一种磷酸转移酶突变体及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物酶催化技术领域，具体涉及磷酸转移酶突变体及其在催化核苷酸和磷酸供体反应生产5
’‑
核苷酸的应用。


背景技术：

2.phoc基因编码的酸性磷酸酶，具有磷酸转移酶活性，能够催化核苷类底物生成核苷酸，例如能够催化鸟苷或肌苷生成鸟苷酸(gmp)或肌苷酸(imp)，imp及gmp在食品领域及医药领域都有较多应用。
3.在食品领域，imp和gmp主要是应用于生产呈味核苷酸二钠，即i+g，其与味精(谷氨酸钠)混合时，鲜度提高数倍至数十倍。达到相同效果其用量仅为味精的2-5％，可大大降低成本。在医药领域，imp可作为药物治疗白细胞和血小板减少症，对各种急慢性肝炎、肝原性心脏病及视神经炎等眼科疾病具有一定疗效。
4.目前制备5
’‑
核苷酸的方法主要有化学合成法，发酵法，酶解法及生物催化法四种。化学合成法主要以核苷为原料，进行磷酸酯化反应。由于其在磷酸化反应前需使用适当的保护基对核苷上核糖的2’，3’位羟基进行保护，其保护、去保护步骤会使反应整体产率下降。
5.发酵法又包括直接发酵法和发酵-转化法。直接发酵法一般采用玉米浆等天然含有生物素的物质为培养基，利用枯草杆菌、产氨短杆菌生产菌直接产生imp、gmp，工艺相对简单，但其产量低，难以工业化。发酵-转化法是利用肌苷、鸟苷生产菌，先生成肌苷或鸟苷，再通过化学磷酸化法磷酸化为imp和gmp。这一方法产率高、周期短，发酵条件易控制，为磷酸化提供了廉价的核苷原料，且磷酸化产物单一、核苷转化率一般均可达98％以上，大幅度地降低了生产成本。
6.酶解法包括rna酶解法和菌体自溶法。rna酶解法是先从菌体中提取rna，制备5
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磷酸二酯酶，经过rna酶解及单核苷酸的分离、纯化步骤制备。但酶解法一次会得到4种核苷酸，虽然酶反应收率较高，但在后续提取过程中，分离纯化得到4种高纯度产品难度大，导致生产周期长，提取工艺繁琐，产品纯度不高。自溶法是利用菌体细胞内富含的5
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磷酸二酯酶专一作用本身的核糖核酸，降解生成5
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单核苷酸，然后使其从细胞内渗出。自溶法的关键在于自溶条件的确定，首先必须选择具有酶活力的菌体。
7.生物催化法：肌苷或鸟苷与磷酸供体在磷酸化酶的作用下合成5
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肌苷酸二钠(imp)与5
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鸟苷酸二钠(gmp)。生物催化法具有专一性强，磷酸供体来源广泛，价格低廉，提取工艺简单易操作，原料对环境友好等优势。现有生物催化法制备5
’‑
肌苷酸二钠(imp)与5
’‑
鸟苷酸二钠(gmp)存在转化效率低问题。而磷酸转移酶的活性是技术的关键，直接决定了转化效率，及后续的提取纯度与提取收率。


技术实现要素：

8.本发明的目的是提供可用于生产5
’‑
核苷酸的磷酸转移酶突变体。本发明提供的
技术方案如下。
9.第一方面，本发明提供磷酸转移酶突变体，所述磷酸转移酶突变体的氨基酸序列如seq id no.2、seq id no.4或seq id no.6所示。
10.本发明使用seq id no.9-10所示的引物，以seq id no.7所示核苷酸序列为模板进行易错pcr扩增。使用线性化载体将pcr扩增后获得的片段进行组装，并转化至bl21菌株中，通过抗性及pcr验证筛选获得突变菌，对突变菌株进行诱导表达，筛选出酶活较高的菌株。
11.本发明所述突变体的氨基酸序列中发生的同义突变均被替换为微生物偏爱的密码子，使得该酶的磷酸转移酶活性大大提高。
12.第二方面，本发明提供编码上述磷酸转移酶突变体的dna分子。具体地，所述dna分子的核苷酸序列如seq id no.1、seq id no.3或seq id no.5所示。
13.第三方面，本发明请求保护含有上述dna分子的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
