羊绒细度功能基因KRT和TCHH的分型应用

羊绒细度功能基因krt和tchh的分型应用
技术领域
1.本发明涉及羊绒细度功能基因技术领域，具体为羊绒细度功能基因krt26和tchh的分型应用。


背景技术：

2.当下羊绒细度相关研究众多，功能基因研究占有一定份额。但是对krt26和tchh基因对于绒细度的影响鲜有报道。
3.羊绒细度变厚是羊绒育种的关键问题之一，但对羊绒细度的分子调控还没有系统的研究，通过序列比对和pcr-seq多态性检测lcg中krt26和tchh基因的潜在单核苷酸多态性(snps)，并通过spss软件分析其对生产性能的影响，检测到两个基因的两个snp位点(a559t和a6839g)，krt26基因中的a559t位点aa基因型为优势基因型，tchh基因中的a6839g位点ag和gg为优势基因型，aaaa为显性单倍型组合，结果表明，krt26和tchh基因与羊绒细度相关，a559t(aa)和a6839g(gg)基因型是羊绒细度的首选标记基因型，这为羊绒细度的进一步研究提供了更多的理论依据，因此亟需设计羊绒细度功能基因krt26和tchh的分型应用来解决上述问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供羊绒细度功能基因krt26和tchh的分型应用，以解决上述背景技术中提出的通过序列比对和pcr-seq多态性检测lcg中krt26和tchh基因的潜在单核苷酸多态性，并通过spss软件分析其对生产性能的影响，检测到两个基因的两个snp位点的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案，羊绒细度功能基因krt26和tchh的分型应用，包括：
6.绒山羊血样采集：
7.所述提取dna的血液样本为1毫升，所述采血后放入含有edta的采血管中，-20℃保存。
8.dna的提取：
9.所述dna提取使用ez-10旋转柱血液基因组dna纯化试剂盒，-20℃保存。
10.产绒性能数据：
11.所述羊绒数据由畜牧科学研究院进行采集与统计分析。
12.引物设计：
13.所述根据krt26和tchh序列设计引物，得到目的基因片段。
14.产物扩增：
15.所述按照对应程序进行产物扩增，所述扩增结束以后取混匀的5ul产物和1ul样品缓冲液于电泳中(1.0％琼脂糖凝胶)。
16.优选的，所述使用ezup柱式血液基因组dna抽提试剂盒提取绒山羊血液中的dna。
17.优选的，所述pcr反应结束后，选择一个清晰的、单一的目的片段，测序结果与krt26和tchh基因序列进行比较，发现两个突变位点，在krt26基因中检测到1个snp，在tchh基因中检测到1个snp。
18.优选的，所述snp序列分析检测到2个等位基因(u，u)和3个基因型(uu,uu,uu)，这两种多肽在lcg群体中的基因频率和基因型频率存在显著差异，所述t和a基因频率大于0.5为优势等位基因，tt和aa基因型为优势等位基因，所述a559t和a6839g的多肽信息含量(pic)均小于0.25，属于低等级多肽。
19.优选的，两个位点的杂合度(he)较低，说明群体的遗传变异可能较低，有效等位基因数(ne)也较低，说明群体在发生选择、突变或遗传漂变时维持等位基因的能力较差。总体不处于h-w平衡。世代遗传中基因频率和基因型频率不稳定，人工选择强度高。
20.优选的，所述加入5ulmarker作为对照，所述电泳条件设置为120v，300ma，20min，所述电泳结束之后将胶板取出放在照胶仪器中观察目的条带，所述把清晰的条带进行拍照记录，随后将合格的产物送往上海生工单向测序，进行序列比对，snp图谱分析，突变位点碱基识别和基因型确定。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
22.1、利用snp对辽宁绒山羊羊绒细度基因krt26和tchh进行基因分型，找到snp位点并对snp位点进行遗传多样性分析，而且与生产性能进行相关性分析，确定影响羊绒细度的基因型及单倍型组合，并进行be4单碱基基因编辑设计，有利于促进辽宁绒山羊的选育及改良，推动了绒用羊基因育种工作的进展，为培育更细型绒用羊提供理论支撑。
