抗体药物缀合物的制作方法

1.本公开提供了包含sting调节剂的抗体药物缀合物。还提供了包含所述抗体药物缀合物的组合物。所述化合物和组合物可用于刺激有需要的受试者的免疫反应。


背景技术：

2.抗体药物缀合物(adc)是快速发展的一类靶向治疗剂，代表了改善药物的选择性和细胞毒性活性的有前景的新方法。这些治疗剂包含可连接至有效载荷(payload)药物以形成免疫缀合物的抗体(或抗体片段)。抗体指导adc与靶向细胞结合。然后adc可被内化并释放其有效载荷，从而为细胞提供治疗。因为adc针对其靶向细胞，所以缀合的药物的副作用可能低于全身施用同一种剂时遇到的副作用。
3.已经证明衔接蛋白sting(干扰素基因的刺激物)在先天免疫系统中发挥作用。sting途径的活化触发免疫反应，从而产生特异性杀手t细胞，其使肿瘤缩小并可提供持久的免疫力，所以肿瘤不复发。活化的sting途径还通过产生对抗病毒并调动先天和后天免疫系统的抗病毒且促炎的细胞因子来促进抗病毒反应，最终得到针对致病病毒的持久免疫力。增强先天和后天免疫反应的潜在治疗益处使sting成为有吸引力的药物发现目标。环状二核苷酸可充当sting激动剂并且正在临床试验中进行测试。然而，其阴离子特性使其膜渗透性不良，这可能限制其在细胞内衔接sting的能力，常常导致这些化合物在血流内的非所要分布。
4.仍然需要新的sting激动剂以及用于将其递送至靶向细胞的改善方法。


技术实现要素：

5.在第一方面中，本公开提供了一种式(i)化合物：
[0006][0007]
或其药学上可接受的盐，其中：
[0008]
a为1至20的整数；
[0009]
ab是抗ccr2抗体、抗ccr2抗体片段或抗ccr2抗原结合片段；
[0010]
d是sting活性的调节剂，其包含鸟嘌呤碱基、鸟嘌呤碱基衍生物、腺嘌呤碱基或腺嘌呤碱基衍生物上的氨基；并且
[0011]
l是接头，其共价键合至ab；并且还共价键合至d上的所述氨基。
[0012]
在第一方面的第一实施方案中，本公开提供了一种式(i)化合物或其药学上可接
受的盐，其中d-l由式(ia)表示：
[0013][0014][0015]
其中：
[0016]
表示与ab的连接点；
[0017]
b为1至20的整数；
[0018]
m为0、1、2、3或4；
[0019]
n为0或1；
[0020]
每个r1独立地选自c
1-c4烷基、o-c
1-c4烷基和卤素；
[0021]
r2选自c
1-c4烷基和-(ch2ch2o)
s-ch3；其中s是1至10的整数；
[0022]
r3和r
3'
各自独立地选自氢和c
1-c3烷基；并且
[0023]
l1是可切割接头片段。
[0024]
在第一方面的第二实施方案中，本公开提供了一种式(i)化合物或其药学上可接受的盐，其中d-l由式(ia)表示，其中：
[0025]
a为1至8的整数；
[0026]
b为1至10的整数；并且
[0027]
m为0。
[0028]
在第一方面的第三实施方案中，本公开提供了一种式(i)化合物或其药学上可接受的盐，其中d-l由式(ia)表示，其中：
[0029]
m为0；
[0030]
n为0；并且
[0031]
r3和r
3'
各自是氢。
[0032]
在第一方面的第三实施方案中，本公开提供了一种式(i)化合物或其药学上可接受的盐，其中d-l由式(ia)表示，其中l1是
[0033][0034]
其中：
[0035]
是与式(ia)的氮原子的连接点；
[0036]
是与ab的连接点；
[0037]
t为1至10的整数；
[0038]
w不存在或是自降解基团；
[0039]
z不存在或是2至5个氨基酸的肽；
[0040]
u和u'独立地不存在或是间隔物；并且
[0041]
q是异双官能团；
[0042]
限制条件是w和z均不存在。
[0043]
在第一方面的第四实施方案中，w是选自以下的自降解基团
[0044]
其中：
[0045]
是与羰基的连接点；并且是与z的连接点。
[0046]
在第一方面的第五实施例中，w是
[0047]
在第一方面的第六实施方案中，w是
[0048][0049]
在第一方面的第七实施方案中，z是能够被酶促切割的肽。
[0050]
在第一方面的第八实施方案中，z是组织蛋白酶可切割的。
[0051]
在第一方面的第九实施方案中，z是选自以下的两个氨基酸的肽：val-cit、cit-val、val-ala、ala-val、phe-lys和lys-phe。
[0052]
在第一方面的第十实施方案中，z是ala-val或val-ala。
[0053]