14.根据本领域技术人员的理解，本发明还请求保护，上述的磷酸转移酶突变体或上述的dna分子或上述的生物材料在以下任一的应用：
15.(1)制备高活性磷酸转移酶；
16.(2)提高5
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核苷酸产量；
17.(3)提升5
’‑
鸟苷酸二钠或5
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肌苷酸二钠的纯度。
18.第四方面，本发明提供一种重组微生物，所述重组微生物表达上述磷酸转移酶突变体或所述重组微生物的基因组中含有上述的dna分子。
19.在本发明提供的重组微生物为产气肠杆菌或大肠杆菌。
20.本发明还请求保护，上述重组微生物在提高磷酸转移酶或5
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核苷酸产量、生产高酶活磷酸转移酶或生产高纯度5
’‑
核苷酸中的应用。
21.第五方面，本发明提供一种磷酸转移酶的制备方法，将上述重组微生物进行活化后接种至发酵培养基中，发酵过程调节ph6.8-7.2，溶氧30-60％，初始发酵温度为37℃，od达到20-25降温至28℃，葡萄糖浓度降至1-3g/l后流加糖，控制残糖0-1g/l，od达到75-80停止发酵。
22.在本发明提供的制备方法中，所述发酵培养基配方为：葡萄糖15-30g/l、玉米浆20-40g/l、(nh4)2so45-10g/l、k2hpo
4 1-5g/l、mgso4·
7h2o 0.5-5g/l、生物素0.0001-0.0005g/l和盐酸硫胺素0.0001-0.001g/l；
23.所述流加糖配方为质量比为(2-2.5)：(1-1.5)的葡萄糖和α-乳糖。
24.具体地，作为本发明的一个具体实施例，一种磷酸转移酶的制备方法，步骤如下：
25.将表达上述磷酸转移酶的突变株在lb中摇瓶过夜培养；lb培养基配方：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，nacl 10g/l，ph7.2-7.4，按照10％的接种量接种至摇瓶培养基中；摇瓶培养基配方：葡萄糖30g/l，酵母抽提物12g/l，蛋白胨18g/l，nacl 20g/l，nah2po4·
2h2o 8g/l，mgso4·
7h2o 5g/l，(nh4)2so
4 8g/l，在往复摇床220r/min，37℃培养至od为8-10，制备摇瓶种子。
26.取上述制备好的摇瓶种子接种至50l发酵罐，发酵罐的装液量为20l，发酵培养基配方为：葡萄糖30g/l，玉米浆40g/l，(nh4)2so
4 10g/l，k2hpo
4 5g/l，mgso4·
7h2o 5g/l，生
物素0.0005g/l，盐酸硫胺素0.001g/l。
27.发酵过程通过流加氨水调节ph6.8-7.2，交替提升转速、风量、罐压维持溶氧30-60％，初始发酵温度为37℃，od达到20-25降温至28℃，葡萄糖浓度降至1-3g/l后流加糖；流加糖配方为：葡萄糖600g/l，α-乳糖300g/l，控制残糖0-1g/l，od达到75-80停止发酵。
28.发酵液5000r/min离心5分钟收集细胞，用等体积的磷酸盐缓冲液：1g/l磷酸氢二钾，1g/l磷酸二氢钾，ph7.0)重悬细胞，即制备获得磷酸转移酶酶液。
29.本发明的有益效果至少在于：
30.(1)本发明采用易错pcr技术获得新的phoc基因突变，获得的磷酸转移酶突变体为首次报道，本发明的磷酸转移酶突变体的活性显著增强。将其应用于工业生产核苷酸，具有产率高、周期短，发酵条件易控制，且磷酸化产物单一等优势，会大幅度降低生产成本。
31.(2)本发明还提供使用重组微生物发酵生产5
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核苷酸、制备高酶活性的磷酸转移酶的方法。本发明制备得到的高酶活性磷酸转移酶可以用于生产高纯度呈味核苷酸二钠产品5
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肌苷酸二钠和5
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鸟苷酸二钠，其纯度可达到97.5％以上，达到食品级要求，同时收率也有显著提升，达到125％以上，在工业化生产中可大幅降低生产成本。
