用于保存细胞、组织和/或食品的添加剂的制作方法

1.本发明涉及生物技术，植物化学和食品工艺领域，并提供了一种用于保存细胞、组织和/或食品的添加剂，以及合成肽用于制备所述添加剂的用途。除其它应用外，本发明可用于增加食品的保质期并提供更高的食品安全性。在一个实施方案中，本发明的添加剂通过单次施用所述添加剂来提供对水果的实质性保存(substancial )，提供了对植物或食品的处理以防止有害生物(如细菌或真菌)的出现，例如与水果(包括草莓)的腐烂有关的那些、咖啡和橘子树中的苛养木杆菌(xylella fastidiosa)。在一个实施方案中，本发明的添加剂通过单次施用所述添加剂提供了对花或花序的实质性保存，提供了针对具有植物化学价值的花或花序(包括非洲菊(gerbera)、大麻(cannabis)等)的储存、运输和/或药物加工相关的快速枯萎、腐烂或真菌生长的替代方案。在一个实施方案中，当施用所述添加剂时，本发明的添加剂提供对芽(brotos)或幼苗的代谢状态的实质性保存，以及减缓种子发芽过程，因此可用于同步发芽，调整种植或发芽的时间，以及涉及其他农艺或植物学的优势。


背景技术：

2.植物化学和食品市场需要不断发展，以满足生产、物流和消费的需求。在这种情况下，非常需要有利于链条中的任何这些点的解决方案。本发明提供了一种解决方案，适用于各个链条中的所有这些元素。
3.在搜索科学和专利文献的现有技术时，发现了下列与该主题有关的文献:
4.本发明人的专利申请br 102014000521-0被认为是与本发明最接近的先例。然而，无论是这篇文献还是所发现的任何其它文献都没有揭示、建议或教导肽用于保存细胞和/或食品的外用用途(uso t
ó
pico)，以及包含所述合成肽的添加剂。
5.从所研究的文献中可以看出，没有发现预期或建议本发明的教导的文献，因此在本发明人看来，本技术中提出的解决方案相对于现有技术具备新颖性和创造性。


技术实现要素：

6.本发明通过使用用于保存细胞、组织和/或食品的合成肽，以及包含所述肽的添加剂来解决现有技术的问题，可用于改善食品和/或植物的生产，物流和/或消费。
7.本发明的目的之一是提供一种方法来增加食品的保质期，并提供更高的食品安全性。
8.本发明的另一个目的是提供一种方法来提高植物或其部分的质量和/或保质期，以提供对植物化学产品的生产链的改善。
9.在一个实施方案中，本发明提供了一种包含所述肽和水或赋形剂的外用添加剂(um aditivo de uso t
ó
pico)，用于保存细胞、组织和/或食品。
10.在一个实施方案中，本发明提供了一种添加剂，用于具有观赏或植物化学价值的
花或花序的茎或枝的水合液中。
11.本发明中的合成肽选自seq id no:1和seq id no:4至14的肽，可选地在第一个氨基酸和/或最后一个氨基酸的n端部分和/或c端部分处额外包含细胞穿透肽尾。seq id no:3的肽代表了一种肽，包括seq id no:1的肽和在c端区域中的seq id no:2的细胞穿透肽。seq id no:15的肽代表了一种肽，包括seq id no:9的肽和seq id no:2的细胞穿透肽。
12.在一个实施方案中，本技术的添加剂在施用至少一个剂量时提供了对水果的实质性保存。
13.在一个实施方案中，本技术的添加剂提供了对植物或食品的处理，以防止有害生物(pragas)(如细菌或真菌)的出现，例如与草莓的腐烂或污染有关的那些。
14.在一个实施方案中，在施用所述添加剂时，本技术的添加剂提供了对芽或幼苗的代谢状态的实质性保存，以及种子发芽过程，因此可用于同步发芽，调整种植或发芽的时间，以及涉及其它农艺或植物学的优势。
15.在一个实施方案中，本技术的添加剂提供了对具有观赏或植物化学价值的花或花序的处理，以防止或延缓枯萎、腐烂或有害生物(如细菌或真菌)的出现，并更长时间维持花或花序的质量和完整性。
16.本发明的上述内容和其他目的将很快被本领域技术人员和对该部分感兴趣的公司所重视，并将被以充分的细节来描述，以在下文中复现它们。
附图说明
17.为了更好地定义和阐释本专利申请的内容，提供以下图片:
