PTBP1抑制剂在制备用于治疗胶质母细胞瘤的药物中的应用

ptbp1抑制剂在制备用于治疗胶质母细胞瘤的药物中的应用
技术领域
1.本发明属于基因治疗领域，具体地，涉及ptbp1抑制剂在制备用于治疗胶质母细胞瘤的药物中的应用。


背景技术：

2.根据2021年世界健康组织（world health organization，who）的新分类，成人弥漫型胶质瘤基于异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，idh）的突变和1p19q的缺失情况被分为三种，即：星形细胞瘤，idh突变型；少突胶质细胞瘤，idh突变和1p19q共缺失型；胶质母细胞瘤，idh野生型。其中，胶质母细胞瘤占到了70%以上，发病率为3.23/100000人。
3.目前，对胶质母细胞瘤最为合理的治疗方案包括手术切除，放疗，化疗。然而，胶质母细胞瘤病人的中位生存期仅仅只有不到2年。尽管针对胶质母细胞瘤的多种治疗方案正在同步推进，该疾病的现状仍然没有根本性的改变。
4.近来，通过改变一些决定细胞分化方向的基因或者转录因子从而实现细胞之间高效率转化的细胞重编程技术引起了神经科学家的注意。但是目前仍然没有相关研究和实践将细胞重编程技术应用到胶质母细胞瘤上。