在第一方面的第十一实施方案中，u'不存在，并且u选自
[0054][0055][0056]
其中：
[0057]
是与z的连接点；
[0058]
是与q的连接点；
[0059]
p为1至6的整数；
[0060]
q为1至20的整数；
[0061]
x是o或-ch
2-；并且
[0062]
每个r独立地为0或1。
[0063]
在第一方面的第十二实施方案中，u'不存在，并且u是
[0064][0065]
在第一方面的第十三实施方案中，q是异双官能团，其与u'连接或当u'不存在时通过化学或酶介导的缀合来与ab连接。
[0066]
在第一方面的第十四实施方案中，q选自
[0067][0068]
其中：
[0069]
是与u的连接点或当u不存在时是与z的连接点；并且
[0070]
是与u'的连接点或当u'不存在时是与ab的连接点。
[0071]
在第一方面的第十五实施方案中，q是：
[0072][0073]
在第一方面的第十六实施方案中，t为1。
[0074]
在第一方面的第十七实施方案中，r2是-ch3，并且r3和r
3'
各自是氢。
[0075]
在第一方面的第十八实施方案中，a为2至6。
[0076]
在第一方面的第十九实施方案中，b为1。
[0077]
在第一方面的第二十实施方案中，调节sting活性的氨基取代的化合物是式(ii)化合物：
[0078][0079]
其中：
[0080]
x
10
是sh或oh；
[0081]
x
20
是sh或oh；
[0082]
ya是o、s或ch2；
[0083]
yb是o、s、nh或nra，其中ra是c
1-c4烷基；
[0084]r10
是氢、氟、oh、nh2、orb或nhrb；
[0085]r20
是氢或氟；
[0086]r30
是氢；r
40
是氢、氟、oh、nh2、orb或nhrb；或r
30
和r
40
一起形成ch2o；
[0087]r50
是氢或氟；
[0088]
rb是c
1-c6烷基、卤代(c
1-c6)烷基或c
3-c6环烷基；
[0089]
环a
10
是含有1-4个选自n、o或s的杂原子的任选地取代的5或6元单环杂芳基环或者含有1-5个选自n、o或s的杂原子的任选地取代的9或10元双环杂芳基环；其中环a
10
在环中包含至少一个n原子，并且其中yb与环a
10
的碳原子连接；并且
[0090]
环b
10
是含有2至5个选自n、o或s的杂原子的任选地取代的9或10元双环杂芳基环；其中环b
10
在环中包含至少两个n原子；
[0091]
限制条件是环a
10
或环b
10
通过氨基与式(i)中的
‘
l’连接。
[0092]
在第一方面的第二十一实施方案中，调节sting活性的氨基取代的化合物是
[0093][0094]
其中是与式(i)中的
‘
l’的连接点。
[0095]
在第一方面的第二十二实施方案中，调节sting活性的氨基取代的化合物是式(iii)化合物：
[0096][0097]
或其药学上可接受的盐；其中
[0098]
x
10
是sh或oh；
[0099]
x
20
是sh或oh；
[0100]
yc是o、s或ch2；
[0101]
yd是o、s或ch2；
[0102]b100
是由式(b
1-a)或式(b
1-b)表示的基团：
[0103][0104]r13
、r
14
、r
15
、r
16
和r
17
各自独立地是氢原子或取代基；
[0105]r1000
是氢或与式(i)的羰基的键；
[0106]y11
、y
12
、y
13
、y
14
、y
15
和y
16
各自独立地是n或cr
1a
，其中r
1a
是氢或取代基；
[0107]z11
、z
12
、z
13
、z
14
、z
15
和z
16
各自独立地是n或c；
[0108]r105
是氢原子或取代基；
[0109]b200
是由式(b
2-a)或式(b
2-b)表示的基团：
[0110]
[0111]r23
、r
24
、r
25
、r
26
和r
27
各自独立地是氢原子或取代基；
[0112]r100'
是氢或与式(i)的羰基的键；
[0113]y21
、y
22
、y
23
、y
24
、y
25
和y
26
各自独立地是n或cr
2a
，其中r
2a
是氢或取代基；
[0114]z21
、z
22
、z
23
、z
24
、z
25
和z
26
各自独立地是n或c；并且
[0115]r205
是氢原子或取代基；其中r
105
和r
205
各自独立地与其所分别连接的5元环的2或3位连接；
[0116]
限制条件是：
[0117]b100
或b
200
的一通过氨基与式(i)中的
‘