附图说明
32.图1是本发明实施例2中不同突变磷酸转移酶酶活结果图。
33.图2是本发明实施例3中突变菌株发酵生产5
’‑
imp或5
’‑
gmp结果图。
具体实施方式
34.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
35.本发明所说的磷酸供体，是指能够提供磷酸基团的磷酸盐或含磷化合物，包括聚磷酸(盐)、磷酸苯酯(盐)或氨甲酰磷酸(盐)等。聚磷酸(盐)具体包括焦磷酸(盐)、三聚磷酸(盐)、四聚磷酸(盐)、六偏磷酸(盐)等。
36.本发明采用液相色谱法检测5
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鸟苷酸二钠或5
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肌苷酸二钠的纯度。具体方法如下：
37.流动相a：0.02mol/l磷酸二氢钾溶液(ph＝4.5
±
0.01)，称取2.7218g磷酸二氢钾，置于1000ml烧杯中，加入1000ml超纯水，在磁力搅拌器上搅拌至磷酸二氢钾完全溶解，然后用磷酸调节ph至4.5，过滤，待用。
38.流动相b：乙腈。
39.检测方法：色谱柱：xdb-c18(5μm，4.6
×
250mm)。
40.流动相a：流动相b＝99.5：0.5(v/v)。
41.柱温：40℃。
42.流速：1ml/min。
43.检测器：紫外检测器，(λ＝254nm)。
44.进样量：2μl。
45.本发明涉及到的培养基其配方为：
46.lb培养基配方(g/l)：酵母粉5，蛋白胨10，nacl 10，ph7.2-7.4；121℃蒸汽灭菌20分钟。
47.摇瓶培养基配方(g/l)：葡萄糖30，酵母抽提物12，蛋白胨18，nacl 20，nah2po4·
2h2o 8，mgso4·
7h2o 5，(nh4)2so
4 8；121℃蒸汽灭菌20分钟。
48.发酵培养基配方(g/l)：葡萄糖30，玉米浆40，(nh4)2so
4 10，k2hpo
4 5，mgso4·
7h2o 5，生物素0.0005，盐酸硫胺素0.001；121℃蒸汽灭菌20分钟。
49.表1本发明涉及到的引物序列
50.引物名称序列5
′→3′ꢀ
phoc-21fcagcaaatgggtcgcggatccatgaaaaagcgcgttctcgcseq id no.9phoc-21rctcgagtgcggccgcaagcttttacttctgcgttttggcgaaseq id no.10
51.实施例1突变phoc基因的获得
52.易错pcr是目前最简单、有效的一种基因体外随机诱变技术。pcr本身有一定的错配率，一般为10-6-10-5
。使用低保真性的taq酶，添加mg
2+
、mn
2+
等手段增加突变pcr扩增过程中的突变率。
53.本实施例提供获取突变的phoc基因的方法，具体步骤如下。
54.全基因合成获得含有产气肠杆菌phoc基因(基因序列见seq id no.7，对应的氨基酸序列见seq id no.8)，将其构建至puc19质粒上，以此质粒为模板设计引物phoc-21f/phoc-21r((seq id no.9/seq id no.10)进行易错pcr扩增。
55.扩增体系为：每50μl体系添加5μl 10
×
易错pcr缓冲液(100mmol/l tris-hcl ph 8.3，500mmol/l kcl，1％triton，20mmol/lmgcl2，5μl 10
×
dntp混合物(1mmol/l dgtp，1mmol/l datp，5mmol/l dctp，5mmol/l dttp)；引物phoc-20f/phoc-20r或phoc-28f/phoc-28r各50pmol，质粒dna模板10ng，5μl的5mmol/l mn
2+
，15u/μl的taq dna聚合酶2.5μl，5μl的25mmol/l的mg
2+
，添加灭菌后的超纯水至总体积为50μl。易错pcr程序为：95℃5min；94℃1mi，55℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10m in。以首次获得的pcr胶回收产物为模板进行下一轮易错pcr，如此反复共5轮易错pcr，最终获得含多种不同突变的phoc基因。
56.实施例2 phoc突变文库的构建及高活性磷酸转移酶突变体的筛选