技术实现要素：

5.本发明旨在提供一种利用细胞重编程技术抑制胶质母细胞瘤的增殖，从而达到治疗胶质母细胞瘤的目的，为了达到该目的，发明人意外地发现：敲低ptbp1能够将u87胶质母细胞瘤细胞重编程为神经元样细胞，并且能够显著抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖；在体内实验中，ptbp1敲低的u87胶质母细胞瘤细胞来源的异生物也表现出明显的生长减慢，这为胶质母细胞瘤的治疗提供了一种有潜力，可行的治疗新思路，从而完成本发明。
6.本发明第一方面提供ptbp1抑制剂在制备用于将胶质母细胞瘤细胞重编程为神经元的制剂中的应用，其中，所述ptbp1抑制剂能够敲除ptbp1基因或者敲低ptbp1基因的表达水平。
7.ptbp1（polypyrimidine tract binding protein 1）作为一个rna结合蛋白被证明能够在体外将多种细胞重编程为神经元。
8.在本发明中，可以利用任意敲除基因或敲低基因的表达水平的方法对ptbp1基因进行敲除或对ptbp1基因的表达水平进行敲低。所述敲除基因是指将基因的序列从基因组中去除或仅去除基因的部分序列如表达元件，使得基因完全不转录，或者直接降解基因的转录产物即mrna，使得其不能翻译蛋白质。所述敲低基因的表达水平是指降低基因的转录水平或mrna的翻译水平，使得最终基因的转录水平和/或翻译水平降低，自然地，基因表达的蛋白水平降低，从而使得基因的功能降低。
9.在本发明的一些实施方案中，所述ptbp1抑制剂在rna水平敲除ptbp1基因或者敲低ptbp1基因的表达水平。
10.在本发明的一些实施方案中，所述ptbp1抑制剂选自以下中的一种：
（1）靶向ptbp1基因mrna的sirna；（2）靶向ptbp1基因mrna的shrna；（3）含有靶向ptbp1基因mrna的shrna的载体；（4）含有靶向ptbp1基因mrna的shrna的载体的病毒。
11.其中，sirna，即小干扰rna，有在3’端有两个碱基的游离，可激活rna干扰，通过与目标mrna互补结合序列特异性地实现mrna降解。
12.shrna，即短发夹rna，包含一个环结构，可加工成sirna，也可通过与目标mrna互补结合序列特异性地实现靶mrna降解。
13.在本发明的一些实施方案中，所述ptbp1抑制剂为shrna，所述shrna的核苷酸序列如seq id no. 1所示。
14.在本发明的一些具体实施方案中，所述病毒为慢病毒。
15.在本发明的一些优选实施方案中，所述含有shrna的慢病毒的制备方法如下：将4μg提纯后的sh-luci和sh-ptbp1慢病毒载体与辅助包装质粒（pmdl，vsv-g，prev）一起转化进入hek-293t细胞，14小时后换液。随后收集24小时、48小时的细胞上清用于u87细胞的感染。
16.在本发明的另一些实施方案中，所述ptbp1抑制剂为能够敲除ptbp1基因或者敲低ptbp1基因的表达的crispr/cas9系统。
17.在本发明的一些具体实施方案中，所述crispr/cas9系统包括以下组合中的一种：（1）包括特异性grna和cas9蛋白的组合；所述特异性grna能够特异性结合ptbp1基因的dna片段；（2）包括特异性dna分子和cas9蛋白的编码基因的组合，所述特异性dna分子转录得到所述特异性grna；（3）包括具有所述特异性dna分子的质粒和具有所述cas9蛋白的编码基因的质粒的组合，所述具有所述特异性dna分子的质粒转录得到具有所述特异性grna的rna分子；（4）包括特异重组质粒的组合，所述特异重组质粒表达所述特异dna分子和所述cas9蛋白的编码基因。
18.本发明第二方面提供ptbp1抑制剂在制备用于治疗胶质母细胞瘤的药物中的应用。
19.进一步地，所述治疗胶质母细胞瘤是指抑制胶质母细胞瘤增殖。
20.更进一步地，所述药物能够将胶质母细胞瘤细胞重编程为神经元从而抑制胶质母细胞瘤增殖。
21.在本发明的一些实施方案中，所述ptbp1抑制剂在rna水平敲除ptbp1基因或者敲低ptbp1基因的表达水平。
22.在本发明的一些实施方案中，所述ptbp1抑制剂选自以下中的一种：（1）靶向ptbp1基因mrna的sirna；（2）靶向ptbp1基因mrna的shrna；（3）含有靶向ptbp1基因mrna的shrna的载体；（4）含有靶向ptbp1基因mrna的shrna的载体的病毒。
23.其中，sirna，即小干扰rna，有在3’端有两个碱基的游离，可激活rna干扰，通过与目标mrna互补结合序列特异性地实现mrna降解。
24.shrna，即短发夹rna，包含一个环结构，可加工成sirna，也可通过与目标mrna互补结合序列特异性地实现靶mrna降解。
25.在本发明的一些实施方案中，所述ptbp1抑制剂为shrna，所述shrna的核苷酸序列如seq id no. 1所示。
26.在本发明的一些具体实施方案中，所述病毒为慢病毒。
27.在本发明的另一些实施方案中，所述ptbp1抑制剂为能够敲除ptbp1基因或者敲低ptbp1基因的表达的crispr/cas9系统。
28.在本发明的一些具体实施方案中，所述crispr/cas9系统包括以下组合中的一种：（1）包括特异性grna和cas9蛋白的组合；所述特异性grna能够特异性结合ptbp1基因的dna片段；（2）包括特异性dna分子和cas9蛋白的编码基因的组合，所述特异性dna分子转录得到所述特异性grna；（3）包括具有所述特异性dna分子的质粒和具有所述cas9蛋白的编码基因的质粒的组合，所述具有所述特异性dna分子的质粒转录得到具有所述特异性grna的rna分子；（4）包括特异重组质粒的组合，所述特异重组质粒表达所述特异dna分子和所述cas9蛋白的编码基因。
29.本发明的有益效果相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：本发明利用ptbp1抑制剂敲低ptbp1，能够显著抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖，从而可以治疗胶质母细胞瘤，具有重要的临床价值。
30.本发明利用ptbp1抑制剂敲低ptbp1，能够将胶质母细胞瘤细胞重编程为神经元样细胞，从而可以改善胶质母细胞瘤患者的神经功能预后。
附图说明
31.图1示出了u87细胞sh-luci和sh-ptbp1慢病毒的感染效率。
32.图2示出了u87细胞sh-luci和sh-ptbp1慢病毒转染sh-ptbp1和sh-ptbp1后ptbp1表达水平。
33.图3示出了u87胶质母细胞瘤细胞系被重编程为神经元样细胞的荧光图。
34.图4示出了u87胶质母细胞瘤细胞系被重编程为神经元样细胞的统计图。
35.图5示出了u87胶质母细胞瘤细胞系重编程后ki67增殖指标被显著抑制的荧光图。
36.图6示出了u87胶质母细胞瘤细胞系重编程后ki67增殖指标被显著抑制的统计图。
37.图7示出了u87胶质母细胞瘤细胞系重编程后edu增殖指标被显著抑制的荧光图。
38.图8示出了u87胶质母细胞瘤细胞系重编程后edu增殖指标被显著抑制的统计图。
39.图9示出了ptbp1敲低后的u87胶质母细胞瘤细胞系来源的异生物生长速度显著减慢的活体成像图。
40.图10示出了ptbp1敲低后的u87胶质母细胞瘤细胞系来源的异生物生长速度显著减慢的统计图。
具体实施方式
41.除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本技术中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本技术的提交日期同步的。在适用的情况下，本技术中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本技术中提供的任何定义不一致，则以本技术中提供的术语定义为准。