23.2、krt26基因a559t位点的aa基因型和tchh基因a6839g位点的gg基因型是生产性能的优势基因型，并通过be4单碱基基因编辑技术获得羊绒细度功能基因的单碱基突变阳性细胞和质粒，为辽宁绒山羊的育种工作提供了新的数据体系，可作为未来辽宁绒山羊育种辅助选择的分子标记。
附图说明
图1为本发明琼脂糖凝胶检测dna示意图；图2为本发明krt26和tchh基因的pcr扩增产物示意图；图3为本发明snp在krt26和tchh基因cds区的分布示意图。
具体实施方式
24.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.本发明提供的一种实施例：
26.羊绒细度功能基因krt26和tchh的分型应用，包括：
27.实验动物
28.在辽宁省畜牧科学研究院选取1540只平均体重55kg、3岁的母羊。采集后的样品无污染的保存在本实验室。
29.绒山羊血样采集
30.提取dna的血液样本为1毫升。采血后放入含有edta的采血管中，-20℃保存。
31.dna的提取
32.dna提取使用上海生物工程有限公司(中华人民共和国上海)ez-10旋转柱血液基因组dna纯化试剂盒，-20℃保存。
33.产绒性能数据
34.辽宁绒山羊的羊绒数据由辽宁省畜牧科学研究院进行采集与统计分析。
35.引物设计
36.根据krt26和tchh序列(ncbi参考序列:nc_030826.1，nc_030810.1)设计引物，得到目的基因片段(表1)。引物由上海生物工程有限公司(中华人民共和国上海)合成。
37.表1 krt26和tchh基因目的片段扩增及分型引物
[0038][0039]
产物扩增
[0040]
pcr反应体系为50ul(表2)，pcr反应条件如表所示(表3)，按照对应程序进行产物扩增，扩增结束以后取混匀的5ul产物和1ul样品缓冲液于电泳中(1.0％琼脂糖凝胶)，同时加入5ulmarker作为对照，电泳条件设置为120v，300ma，20min，电泳结束之后将胶板取出放在照胶仪器中观察目的条带，把清晰的条带进行拍照记录，随后将合格的产物送往上海生工单向测序，进行序列比对，snp图谱分析，突变位点碱基识别和基因型确定。
[0041]
表2 pcr反应体系
[0042][0043]
表3 pcr反应条件
[0044][0045]
实验结果
[0046]
绒山羊血液dna模板
[0047]
使用ezup柱式血液基因组dna抽提试剂盒提取绒山羊血液中的dna。
[0048]
2krt26和tchh基因pcr产物和测序
[0049]
pcr反应结束后，选择一个清晰的、单一的目的片段。测序结果与krt26和tchh基因序列进行比较，发现两个突变位点。在krt26基因中检测到1个snp(a559t)，在tchh基因中检测到1个snp(a6839g)。
[0050]
krt26和tchh基因多态遗传特性
[0051][0052][0053][0054]
snp序列分析检测到2个等位基因(u，u)和3个基因型(uu,uu,uu)。我们可以看到，这两种多肽在lcg群体中的基因频率和基因型频率存在显著差异(表2)。t和a基因频率大于0.5为优势等位基因，tt和aa基因型为优势等位基因。a559t和a6839g的多肽信息含量(pic)均小于0.25，属于低等级多肽。两个位点的杂合度(he)较低，说明群体的遗传变异可能较低，有效等位基因数(ne)也较低，说明群体在发生选择、突变或遗传漂变时维持等位基因的能力较差。总体不处于h-w平衡。世代遗传中基因频率和基因型频率不稳定，人工选择强度高。
[0055]
表4 krt26和tchh基因有效位点
[0056][0057]
krt26和tchh基因替代效应
[0058]
tchh基因a6839g位点的加性效应值为负，说明该位点等位基因的自然突变和替换为正效应，可提高羊绒生产性能143.156％。krt26基因a559t位点加性效应值为阳性，负向调控羊绒性能，使纯现金性能下降69.415％(表5)。