18.图1示出了在ktut实施方案中，在新鲜草莓上施用100μm防腐肽(preservative peptide)ktut、seq id no:3或水(对照)的实验的可视结果(resultados visuais)，所有草莓都来自同一批次和相同商业产品包装。分别在a、b、c、d、e和f中示出了在0、12、24、36、48和60h时在每个条件下(试验和对照)每组10个草莓的各组的结果。
19.图2示出了在新鲜草莓上施用100μm防腐肽的一个实施方案(ktut,seq id no:3)或水后，以小时为单位的时间(横轴)和变质果实的百分比(纵轴(ordenadas))。
20.图3示出了施用本发明添加剂的实验的可视结果，其中在每组中8个新鲜草莓上施用100μm防腐肽的一个实施方案(ktut,seq id no:3)水溶液(em
á
gua)，或仅施用作为对照的水，所有草莓都来自同一批次和相同商业产品包装。分别在a、b、c和d中示出了在0h、24h、48h和5天时在每个条件下(试验和对照)的草莓的代表性结果。
21.图4示出了在豆类种子上施用单个剂量的100μm(水溶液)防腐肽的一个实施方案(ktut,seq id no:3)或水(对照)的实验的可视结果，所有种子都来自同一批次和相同商业产品包装，并保存在室温下(28℃)。分别在a、b和c中示出了在0、3和4天时在每个条件下(对照和试验)每组14个种子的各组在潮湿棉花中的发芽结果。图片示出了豆类的发芽模式存在差异。
22.图5示出了在图4所示的条件下，在施用100μm防腐肽的一个实施方案(ktut,seq id no:3)后，以天为单位的时间(横轴)和发芽的豆类种子数量(纵轴)。
23.图6示出了在两种类型的花上施用单个剂量的100μm(水溶液)的防腐肽的一个实施方案(ktut,seq id no:15)或水(对照)的实验的可视结果，所有花都来自同一批次且同
一天获取，并保存于室温(28℃)下。每个容器中使用4朵花，在试验期间，将茎保持浸没在至少5厘米的各个液体中。在浸没茎的容器周围使用了铝箔，以防止光线照射。示出了在0、3和6天时在每个条件下(对照和试验)保存的花的照片结果。在a、c和e中分别示出了第0、3和6天时的玫瑰图像，左边的玫瑰保存在水中，右边的玫瑰保存在上述防腐肽中。在b、d和f中分别示出了第0、3和6天时的非洲菊图像，左边的非洲菊保存在水中，右边的非洲菊保存在上述防腐肽中。
具体实施方式
24.本发明使用用于保存细胞、组织和/或食品的合成肽和包含所述肽的添加剂解决了现有技术的问题，有助于改善食品和/或植物的生产、物流和/或消费。
25.本发明中的合成肽选自seq id no:1和seq id no:4至14的肽，可选地在第一个氨基酸和/或最后一个氨基酸的n端部分和/或c端部分处额外包含细胞穿透肽尾。seq id no:3的肽代表了一种肽，包括seq id no:1的肽和在c端区域中的seq id no:2的细胞穿透肽。seq id no:15的肽代表了一种肽，包括seq id no:9的肽和seq id no:2的细胞穿透肽。
26.在一个实施方案中，本发明提供了一种包括所述肽和水和/或赋形剂的外用添加剂，用于保存细胞、组织和/或食品。
27.在一个实施方案中，本发明提供了一种添加剂，用于具有观赏或植物化学价值的花或花序的茎或枝的水合液中。
28.在一个实施方案中，该肽在第一个氨基酸和/或最后一个氨基酸的n端部分和/或c端部分处具有一个细胞穿透肽尾。
29.本发明还由以下条款定义。
30.选自seq id no:1和seq id no:4至14的肽的合成肽，用于制备用于保存细胞、组织和/或食品的防腐添加剂的用途。
31.如上所述的用途，其中所述肽在第一个氨基酸和/或最后一个氨基酸的n端部分和/或c端部分处额外包含一个细胞穿透肽尾。
32.如上所述的用途，其中所述细胞穿透肽尾具有seq id no:2。
33.如上所述的用途，其中所述肽包含seq id no:3。
34.如上所述的用途，其中所述肽包含seq id no:15。