l’连接。
[0118]
在第一方面的第二十三实施方案中，调节sting活性的氨基取代的化合物是式(iiia)化合物：
[0119][0120]
或其药学上可接受的盐；其中
[0121]b100
是由式(b
1-a)或式(b
1-b)表示的基团：
[0122][0123]r13
、r
14
、r
15
、r
16
和r
17
各自独立地是氢原子或取代基；
[0124]r1000
是氢或与式(i)的羰基的键；
[0125]y11
、y
12
、y
13
、y
14
、y
15
和y
16
各自独立地是n或cr
1a
，其中r
1a
是氢或取代基；
[0126]z11
、z
12
、z
13
、z
14
、z
15
和z
16
各自独立地是n或c；
[0127]r105
是氢原子或取代基；
[0128]b200
是由式(b
2-a)或式(b
2-b)表示的基团：
[0129][0130]r23
、r
24
、r
25
、r
26
和r
27
各自独立地是氢原子或取代基；
[0131]
r100'是氢或与式(i)的羰基的键；
[0132]y21
、y
22
、y
23
、y
24
、y
25
和y
26
各自独立地是n或cr
2a
，其中r
2a
是氢或取代基；
[0133]z21
、z
22
、z
23
、z
24
、z
25
和z
26
各自独立地是n或c；并且
[0134]r205
是氢原子或取代基；其中r
105
和r
205
各自独立地与其所分别连接的5元环的2或3位连接；
[0135]
限制条件是：
[0136]b100
或b
200
之一是：
[0137][0138]
其中：
[0139]r18
是氢或c
1-6
烷基；并且
[0140]r19
是卤素原子；
[0141]
并且另一者通过-nh-基团与式(i)中的
‘
l’基团连接。
[0142]
在第一方面的第二十四实施方案中，调节sting活性的氨基取代的化合物是式(iv)化合物：
[0143][0144]
或其药学上可接受的盐，其中：
[0145]
r1和r2各自独立地是羟基或卤素原子；
[0146]
b1是：
[0147][0148]r18
是氢或c
1-6
烷基；
[0149]r19
是卤素原子；
[0150]
b2是：
[0151]
并且
[0152]
q2和q4各自独立地是氧原子或硫原子。
[0153]
在第一方面的第二十五实施方案中，调节sting活性的氨基取代的化合物是：
[0154][0155]
或其药学上可接受的盐，其中是与l的连接点。
[0156]
在第一方面的第二十六实施方案中，本公开提供了一种式(i)化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(vi)的结构：
[0157][0158]
其中a为1至6的整数。
[0159]
在第一方面的第二十七实施方案中，ab是结合人ccr2或其部分并且能够阻断趋化
因子与ccr2的结合并抑制ccr2的功能的抗体或其片段。
[0160]
在第一方面的第二十八实施方案中，抗体选自由以下组成的组：单克隆抗体1d9或可与1d9竞争结合人ccr2或ccr2的一部分的抗体；mc-21；sti-b020x；uniti-101和4.40a68g。
[0161]
在第一方面的第二十九实施方案中，抗体是单克隆抗体1d9或可与1d9竞争结合人ccr2或ccr2的一部分的抗体。
[0162]
在第一方面的第三十实施方案中，抗体是嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、小鼠抗体、大鼠抗体、山羊抗体或兔抗体。
[0163]
在第一方面的第三十一实施方案中，抗ccr2抗体、抗ccr2抗体片段或抗ccr2抗原结合片段包含：轻链cdr1，其包含seq id no:1的氨基酸24-39；轻链cdr2，其包含seq id no:1的氨基酸55-61；轻链cdr3，其包含seq id no:1的氨基酸94-102；重链cdr1，其包含seq id no:2的氨基酸31-35；重链cdr2，其包含seq id no:2的氨基酸50-68；和重链cdr3，其包含seq id no:2的氨基酸101-106。
[0164]
在第一方面的第三十二实施方案中，抗ccr2抗体、抗ccr2抗体片段或抗ccr2抗原结合片段包含有包含氨基酸序列seq id no:2的重链可变区。
[0165]
在第一方面的第三十三实施方案中，抗体、抗ccr2抗体、抗ccr2抗体片段或抗ccr2抗原结合片段包含有包含氨基酸序列seq id no:1的轻链可变区。