42.本技术中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本技术中。
43.术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本技术中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本技术中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由
……
组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由
……
组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。
44.为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
45.实施例以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
46.除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
47.那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
48.下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均按照《分子克隆实验指南》（第四版）（j.萨姆布鲁克、m.r.格林，2017）一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。其他实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
49.实施例1 敲低ptbp1的慢病毒的获得与验证根据ptbp1基因的mrna序列设计shrna，命名为sh-ptbp1，序列如下（seq id no. 1）：tgctgttgacagtgagcgcaggattcaagttcttccagaatagtgaagccacagatgtattctggaagaacttgaatcctttgcctactgcctcgga针对luci设计shrna，命名为sh-luci，序列如下（seq id no. 2）：
tgctgttgacagtgagcgcaggaattataatgcttatctatagtgaagccacagatgtatagataagcattataattcctatgcctactgcctcggash-ptbp1经过pcr扩增后用限制性核酸内切酶切出粘性末端接入慢病毒载体并转化入大肠杆菌进行扩增，提纯。随后，将4μg提纯后的sh-luci和sh-ptbp1慢病毒载体与辅助包装质粒（pmdl，vsv-g，prev）一起转化进入hek-293t细胞，14小时后换液。随后收集24小时、48小时的细胞上清用于u87细胞的感染。感染后u87细胞的ptbp1表达改变由实时荧光定量pcr进行检测。如图1和图2所示，u87细胞sh-luci和sh-ptbp1慢病毒的感染效率达到95%以上，sh-ptbp1组中ptbp1表达被敲低至21.77%。
50.实施例2 胶质母细胞瘤细胞重编程本实施例中，发明人利用dmem+10%的胎牛血清培养人胶质母细胞瘤细胞系u87（atcc htb-14bsl 1）：u87细胞以20000个/孔接种于24孔板，放入含有5%二氧化碳的37℃培养箱内培养。隔天加入0.5ml对照luci慢病毒和实施例制备的敲低ptbp1的慢病毒（携带m-cherry标记）以感染u87细胞。24小时后换成正常培养基（dmem（11995040，gibco）+10%胎牛血清（10099141，gibco）+1%双抗（15140122，gibco））培养1天，随后将用专门诱导神经元的培养基（包含 dmem，f12（11765054，gibco），neurobasal（21103049，gibco），n2 （17502001，gibco），b27（17504044，gibco），forskolin（s2449，selleck，10
ꢀµ
m），和dorsomorphin（s7840，selleck，1
ꢀµ
m））进行培养直至完成细胞转换。
51.神经元指标免疫荧光染色：将重编程14天后的u87细胞用4%多聚甲醛固定15分钟，含有5% bsa的pbst封闭30分钟后加入免疫荧光一抗tuj1和map2（abcam）过夜进行染色。染色后用pbs洗涤细胞3次，每次10分钟，加入免疫荧光二抗和dapi（abcam）进行荧光标记。染色完毕后用抗荧光淬灭剂和指甲油进行封片，随后用奥林巴斯共聚焦显微镜进行拍摄。结果如图3和图4所示，ptbp1敲低的u87细胞在重编程后成功表达了神经元指标tuj1和map2。
52.增殖指标免疫荧光染色：将重编程7天后的u87细胞用4%多聚甲醛固定15分钟，含有5%bsa的pbst封闭30分钟后加入免疫荧光一抗tuj1和ki67（abcam）过夜进行染色。染色后用pbs洗涤细胞3次，每次10分钟，加入免疫荧光二抗和dapi（abcam）进行荧光标记。染色完毕后用抗荧光淬灭剂和指甲油进行封片，随后用奥林巴斯共聚焦显微镜进行拍摄。结果如图5和图6所示，ptbp1敲低的u87细胞在重编程后成功表达了神经元指标tuj1，并且增殖指标ki67的表达显著下降。
53.增殖指标免疫荧光染色：在重编程7天后的u87细胞培养基中加入终浓度为10μm的edu培养2小时后用4%多聚甲醛固定15分钟，含有5% bsa的pbst封闭30分钟后加入免疫荧光一抗tuj1（abcam）过夜进行染色。染色后用pbs洗涤细胞3次，每次10分钟后进行点击反应，加入免疫荧光二抗和dapi（abcam）进行荧光标记。染色完毕后用抗荧光淬灭剂和指甲油进行封片，随后用奥林巴斯共聚焦显微镜进行拍摄。结果如图7和图8所示，ptbp1敲低的u87细胞在重编程后成功表达了神经元指标tuj1，并且增殖指标edu的表达显著下降。
54.实施例3 动物实验本实施例中，将实施例1中对照luci和敲低ptbp1病毒感染后的胶质母细胞瘤细胞系u87用10%胎牛血清的高糖dmem培养至对数生长期，用pbs洗和0.25%胰酶消化，pbs收集细胞制成细胞悬液，调整细胞浓度为1000000/μl后种植到裸鼠脑内。
55.裸鼠原位脑胶质瘤模型的建立：将带有荧光素酶（luciferase）的感染对照luci和
敲低ptbp1慢病毒的u87细胞种植到大鼠右侧矢状缝前方1mm，中线右方2mm位置的硬脑膜下3mm位置。采用spf级balb/c-nu裸鼠10只，每只20g，均为雄性，购自史莱克实验动物中心。裸鼠经异氟烷气体麻醉后，固定于立体定位仪上（型号68001，深圳瑞沃德生命科技有限公司）。剪去头顶部毛发，碘伏消毒，切开头皮，暴露颅骨。确定位置后，打开骨窗，在此位置用小型颅钻开一个小口，然后用5μl微量注射器抽取u87细胞悬液（含500000个细胞），沿骨孔垂直进针至硬脑膜下3mm，缓慢注射10分钟后留针5分钟，拔针之后用骨腊封闭骨孔，缝合头皮。用perkinelmer ivis lumina x5活体成像系统对肿瘤的生长进行监测，结果如图9和图10所示。结果显示ptbp1敲低后的u87细胞在体内的生长速度显著减慢。
56.在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。