35.如上所述的用途，用于制备具有农艺、植物学和/或药用价值的植物和/或水果的防腐添加剂，或用于增加食品保质期和食品安全性。
36.如上所述的用途，用于制备调节具有农艺、植物学和/或药用价值的植物的发芽和/或植物发育的添加剂。
37.如上所述的用途，用于制备用于处理具有观赏或植物化学价值的花或花序的添加剂，以防止或延缓枯萎、腐烂或有害生物(如细菌或真菌)的出现，和/或更长时间维持花或花序的质量和完整性。
38.用于保存细胞、组织和/或食品的添加剂，包括水和/或辅料，以及选自seq id no:1和seq id no:4至14的肽的合成肽。
39.如上所述的添加剂，其中所述的该肽在第一个氨基酸和/或最后一个氨基酸的n端部分和/或c端部分处额外包含一个细胞穿透肽尾。
40.如上所述的添加剂，其中所述细胞穿透肽尾具有seq id no:2。
41.如上所述的添加剂，其中所述合成肽具有seq id no:3。
42.如上所述的添加剂，其中所述的肽包含seq id no:15。
43.如上所述的添加剂，用于具有观赏或植物化学价值的花和/或花序的收获后保存。
44.本专利申请中使用的术语定义如下:
45.用于内化至细胞内介质(meio intracelular)的肽。在本专利申请的上下文中，该术语应被理解为具有帮助/允许生物活性肽内化至细胞内介质中并因此在细胞内介质中呈现生物效应的功能的任何肽。
46.细胞周期。在本专利申请的上下文中，细胞周期应被理解为发生在细胞内并导致细胞分裂和复制的一系列事件。应该理解的是，细胞周期包括微生物或植物的细胞周期的任何状态，如关于间期和细胞分裂的静止/衰老状态及其阶段。因此，应该理解细胞阶段g0,g1,s,g2和有丝分裂(m)也是细胞周期概念的一部分。
47.细胞穿透肽尾(cpp)。在本专利申请的上下文中，细胞穿透肽尾(cpp)是指促进主肽(pept
í
deo principal)进入细胞内介质中的短氨基酸序列，并以此作为肽运输到细胞内介质的一种方式。仍然在本专利申请的上下文中，cpp还包括现有技术已知的亲水尾，例如尾tat、synb1、synb3、ptd-4、ptd-5、d-tat、r9-tat等。也包括两亲性尾，如尾map、sbp、fbp等。
48.细胞分裂或增殖。在本专利申请的上下文中，细胞分裂或增殖应被理解为在任何类型的细胞系中，无论是哺乳动物、植物还是微生物。仍然在本专利申请的上下文中，应该理解分裂细胞也可能与微生物对食品或植物的污染和/或种子发芽和/或植物发育有关。
49.抑制细胞增殖。在本专利申请的上下文中，本术语应该被理解为抑制任何类型或谱系的哺乳动物、植物或微生物细胞的增殖，且所述细胞可以处于细胞分裂的任何阶段，细胞在细胞周期内可能或可能不同步。在本专利申请的上下文中，抑制细胞的细胞增殖表示中断细胞分裂过程，导致或不导致细胞死亡。
50.植物或食品的有害物质或污染。在本专利申请的上下文中，植物或食品的害虫或污染被认为是污染植物或食品的那些生物试剂(agentes)，其与植物或食品腐烂有关和/或导致对植物或食品的产品的质量或保质期的损害。这一定义中包括导致腐烂的微生物污染、形成毒素的那些和改变的那些(as que formam toxinas e as que alteram)。例子包括,但不限于烟草疫霉(p.nicotiana)和p.idaei、灰葡萄孢菌(botrytis cinerea),炭疽菌属匍枝根霉(colletotrichum spp.rhizopus stolonifer)、核盘菌(s.sclerotiorum)、长刚毛盘多毛孢属丝核菌种(pestalotia longisetula rhizoctonia sp.)、地霉属(geotrichum sp.)、日规壳菌属(gnomonia comari)、(除其他外)与草莓腐烂相关的草莓褐色叶斑病菌(pilidiumconcavum)、咖啡和橘子树中的苛养木杆菌(xylella fastidiosa)、与大麻的存储，运输和/或药物加工相关的真菌。
[0051]“pep5”或“pep5”。在本专利申请的上下文中，该术语应理解为seq id no:1所代表的肽，氨基酸序列为welvvlgkl。