[0166]
在第一方面的第三十四实施方案中，抗ccr2抗体、抗ccr2抗体片段或抗ccr2抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含氨基酸序列seq id no:2。
[0167]
在第一方面的第三十五实施方案中，抗ccr2抗体、抗ccr2抗体片段或抗ccr2抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述轻链可变区包含氨基酸序列seq id no:1。
[0168]
在第一方面的第三十六实施方案中，抗ccr2抗体、抗ccr2抗体片段或抗ccr2抗原结合片段包含有包含氨基酸序列seq id no:2的重链可变区以及轻链可变区，其中所述轻链可变区包含氨基酸序列seq id no:1。
[0169]
在第一方面的第三十七实施方案中，抗ccr2抗体、抗ccr2抗体片段或抗ccr2抗原结合片段还包含选自人免疫球蛋白igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2重链恒定区的重链恒定区。
[0170]
在第一方面的第三十八实施方案中，抗ccr2抗体、抗ccr2抗体片段或抗ccr2抗原结合片段还包含选自由人免疫球蛋白iggκ和iggλ轻链恒定区组成的组的轻链恒定区。
[0171]
在第一方面的第三十九实施方案中，抗ccr2抗体、抗ccr2抗体片段或抗ccr2抗原结合片段与包含seq id no:2的重链可变区和seq id no:1的轻链可变区的抗体结合相同表位。
[0172]
在第一方面的第四十实施方案中，抗ccr2抗体包含seq id no:3的重链区。
[0173]
在第一方面的第四十一实施方案中，抗ccr2抗体包含seq id no:4的轻链区。
[0174]
在第一方面的第四十二实施方案中，抗ccr2抗体包含seq id no:3的重链区和seq id no:4的轻链区。
[0175]
在第二方面中，本公开提供了一种药物组合物，其包含式(i)化合物或其药学上可
接受的盐和一种或多种药学上可接受的载剂。
[0176]
在第二方面的第一实施方案中，药物组合物包含式(i)化合物和结合程序性死亡1(pd-1、cd279、hsle1或sleb2)的抗体。
[0177]
在第二方面的第二实施方案中，药物组合物包含式(i)化合物和结合程序性死亡配体1(pd-l1、cd274或b7h1)的抗体。
[0178]
在第三方面中，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用药学上可接受的量的式(i)化合物或其药学上可接受的盐。
[0179]
在第三方面的第一实施方案中，治疗癌症的方法包括向受试者施用药学上可接受的量的式(i)化合物或其药学上可接受的盐和抗pd-1抗体。
[0180]
在第三方面的第二实施方案中，治疗癌症的方法包括向受试者施用药学上可接受的量的式(i)化合物或其药学上可接受的盐和抗pd-l1抗体。
[0181]
在第三方面的第三实施方案中，式(i)化合物或其药学上可接受的盐和抗pd-1抗体同时施用。
[0182]
在第三方面的第四实施方案中，式(i)化合物或其药学上可接受的盐和抗pd-1抗体依序施用。
[0183]
在第三方面的第五实施方案中，式(i)化合物或其药学上可接受的盐和抗pd-l1抗体同时施用。
[0184]
在第三方面的第六实施方案中，式(i)化合物或其药学上可接受的盐和抗pd-l1抗体依序施用。
[0185]
在第三方面的第七实施方案中，所述方法还包括向受试者施用放射。在第三方面的第八实施方案中，放射是粒子放射。在第三方面的第九实施方案中，放射通过外部束放射来施用。
[0186]
在第四方面中，本公开提供了一种用于刺激有需要的受试者的免疫反应的方法，所述方法包括向受试者施用药学上可接受的量的式(i)化合物或其药学上可接受的盐。
附图说明
[0187]
图1描绘了经由随机半胱氨酸缀合的ab-sting激动剂缀合物的制备。
[0188]
图2描绘了经由转谷氨酰胺酶缀合的ab-sting激动剂缀合物的制备。
[0189]
图3描绘了经由转谷氨酰胺酶缀合的ab-sting激动剂缀合物的制备。
[0190]
图4描绘了抗体药物缀合物b-14的小鼠pk概况。
[0191]
图5描绘了抗体药物缀合物b-15的小鼠pk概况。
[0192]
图6描绘了抗体药物缀合物b-16的小鼠pk概况。
[0193]
图7描绘了抗体药物缀合物b-17的小鼠pk概况。