[0059]
表5 krt26和tchh基因替代效应分析
[0060][0061]
snp与羊绒细度及产绒性能的关联分析
[0062]
结果表明(表6)在a559t位点，aa基因型的羊绒长度最长，羊绒产量最高，净出绒率最高。aa基因型个体的细度和变异系数最小。因此，aa基因型是羊绒生产性能的优势基因型。在a6839g位点，gg基因型个体的羊绒长度最长，羊绒细度为0～80。aa基因型个体的羊绒产量最高。ag基因型的单绒细度最小，变异程度最低，羊绒产量最高。因此，snp位点的g等位基因与羊绒生产性能正相关。
[0063]
表6 krt26和tchh基因多态位点的产绒性能分析
[0064]
[0065][0066]
krt26和tchh基因两个snp位点的单倍型组合
[0067]
在krt26基因的a559t中发现aa、at和tt三种基因型。在tchh基因的a6839g位点有aa、ag和gg三种基因型。通过v2检验，数据可靠，进行单倍型分析。通过shesis(http://analysis.bio-x.cn/myanalysis.php)分析，可形成3个单倍型(h1:aa；h2:ta和h3:tg)，可形成9个单倍型组合。然而，只有5种单倍型组合(h1h1:aaaa；h1h2:u；h2h2:ttaa；h2h3:ttag；其中h3h2:ttga和h3h3:ttgg)(表7)。
[0068]
表7 snp位点的单倍型组合
[0069][0070]
krt26和tchh基因基因单倍型组合与产绒性能相关性分析
[0071]
单倍型组合h2h3:ttag是绒细度最小、变异系数最小、净绒率最高的优势组合。单倍型组合h3h3:ttgg的羊绒长度最长。单倍型组合h1h2:ataa的羊绒产量最高。(表8)
[0072]
表8 krt26和tchh基因两个位点对羊绒性状的相关分析
[0073]
[0074]
羊绒细度关键基因krt26和tchh基因单碱基编辑载体设计部分
[0075]
(1)构建目的基因-sgrna表达载体
[0076]
①
从ncbi上获取目的基因krt26和tchh，针对cds区域设计sgrna。
[0077]
②
用限制性内切酶bsai-hfv2(neb)切割载体形成粘性末端，对u6-grna质粒(u6-grna-ef1α-egfp-2a-puro)和be4-grna质粒(ef1α-be4-nspcas9(d10
[0078]
a)-2
×
ugl-nls-6
×
his-2a-puro)进行线性化处理。
[0079]
③
合成并命名后续试验所需要的寡核苷酸片段。其中krt26-u6-sgrna1、krt26-u6-sgrna2、krt26-u6-sgrna3、krt26-u6-sgrna4和tchh-u6
[0080]-sgrna1、tchh-u6-sgrna2、tchh-u6-sgrna3、tchh-u6-sgrna4用于细胞转染，krt26-be4-sgrna1、krt26-be4-sgrna2、krt26-be4-sgrna3、krt26-be4-sgrna4和tchh-be4-sgrna1、tchh-be4-sgrna2、tchh-be4
[0081]-sgrna3、tchh-be4-sgrna4用于体外转录。
[0082]
④
寡核苷酸上下游混合放入金属仪进行退火后两条单链dna片段可形成带有bsai粘性末端双链dna小片段，这个小片段可以与线性化载体片段相连。将稀释合成好的sgrna两条对应单链进行等量混合，混匀离心后放入pcr仪中进行退火。
[0083]
⑤
构建sgrna表达载体。将线性化的u6-sgrna与be4-sgrna质粒与sgrna退火后的双链dna小片段利用t4dna连接酶进行连接。把混合后的体系充分涡旋混匀后进行离心，放入金属浴中25℃保持10min即可连接成功。
[0084]
⑥