[0052]“cpp”。在本专利申请的上下文中，该术语应理解为一个肽尾，该肽尾可以由seq id no:2代表，氨基酸序列为ygrkkrrqrrr。
[0053]
pep5-cpp或pep5-cpp或“pep5-cpp”。在本专利申请的上下文中，该术语应理解为
由seq id no:1代表的肽连接到由序列seq id no:2代表的肽尾。
[0054]
δn-pep5-cpp。在本专利申请的上下文中，该术语应理解为由seq id no:1代表的肽，但没有n端部分的最后一个氨基酸，并连接到由seq id no:2代表的肽尾。
[0055]
δni-pep5-cpp。在本专利申请的上下文中，该术语应理解为为由seq id no:1代表的肽，但没有n端部分的最后i个氨基酸，其中i＝1、2、3、4或5，并连接到由seq id no:2代表的肽尾。
[0056]
δc-pep5-cpp。在本专利申请的上下文中，该术语应理解为由seq id no:1代表的肽，但没有c端部分的最后一个氨基酸，并连接到由seq id no:2代表的肽尾。
[0057]
δci-pep5-cpp。在本专利申请的上下文中，该术语应理解为由seq id no:1代表的肽，但没有c端部分的最后i个氨基酸，其中i＝1、2、3、4或5，并连接到由seq id no:2代表的肽尾。一个实例为seq id no:9。
[0058]
由于与seq id no:1和seq id no:9相关的氨基酸序列的微小变化(两者均在本技术说明书中进行了有效测试)，seq id no:4-14的肽被认为是本发明的发明概念之内。
[0059]
多肽的合成。本专利申请中公开的多肽是使用固相肽合成技术合成的(fastmoc chemistr，购自applied biosystems公司)。
[0060]
这里所示的实施例仅意在举例说明实施本发明的多种方式中的一种，而不是限制其范围。
[0061]
实施例1-使用所述肽制备植物或食品防腐添加剂
[0062]
seq id no:3的肽(其包括pep5(seq id no:1)和细胞穿透肽(seq id no:2))是在100μm水溶液中制备，用于直接外用于待保存的食品。
[0063]
seq id no:15的肽(其包括seq id no:9的肽和seq id no:2的细胞穿透肽)是在100μm水溶液中制备，用于待保存的食品或植物。
[0064]
本领域技术人员会立即理解，除了水之外，他们还可以将其他赋形剂掺入到本发明的添加剂中，以提高本文所示的保存性能。
[0065]
实施例2-包括所述肽的添加剂在保存草莓免受真菌污染中的试验
[0066]
根据实施例1制备的添加剂是通过单次外用施用而用于食品保存的实验。
[0067]
图1示出了在新鲜草莓上施用100μm防腐剂肽(seq id no:3)或水(对照)的实验的可视结果，所有草莓均来自同一批次和商业产品包装。分别在a、b、c、d、e和f中示出了在0、12、24、36、48和60h时在每个条件下(试验和对照)每组10个草莓的各组的结果。
[0068]
在图1的d)和e)中，可以看到具有白色菌丝的真菌的存在，这在经处理的草莓中是检测不到的。虽然这些污染物还没有被表征，但它们的外观与匍枝根霉(rhizopus stolonifer)或核盘菌(sclerotinia sclerotiorum)一致。
[0069]
图2示出了在新鲜草莓上施用100μm防腐肽(seq id no:3)或水后，以小时为单位的时间(横轴)和变质果实的百分比(纵轴)。
[0070]
图1和图2的结果清楚地示出了通过单次施用在水溶液中的添加剂在水果保存方面的巨大潜力。
[0071]
施用seq id no:15的肽得到了类似的结果，其中包括seq id no:9的肽和seq id no:2的肽。
[0072]
实施例3-含有所述肽的添加剂在保存草莓免于腐烂中的试验
[0073]
用草莓进行了一项新的实验，现在将测试组和对照组保存在4℃的温度(在冰箱中)，以能够观察在不利于微生物生长的条件下的保存情况。