57.本实施例提供筛选高活性磷酸转移酶突变体的方法，步骤如下。
58.提取pet21a质粒，使用bamhi/hindiii限制性内切酶进行线性化，按照组装试剂盒说明书将线性化载体及实施例1得到的含多种不同突变的pcr片段进行组装，并通过化转法转化至bl21菌株中。
59.从实施例1得到的突变pcr片段数量众多，突变pcr片段在与线性化载体成功组装并转化至bl21菌株后，通过抗性及pcr验证筛选获得突变菌共20株，编号分别为21a-1～20，将20株菌株进行诱导表达，筛选出5株菌株酶活较对照提高，其中酶活最高的菌株较对照提高3.5倍，如图1所示。
60.酶活测定方法为：在1ml标准反应混合物(包含100μm的乙酸钠缓冲液(ph 5.0)，40μm的肌苷或鸟苷，100μm的焦磷酸四钠和酶溶液)中测定磷酸转移酶的活性。在30℃下温育10分钟，然后通过添加0.2ml 2n hcl终止反应。通过hplc进行肌苷、鸟苷和5
′‑
imp、5
′‑
gmp的定量测定。1个酶活力单位是指在温度30℃、ph 4.0条件下，在1分钟内催化肌苷与三聚磷酸钠反应产生1μmol肌苷酸的酶量，定义为1u。
61.实施例3使用摇瓶生产5
’‑
核苷酸
62.本实施例使用实施例2得到的酶活性较高的菌株进行5
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核苷酸de生产，步骤如下。
63.从实施例2得到的5株酶活性较高菌株中，选取了21a-4，21a-19，21a-20这3株菌。将上述3株菌在lb中摇瓶过夜培养，lb培养基配方：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，nacl 10g/l，ph7.2-7.4，按照10％的接种量接种至分别含有30g/l肌苷或鸟苷，150g/l焦磷酸二钠的摇瓶培养基中，摇瓶培养基配方：葡萄糖30g/l，酵母抽提物12g/l，蛋白胨18g/l，nacl 20g/l，nah2po4·
2h2o 8g/l，mgso4·
7h2o 5g/l，(nh4)2so
4 8g/l，并添加1mm的iptg诱导，在30℃诱导发酵18h，发酵结束后，液相测定发酵培养基中肌苷酸或鸟苷酸的含量。结果21a-4，21a-19，21a-20较对照bl21(pet21a)的肌苷酸或鸟苷酸含量提高了8-13倍。发酵结果见图2。
64.实施例4发酵制备高酶活性的磷酸转移酶
65.本实施例使用酶活性最高的菌株生产磷酸转移酶，具体步骤如下。
66.选取实施例3中酶活性最高的菌株21a-20，进行50l罐发酵制备磷酸转移酶菌液。
67.将菌株21a-20在lb中摇瓶过夜培养(lb培养基配方(g/l)：酵母粉5，蛋白胨10，nacl 10，ph7.2-7.4)，按照10％的接种量接种至摇瓶培养基中(摇瓶培养基配方(g/l)：葡萄糖30，酵母抽提物12，蛋白胨18，nacl 20，nah2po4·
2h2o 8，mgso4·
7h2o 5，(nh4)2so
4 8)，在往复摇床220r/min，37℃培养至od为8-10，制备摇瓶种子。
68.取上述制备好的摇瓶种子50ml接种至50l发酵罐，发酵罐的装液量为20l，发酵培养基配方为(g/l)：葡萄糖30，玉米浆40，(nh4)2so
4 10，k2hpo
4 5，mgso4·
7h2o 5，生物素0.0005，盐酸硫胺素0.001。发酵过程通过流加氨水调节ph6.8-7.2，交替提升转速、风量、罐压维持溶氧30-60％，初始发酵温度为37℃，od达到20-25降温至28℃，葡萄糖浓度降至1-3g/l后流加糖(流加糖配方为：葡萄糖600g/l，α-乳糖300g/l)，控制残糖0-1g/l，od达到75-80停止发酵。发酵液5000r/min离心5分钟收集细胞，用等体积的磷酸盐缓冲液(1g/l磷酸氢二钾，1g/l磷酸二氢钾，ph7.0)重悬细胞，即制备获得磷酸转移酶酶液。
69.采用hplc方法检测上述制备的磷酸转移酶酶液，酶活达到510
±
20u/ml，远高于专利文献1(cn96195770.0)和专利文献2(cn201310574198.x)中获得的磷酸转移酶的酶活。
70.实施例5生物酶催化生产5
’‑
核苷酸
71.本实施例提供使用实施例4制备得到的磷酸转移酶生产5
’‑
核苷酸的方法，步骤如下。
72.将240g鸟苷与489g三聚磷酸钠和111g焦磷酸钠在2280g水中形成悬浮溶液，用浓度为6mol/l的盐酸调节ph至4.5
