权利要求1-16中任一项所述的红细胞或根据权利要求17所述的组合物用于有需求的受试者中治疗或预防与升高的尿酸水平相关的病症、病状或疾病，所述病症、病状或疾病优选地选自：高尿酸血症、痛风(例如，慢性顽固性痛风、痛风结节和痛风性关节炎)、代谢综合征、肿瘤溶解综合征、lesch-nyhan综合征、心血管疾病、糖尿病、高血压、肾脏疾病和尿酸肾石病。

技术总结
本公开提供一种使试剂与之连接的红细胞(RBC)，其中试剂通过分选酶介导的反应、优选通过分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合与至少一种内源性、非工程化RBC膜蛋白连接，并且其中试剂包含尿酸降解多肽、尿酸转运蛋白或其组合；一种用于制备RBC的方法；和该RBC预防或治疗与升高的尿酸水平相关的病症、病状或疾病(包括高尿酸血症或痛风)的用途。或痛风)的用途。或痛风)的用途。


技术研发人员：高晓飞 聂小千 任鋆 黄彦杰 刘璇 刘禄
受保护的技术使用者：西湖生物医药科技（杭州）有限公司
技术研发日：2022.01.30
技术公布日：2023/10/15