连接产物的转化。将连接的产物用移液枪吸取并全部打入dh5α感受态细胞中，转化后均匀涂抹在含有氨苄霉素或者卡那霉素的lb固体培养板子上转化。其中u6-sgrna带有氨苄霉素抗性基因，be4-sgrna带有卡那霉素抗性基因。过夜生长后，第二天，每个板子挑取4个单菌落放入含有相应抗生素培养液的1.5ml离心管中。摇晃数小时后(6h-8h)，送往生物公司测序。
[0085]
⑦
根据测序结果，选择返还连接成功质粒对应菌液。菌液返还后将部分菌液转移到玻璃试管中，加入12ml含有相应抗生素的培养液，编号后试管放置到37℃恒温摇床上进行培养，24h培养后使用去内毒质粒提取试剂盒hipureplasmidminiprepkit提取质粒，并测量质粒浓度以及od值。使用灭菌30％甘油对菌液进行保存，将30％甘油与菌液等体积混合，封口后转移到-80℃冰箱中保存。
[0086]
(2)细胞嘌呤霉素浓度筛选
[0087]
①
将冻存于液氮中的第二代辽宁绒山羊胎儿成纤维细胞进行复苏。复苏后的细胞通过传代培养至第五代。这个时间段细胞，细胞都培养在100mm培养皿中。
[0088]
②
待第五代细胞生长密度达到80％左右后，将一半数目的细胞消化收集并均匀接种至1个24孔细胞板中。
[0089]
③
待细胞密度汇集至80％时，以0.3μg/ml的嘌呤霉素为起始浓度，每个孔按照浓度梯度分别添加一定浓度的嘌呤霉素。浓度排列如下：0.3μg/ml、0.4μg/ml、0.5μg/ml、到1.3μg/ml。每个浓度的筛选重复两次。以加药后48h为终止点，在该时间段结束后观察各孔细胞存活情况，依然有20％细胞存活的孔对应的浓度作为最终药筛浓度，并用于后续试验。
[0090]
(3)细胞培养与质粒转染
[0091]
①
将冻存于液氮中的第二代辽宁绒山羊胎儿成纤维细胞进行复苏，复苏后培养至
第五代。在此过程中，细胞都培养在100mm培养皿中。
[0092]
②
待第五代细胞生长密度达到80％左右后，将细胞消化收集并均匀接种到6孔板培养皿中，待细胞生长密度处于40％-50％时，利用lipo6000
tm
转染试剂把质粒共转染到细胞中。每个sgrna转染3个孔，每个孔转染u6-sgrna质粒的量为0.75μg，be4-sgrna质粒的量为2.25μg。
[0093]
③
转染6h后更换培养液，继续培养48h后加入上一步确定浓度的嘌呤霉素，筛选时间为48h，筛选过后，再次更换培养液，培养细胞密度至60％。
[0094]
(4)细胞编辑效率检测
[0095]
①
细胞密度生长到60％后，使用0.25％胰蛋白酶消化细胞5min，加入等量培养液终止消化，吹打细胞并收集细胞悬液，低速离心获得细胞沉淀，使用通用柱式dna提取试剂盒提取细胞基因组dna。用核酸定量仪测量dna的浓度和od值，并使用琼脂糖凝胶电泳测定提取dna的质量。
[0096]
②
设计引物扩增目标sgrna所在的序列。分别设计引物时将4个sgrna序列共同包含在引物中间，该引物称为krt26和tchh基因靶位点检测引物，使用进行pcr扩增。
[0097]
③
取3μlpcr产物在0.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，若野生型山羊dna基因组扩增片段条带单一、清晰明亮、条带大小符合预期，则将剩余pcr产物全部送往生物公司进行测序，等测序结果返还后，使用碱基编辑效率在线分析网站editr(https://moriaritylab.shinyapps.io/editr_v10/)对阳性细胞的编辑效率进行统计。
[0098]
(5)u6-sgrna体外转录
[0099]
①
复苏菌液。取-80℃冰箱中保存的菌液全部取出并倒入灭菌试管中，加入10ml含有氨苄霉素的培养液进行摇菌，在培养箱中培养时间为12h以上。将菌液倒入10ml离心管中，8000rpm，离心5min，去掉上清。然后按照plasmidminiprepkit的说明书提取质粒，使用核酸定量仪测定浓度和od值。
[0100]
②
线性化u6-sgrna质粒。用限制性内切酶pmei对u6-sgrna质粒进行线性化处理。所有组分加入1.5ml离心管，充分混匀后离心，放置于37℃培养箱过夜孵育酶切，第二天再次离心，把离心管放入金属浴中75℃保持20min，使酶失活。