技术特征：
1.ptbp1抑制剂在制备用于将胶质母细胞瘤细胞重编程为神经元的制剂中的应用，其特征在于，所述ptbp1抑制剂能够敲除ptbp1基因或者敲低ptbp1基因的表达水平。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ptbp1抑制剂为选自以下中的一种：（1）靶向ptbp1基因mrna的sirna；（2）靶向ptbp1基因mrna的shrna；（3）含有靶向ptbp1基因mrna的shrna的载体；（4）含有靶向ptbp1基因mrna的shrna的载体的病毒。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述shrna的核苷酸序列如seq id no. 1所示。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述病毒为慢病毒。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ptbp1抑制剂为能够敲除ptbp1基因或者敲低ptbp1基因的表达的crispr/cas9系统。6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述crispr/cas9系统包括以下组合中的一种：（1）包括特异性grna和cas9蛋白的组合；所述特异性grna能够特异性结合ptbp1基因的dna片段；（2）包括特异性dna分子和cas9蛋白的编码基因的组合，所述特异性dna分子转录得到所述特异性grna；（3）包括具有所述特异性dna分子的质粒和具有所述cas9蛋白的编码基因的质粒的组合，所述具有所述特异性dna分子的质粒转录得到具有所述特异性grna的rna分子；（4）包括特异重组质粒的组合，所述特异重组质粒表达所述特异dna分子和所述cas9蛋白的编码基因。7.ptbp1抑制剂在制备用于治疗胶质母细胞瘤的药物中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述治疗胶质母细胞瘤是指抑制胶质母细胞瘤增殖。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物能够将胶质母细胞瘤细胞重编程为神经元从而抑制胶质母细胞瘤增殖。

技术总结
本发明公开了PTBP1抑制剂在制备用于治疗胶质母细胞瘤的药物用途，属于基因治疗领域，其中，所述PTBP1抑制剂能够敲除PTBP1基因或者敲低PTBP1基因的表达水平。利用PTBP1抑制剂敲低PTBP1能够将胶质母细胞瘤细胞重编程为神经元样细胞，进而能够显著抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖，从而可以治疗胶质母细胞瘤，具有重要的临床价值。的临床价值。的临床价值。


技术研发人员：杨建静 诸葛启钏 王堪凯 赵佩琦
受保护的技术使用者：温州医科大学附属第一医院
技术研发日：2022.01.18
技术公布日：2023/10/20