[0074]
图3示出了施用本发明添加剂的实验的可视结果，其中在每组中8个新鲜草莓施用100μm防腐肽(seq id:3)水溶液，或仅施用作为对照的水，所有草莓均来自同一批次和商业产品包装。分别在a、b、c和d中示出了在0h、24h、48h和5天时在每个条件下(试验和对照)的草莓的代表性结果。
[0075]
在图3的d)中，未经处理的草莓组中严重腐烂的存在是非常明显的，一种即使在5天后在用本发明的添加剂处理的草莓组中也无法检测到的情况。所述腐烂与在实施例2的实验中观察到的微生物污染的情况有很大不同。
[0076]
本领域技术人员会立即理解本发明巨大的技术和经济价值，并可将本发明的添加剂应用于保存其他植物或食品。
[0077]
实施例4—含有所述肽的防腐添加剂在调节豆类种子发芽率中的试验
[0078]
为了评估本发明添加剂在调节植物中的细胞分裂或增殖中(特别是在调节种子发芽和/或植物发育中)的效果，进行了一项旨在观察豆类种子的发芽和随后的幼苗发育的实验。每组14颗黑豆种子的各组放置在潮湿的棉花中，每组处于一种条件：对照组，施用水；实验组，施用以下记载的本发明的添加剂。在0，3和4天时观察并记录种子的状态，并分析豆类的发芽模式和概况。
[0079]
图4示出了在豆类种子上施用单个剂量的100μm(水溶液)的防腐肽(ktut seq id:3)或水(对照)的实验的可视结果，所有种子来自同一批次和相同商业产品包装，并保存在室温下(28℃)。分别在a、b和c中示出了在0、3和4天时在每个条件下(对照和试验)每组14个种子的各组在潮湿棉花中的发芽结果。图片示出了豆类的发芽模式存在差异。
[0080]
图5示出了如图4中所示，在施用100μm防腐肽(ktut,seq id no:3)后，以天为单位的时间(横轴)和发芽的豆类种子数量(纵轴)。
[0081]
结果示出了当施用所述添加剂时对芽或幼苗的代谢状态的实质性调节，以及种子发芽过程的延迟。因此，本发明被证明可用于调节发芽、调节种植或发芽时间，以及其他农艺或植物学优势。
[0082]
施用seq id no:15的肽得到了类似的结果，其包含seq id no:9的肽和seq id no:2的肽。
[0083]
实施例5-含有防腐肽的添加剂在保存收获后花中的试验
[0084]
在前述实施例中获得的令人惊讶的结果促使本发明人评估本发明的添加剂是否也能在其收获后保存花。已知花和花序特别敏感，并易于迅速枯萎或腐烂，这在利用这些植物部分的方面导致了技术和经济困难。特别强调观赏花卉的市场，以及特别是使用花卉或花序作为原料的草药或药品市场。在这些领域中，特别需要一种保持收获的花或花序的质量和/或完整性的方法，以便在随后的物流或工业加工中受到更少的负面影响。
[0085]
在这种背景下，作为评估花或花序的保存的实验模型，通过用水或用本发明的防腐添加剂溶液培育(将花放置在室温下数天)来评估两种不同类型的花和它们的分解/保存的情况。
[0086]
所选择的花是玫瑰(rosa-rubra)和非洲菊(gerbera)。玫瑰属植物是世界上栽培的最具观赏性的花之一。非洲菊属种被用作开花和花分生组织发育研究中的实验生物，且
由于它们含有天然香豆素衍生物，因此它们是具有植物化学和生物防治价值的花。
[0087]
在这个实施方案中，使用了seq id no:15的肽，其包含seq id no:9的肽和seq id no:2的肽。
[0088]
图6示出了在两种类型的花上施用单个剂量的100μm(水溶液)的防腐肽(seq id no:15)或水(对照组)的实验的可视结果，所有的花都来自同一批次且同一天获取，并保存在室温下(28℃)。每个容器中使用四朵花，在试验期间，茎部保持浸没在至少5厘米的各个液体中。在浸没茎的容器周围使用了铝箔，以防止光线照射。示出了在0、3和6天时在每个条件下(对照和试验)保存的花的照片结果。在a)，c)和e)中分别示出了第0、3和6天时的玫瑰图像，左边的玫瑰保持在h2o中，右边的玫瑰保存在所述防腐肽中。在b)、d)和f)中分别示出了在第0、3和6天时的非洲菊图像，左边的非洲菊保存在h2o中，右边的非洲菊保存在上述防腐肽中。所述图像清楚地示出了保存在防腐剂中的花的保存模式存在显著差异。