[0101]
③
使用rnasecurereagent来降解体系内存在的rna酶，并根据模板产物的体积，调至酶的终浓度为1x，混匀后放置在金属浴中60℃孵育10min，除去体系中的rna酶。
[0102]
④
利用minelutepcrpurificationkit回收无rnase的线性化片段。需要注意的是，此过程应继续保持无酶化环境，操作的过程中在外界环境继续喷涂rnaase抑制剂，来保证后续体外转录的无酶环境。
[0103]
⑤
体外转录。在转录之前，应该提前准备好冰，并将冰放置于喷涂rnaase抑制剂的冰盒中，并且环境需要再次处理以保证无酶条件。按照体外转录试剂盒t7ultrakit的实验步骤操作。混合结束后，将混合体系放入金属浴中37℃恒温孵育2h。同时，有以下注意事项：10xt7reactionbuffer在低温时会产生结晶，需要室温溶解后离心。加样过程中用镊子将除酶以外所有的试剂拿出并放于离心管架上，解冻后涡旋，短暂离心后，再放置于冰上。体系混合在常温环境进行，试剂添加顺序按照表上
顺序所示，最后添加酶(t7enzymemix)，样品全部加完后用移液枪轻轻吹打混匀。
[0104]
⑥
加入1μlturbodnase，去除体系中的线性化质粒dna模板。混合后将离心管放置于金属浴中孵育，温度为恒温37℃，时间为15min。
[0105]
⑦
加poly(a)尾。对转录出的rna进行加尾处理，这样可以使转录出的rna更加稳定。吸取2.5μl于离心管中，放置于-80℃冰箱中，留作最后提取样品的对照组，验证是否纯化成功。随后加入4μle-pap，轻轻混匀，放置在37℃金属浴中，孵育30-45min，结束后将离心管重新放置于冰中。
[0106]
⑧
回收，按照rneasyminikit说明书步骤进行回收。
[0107]
⑨
吸出2μl回收后产物放置于新的1.5ml收集管底部，其中1.5μl用于测浓度，另外的0.5μl加2μl无酶水混合后，再加入3μl6
×
buffer混匀点样，其余产物置于-80℃冰箱中保存。琼脂糖凝胶电泳条件为1％凝胶，电压200v，时间20min。
[0108]
⑩
回收后产物保存于-80℃冰箱中。
[0109]
(6)be4-sgrna体外转录
[0110]
①
复苏正确连接对应寡核苷酸片段的be4-sgrna菌液，从-80℃冰箱中取出保存的菌液全部倒入灭菌试管中，加入10ml含有卡那霉素的培养液进行摇菌，在培养箱中培养时间为12h以上。将菌液倒入10ml离心管中，8000rpm，离心5min，去掉上清。然后按照hipureplasmidminiprepkit的说明书提取质粒，并测定浓度和od值。
[0111]
②
使用高保真酶primestarhsdnaploymerase，以连接好的be4-sgrna质粒作为模板，扩增目的片段。
[0112]
③
使用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增条带，一部分pcr产物到生物公司进行测序，检测目的条带是否正确，以及检测是否在pcr过程中发生污染。
[0113]
④
若产物无污染，则将剩余产物使用quickgelextractionkit试剂盒进行回收。回收后的产物使用rnasecurereagent来降解体系内存在的rna酶，并根据模板产物的体积，调至试剂的终浓度为1x，混匀后放置在金属浴中60℃孵育10min，除去体系中的rna酶。
[0114]
⑤
使用minelutepcrpurificationkit回收无rnase的线性化片段，回收结束后测量回收产物浓度以及od值。
[0115]
⑥
sgrna体外转录。选用megashortscriptkit试剂盒进行体外转录。采取10μl体系进行反应，模板加入不多于4μl(400-600ng)，其他组分按照说明书加入相应减半的体积的试剂，混合后用移液枪轻轻吹打并离心，放置于金属浴中恒温37℃孵育，时间为4h。
[0116]
⑦
加入1μlturbodnase，去除体系中残余的dna模板，在金属浴中37℃恒温孵育15min。