[0194]
图8描绘了抗体药物缀合物b-18的小鼠pk概况。
[0195]
图9描绘了给药adc b-17的小鼠的体重随时间的变化。
[0196]
图10描绘了给药adc b-20的小鼠的体重随时间的变化。
[0197]
图11描绘了抗体药物缀合物b-21的抗肿瘤活性与其单独有效载荷的抗肿瘤活性的比较。
[0198]
图12描绘了给药抗体药物缀合物b-17之后，非人灵长类动物的单核细胞和mdsc中
ccr2和cd80表达的变化。
[0199]
图13描绘了给药抗体药物缀合物b-17之后，非人灵长类动物的血清il-1ra、il-6、tnf-α和ifn-γ的变化。
[0200]
图14描绘了抗体药物缀合物b-17的非人灵长类动物pk概况。
具体实施方式
[0201]
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本公开所属领域的技术人员通常所理解相同的含义。本文提及的所有专利和出版物均以引用的方式整体并入本文。
[0202]
除非上下文另外说明，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数个指示物。
[0203]
如本文所用，术语“或”是逻辑析取(即，和/或)并且除非明确用诸如术语“要么”、“除非”、“替代地”和类似效果的词指示，否则不指示排他性析取。
[0204]
如本文所用，术语“约”是指
±
10％。
[0205]
抗体药物缀合物
[0206]
在一些实施方案中，本公开提供了一种式(i)化合物，
[0207][0208]
或其药学上可接受的盐，其中：
[0209]
a为1至20的整数；
[0210]
ab是抗ccr2抗体、抗ccr2抗体片段或抗ccr2抗原结合片段；
[0211]
d是sting活性的调节剂，其包含鸟嘌呤碱基、鸟嘌呤碱基衍生物、腺嘌呤碱基或腺嘌呤碱基衍生物上的氨基；并且
[0212]
l是接头，其共价键合至ab；并且还共价键合至d上的所述氨基。
[0213]
sting调节剂部分
[0214]
本公开提供了包含sting活性的调节剂的化合物。在某些实施方案中，sting调节剂是作为拮抗剂或激动剂靶向sting途径的化合物。在一些实施方案中，sting调节剂是激动剂。在某些实施方案中，sting调节剂包含鸟嘌呤碱基、鸟嘌呤碱基衍生物、腺嘌呤碱基或腺嘌呤碱基衍生物上的氨基。在一些实施方案中，sting调节剂是环状二核苷酸或环状二核苷酸样化合物(每个都是cdn)。
[0215]
在一些实施方案中，sting调节剂是式(ii)化合物：
[0216][0217]
或其药学上可接受的盐，其中：
[0218]
x
10
是-sh或-oh；
[0219]
x
20
是-sh或-oh；
[0220]
ya是-o-、-s-或-ch
2-；
[0221]
yb是-o-、-s-、-nh-或-nr
a-，其中ra是c
1-c4烷基；
[0222]r10
是氢、氟、-oh、-nh2、-orb或-nhrb；
[0223]r20
是氢或氟；
[0224]r30
是氢；r
40
是氢、氟、-oh、-nh2、-orb或-nhrb；或r
30
和r
40
一起形成-ch2o-；
[0225]r50
是氢或氟；
[0226]
rb是c
1-c6烷基、卤代(c
1-c6)烷基或c
3-c6环烷基；
[0227]
环a
10
是含有1-4个选自n、o或s的杂原子的任选地取代的5或6元单环杂芳基环或者含有1-5个选自n、o或s的杂原子的任选地取代的9或10元双环杂芳基环；其中环a
10
在环中包含至少一个n原子，并且其中yb与环a
10
的碳原子连接；并且
[0228]
环b
10
是含有2-5个选自n、o或s的杂原子的任选地取代的9或10元双环杂芳基环；其中环b
10
在环中包含至少两个n原子；
[0229]
限制条件是环a
10
或环b
10
通过-nh-基团与式(i)中的
‘
l’连接。
[0230]
如本文所述，环a
10
和环b
10
可含有一个或多个取代基，并且因此可任选地被取代。杂芳基的不饱和碳原子上的合适取代基包括且通常选自-卤基、-no2、-cn、-r
+
、-c(r
+
)＝c(r
+
)2、-c≡c-r
+
、-or
+
、-sro、-s(o)ro、-so2ro、-so3r
+
、-so2n(r
+
)2、-n(r
+
)2、-nr
+
c(o)r
+
、-nr
+
c(s)r
+
、-nr
+
c(o)n(r
+
)2、-nr
+
c(s)n(r
+
)2、-n(r
+
)c(＝nr
+
)-n(r
+