[0089]
图6中的结果示出了对这两种不同花种的有效保存，并为将本发明的添加剂用于观赏花和花序方面和用于具有植物化学价值的花和花序方面提供了概念验证，如非洲菊、大麻和其他植物种的情况。
[0090]
本领域技术人员将重视本文所提供的知识，并将能够在所给出的实施方案中以及所附权利要求的范围涵盖的其他变体中重复本发明。

技术特征：
1.用于保存细胞、组织和/或食品，或增加食品的保质期和食品的安全性的组合物，其特征在于其包括至少一种防腐添加剂，所述防腐添加剂包括选自seq id no:1和seq id no:4至14的肽的合成肽。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述肽在第一个氨基酸和/或最后一个氨基酸的n端部分中和/或c端部分中额外包含一个细胞穿透肽尾。3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于所述细胞穿透肽尾为seq id no:2。4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于所述肽包括seq id no:3或seq id no:15。5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其特征在于其用于保存具有农艺、植物学和/或药用价值的植物和/或水果。6.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其特征在于其用于调节具有农艺、植物学和/或药用价值的植物的发芽和/或植物发育。7.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其特征在于其用于处理花或花序，以防止或延缓枯萎、腐烂或有害生物(如细菌或真菌)的出现，和/或更长时间地维持花或花序的质量和完整性。8.用于保存细胞、组织和/或食品的添加剂，其特征在于其包括水和/或辅料，以及选自seq id no:1和seq id no:4至14的肽的合成肽组成。9.根据权利要求8所述的添加剂，其特征在于所述肽在第一个氨基酸和/或最后一个氨基酸的n端部分和/或c端部分中额外包括一个细胞穿透肽尾。10.根据权利要求9所述的添加剂，其特征在于所述细胞穿透肽尾对应于seq id no:2。11.根据权利要求10所述的添加剂，其特征在于所述肽包括seq id no:3或seq id no:15。12.根据权利要求8或11所述的添加剂，其特征在于其用于具有观赏或植物化学价值的花和/或花序的收获后保存。

技术总结
本发明涉及生物技术、植物化学和食品技术领域，并提供了一种用于保存细胞、组织和/或食品的添加剂，及合成肽制备所述添加剂的用途。除其他应用外，本发明可用于延长食品的保质期和提供更高的食品安全性。在一个实施方案中，本发明的添加剂通过单次施用所述添加剂来提供对水果的实质性保存(substantial preservation)，提供了对植物或食品的处理以防止有害生物(如细菌或真菌)的出现，例如与水果(包括草莓)的腐烂有关的那些、咖啡植物和橘子林中的苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)。在一个实施方案中，本发明的添加剂通过单次施用所述添加剂提供了对花或花序的实质性保存，提供了针对具有植物化学价值的花或花序(包括非洲菊(Gerbera)、大麻(Cannabis)等)的储存、运输和/或药物加工相关的快速枯萎、腐烂或真菌出现的替代方案。在一个实施方案中，当施用所述添加剂时，除了延缓种子发芽过程之外，本发明的添加剂还提供对芽或幼苗的代谢状态的实质性保存，并因此可用于同步发芽并调整种植或发芽的时间，以及涉及其他农艺或植物学的优势。势。势。


技术研发人员：A
受保护的技术使用者：普罗泰麦克斯生物技术以色列有限责任公司
技术研发日：2022.02.04
技术公布日：2023/10/15