±
0.02，保持溶液温度处在37
±
0.5℃，加入684ml实施例4制备的磷酸转移酶酶液，维持温度37
±
0.5℃，反应8小时结束，即得到酶反应液。
73.用浓度为40％的氢氧化钠调节上述反应液ph至10.2
±
0.02，梯度降温至10℃进行冷却析磷，温度下降速度为每小时降3℃，离心分离得到清液。
74.将上述清液加热到60℃，添加0.3％的活性炭，搅拌30分钟后离心分离，得到脱色清液。
75.取上述脱色清液，加入6mol/l的盐酸调节ph至8.0
±
0.02，梯度降温至10℃进行析晶，温度下降速度为每小时降3℃，离心分离，收集固体产物，40℃烘干，得到301g纯度为98.3％的5
’‑
鸟苷酸二钠，收率125.4％。收率计算公式：(5
’‑
鸟苷酸二钠/鸟苷)
×
100％。
76.采用本实施例所提供方法得到的呈味核苷酸二钠产品5
’‑
肌苷酸二钠和5
’‑
鸟苷酸二钠纯度高，纯度可达到97.5％以上，达到食品级要求，同时收率也有显著突变，达到125％以上，工业化可大幅降低生产成本。
77.本发明所述制备方法原材料简单易获得，反应条件温和，能耗低，可快速放大应用到工业化生产上，同时实现绿色生产的理念。
78.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.磷酸转移酶突变体，其特征在于，所述磷酸转移酶突变体的氨基酸序列如seq id no.2、seq id no.4或seq id no.6所示。2.编码权利要求1所述磷酸转移酶突变体的dna分子。3.根据权利要求2所述的dna分子，其特征在于，所述dna分子的核苷酸序列如seq id no.1、seq id no.3或seq id no.5所示。4.含有权利要求2-3任一项所述dna分子的生物材料，其特征在于，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。5.权利要求1所述的磷酸转移酶突变体或权利要求2-3任一项所述的dna分子或权利要求4所述的生物材料在以下任一的应用：(1)制备高活性磷酸转移酶；(2)提高5
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核苷酸产量；(3)提升5
’‑
鸟苷酸二钠或5
’‑
肌苷酸二钠的纯度。6.一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物表达权利要求1所述磷酸转移酶突变体或所述重组微生物的基因组中含有权利要求2-3任一项所述的dna分子。7.根据权利要求6所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物为产气肠杆菌或大肠杆菌。8.权利要求6-7任一项所述重组微生物在提高磷酸转移酶或5
’‑
核苷酸产量、生产高酶活磷酸转移酶或高纯度5
’‑
核苷酸中的应用。9.一种磷酸转移酶的制备方法，其特征在于，将权利要求6-7任一项所述重组微生物进行活化后接种至发酵培养基中，发酵过程调节ph6.8-7.2，溶氧30-60％，初始发酵温度为28-37℃，od达到20-25降温至28℃，葡萄糖浓度降至1-3g/l后流加糖，控制残糖0-1g/l。10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基配方为：葡萄糖15-30g/l、玉米浆20-40g/l、(nh4)2so
4 5-10g/l、k2hpo
4 1-5g/l、mgso4·
7h2o 0.5-5g/l、生物素0.0001-0.0005g/l和盐酸硫胺素0.0001-0.001g/l；所述流加糖配方为质量比为(2-2.5)：(1-1.5)的葡萄糖和α-乳糖。

技术总结
本发明公开一种磷酸转移酶突变体及其应用。本发明提供的磷酸转移酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.4或SEQ ID No.6所示，编码磷酸转移酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示。本发明还提供使用重组微生物发酵生产5


技术研发人员：吴涛 薛婷莉 胡丹 常利斌 龚华 李岩 赵津津
受保护的技术使用者：冯波
技术研发日：2021.10.28
技术公布日：2023/10/20