[0117]
⑧
sgrna回收。对转录产物进行回收，依据megaclearkit说明书进行操作。
[0118]
⑨
将回收后产物使用琼脂糖凝胶电泳进行检测，吸取1.5μl的产物与2μl的6xbuffer进行混合，琼脂糖凝胶电泳条件为1％凝胶，电压120v，时间20min。
[0119]
⑩
回收后产物保存于-80℃冰箱中。
[0120]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权
利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

技术特征：
1.羊绒细度功能基因krt26和tchh的分型应用，其特征在于，包括：绒山羊血样采集：所述提取dna的血液样本为1毫升，所述采血后放入含有edta的采血管中，-20℃保存。dna的提取：所述dna提取使用ez-10旋转柱血液基因组dna纯化试剂盒，-20℃保存。产绒性能数据：所述羊绒数据由畜牧科学研究院进行采集与统计分析。引物设计所述根据krt26和tchh序列设计引物，得到目的基因片段。产物扩增所述按照对应程序进行产物扩增，所述扩增结束以后取混匀的5ul产物和1ul样品缓冲液于电泳中(1.0％琼脂糖凝胶)。2.根据权利要求1所述的羊绒细度功能基因krt26和tchh的分型应用，其特征在于：所述使用ezup柱式血液基因组dna抽提试剂盒提取绒山羊血液中的dna。3.根据权利要求1所述的羊绒细度功能基因krt26和tchh的分型应用，其特征在于：所述pcr反应结束后，选择一个清晰的、单一的目的片段，测序结果与krt26和tchh基因序列进行比较，发现两个突变位点，在krt26基因中检测到1个snp，在tchh基因中检测到1个snp。4.根据权利要求3所述的羊绒细度功能基因krt26和tchh的分型应用，其特征在于：所述snp序列分析检测到2个等位基因(u，u)和3个基因型(uu,uu,uu)，这两种多肽在lcg群体中的基因频率和基因型频率存在显著差异，所述t和a基因频率大于0.5为优势等位基因，tt和aa基因型为优势等位基因，所述a559t和a6839g的多肽信息含量(pic)均小于0.25，属于低等级多肽。5.根据权利要求4所述的羊绒细度功能基因krt26和tchh的分型应用，其特征在于：两个位点的杂合度(he)较低，说明群体的遗传变异可能较低，有效等位基因数(ne)也较低，说明群体在发生选择、突变或遗传漂变时维持等位基因的能力较差。总体不处于h-w平衡。世代遗传中基因频率和基因型频率不稳定，人工选择强度高。6.根据权利要求1所述的羊绒细度功能基因krt26和tchh的分型应用，其特征在于：所述加入5ulmarker作为对照，所述电泳条件设置为120v，300ma，20min，所述电泳结束之后将胶板取出放在照胶仪器中观察目的条带，所述把清晰的条带进行拍照记录，随后将合格的产物送往上海生工单向测序，进行序列比对，snp图谱分析，突变位点碱基识别和基因型确定。

技术总结
本发明涉及羊绒细度功能基因技术领域，具体为羊绒细度功能基因KRT26和TCHH的分型应用，具体为羊绒细度功能基因KRT26和TCHH的分型应用，包括：绒山羊血样采集：所述提取DNA的血液样本为1毫升，所述采血后放入含有EDTA的采血管中，-20℃保存。DNA的提取：所述DNA提取使用EZ-10旋转柱血液基因组DNA纯化试剂盒，-20℃保存。产绒性能数据：所述羊绒数据由畜牧科学研究院进行采集与统计分析。引物设计：所述根据KRT26和TCHH序列设计引物，得到目的基因片段。本发明确定影响羊绒细度的基因型及单倍型组合，并进行BE4单碱基基因编辑设计，有利于促进辽宁绒山羊的选育及改良，推动了绒用羊基因育种工作的进展，为培育更细型绒用羊提供理论支撑。理论支撑。


技术研发人员：王泽英 秦宇婷 徐亚男 郭素平 丛玉艳 豆兴堂 韩迪 张宇 顾铭 陈芮 孙迎港 吴彦智 乔艳军 张秋 李茜 汪小微
受保护的技术使用者：沈阳农业大学
技术研发日：2022.10.19
技术公布日：2023/10/20