)2、-n(r
+
)c(＝nr
+
)-ro、-nr
+
co2r
+
、-nr
+
so2ro、-nr
+
so2n(r
+
)2、-o-c(o)r
+
、-o-co2r
+
、-oc(o)n(r
+
)2、-c(o)r
+
、-c(s)ro、-co2r
+
、-c(o)-c(o)r
+
、-c(o)n(r
+
)2、-c(s)n(r
+
)2、-c(o)n(r
+
)-or
+
、-c(o)n(r
+
)c(＝nr
+
)-n(r
+
)2、-n(r
+
)c(＝nr
+
)-n(r
+
)-c(o)r
+
、-c(＝nr
+
)-n(r
+
)2、-c(＝nr
+
)-or
+
、-n(r
+
)-n(r
+
)2、-c(＝nr
+
)-n(r
+
)-or
+
、-c(ro)＝n-or
+
、-p(o)(r
+
)2、-p(o)(or
+
)2、-o-p(o)-or
+
和-p(o)(nr
+
)-n(r
+
)2，其中r
+
独立地是氢或任选地取代的脂族基团、芳基、杂芳基、环脂族基团或杂环基，或者两个独立出现的r
+
连同其间插原子一起形成任选地取代的5-7元芳基、杂芳基、环脂族基团或杂环基。在一些实施方案中，r
+
独立地是氢、c
1-6
脂族基团或c
3-6
环脂族基团。每个ro独立地是任选地取代的脂族基团、芳基、杂芳基、环脂族基团或杂环基。
[0231]
如上文所详述，在一些实施方案中，两个独立出现的r
+
(或本文说明书和权利要求中类似定义的任何其他变量)连同其间插原子一起形成选自以下的单环或双环：3-13元环脂族基团；具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-12元杂环基；6-10元芳基；或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基。
[0232]
在一些实施方案中，sting调节剂是式(iia)化合物：
[0233][0234]
或其药学上可接受的盐，其中r
10
和r
40
各自独立地是氢、氟、-oh或-och2cf3，并且环a
10
和b
10
如针对式(ii)化合物所定义，限制条件是环a
10
或环b
10
通过-nh-基团与
‘
l’连接。
[0235]
在一些实施方案中，环a
10
是含有1、2或3个氮原子的任选地取代的6元单环杂芳基环。
[0236]
在一些实施方案中，环b
10
是：
[0237][0238]
其中：
[0239]z10
、z
20
、z
30
和z
40
各自独立地是n或cr
200
；
[0240]r210
是氢或c
1-c6烷基、卤代(c
1-c6)烷基或c
3-c6环烷基；
[0241]r230
是氢或-nh2；并且
[0242]r200
、r
220
和r
240
各自独立地是氢、卤素、-oh、-nh2、-cn、c
1-c6烷基、卤代(c
1-c6)烷基或c
3-c6环烷基。
[0243]
在一些实施方案中，sting调节剂是：
[0244][0245]
或其药学上可接受的盐，其中是与母体分子部分的
‘
l’基团的连接点。
[0246]
在一些实施方案中，sting调节剂是式(iii)化合物：
[0247][0248]
或其药学上可接受的盐，其中：
[0249]
x
10
是sh或oh；
[0250]
x
20
是sh或oh；
[0251]
yc是o、s或ch2；
[0252]
yd是o、s或ch2；
[0253]r105
和r
205
各自独立地是氢或取代基，其中r
105
和r
205
各自独立地与其所分别连接的5元环的2或3位连接；
[0254]b100
是由式(b
1-a)或式(b
1-b)表示的基团：
[0255][0256]r13
、r
14
、r
15
、r
16
和r
17
各自独立地是氢原子或取代基；
[0257]r1000
是氢或与式(i)的羰基的键；
[0258]y11
、y
12
、y
13
、y
14
、y
15
和y
16
各自独立地是n或cr
1a
；
[0259]z11
、z
12
、z
13
、z
14
、z
15
和z
16
各自独立地是n或c；
[0260]r1a
是氢原子或取代基；
[0261]b200
是由式(b
2-a)或式(b
2-b)表示的基团：
[0262][0263]r23
、r
24
、r
25
、r
26
和r
27
各自独立地是氢原子或取代基；
[0264]r100'
是氢或与式(i)的羰基的键；
[0265]y21
、y
22
、y
23
、y
24
、y
25
和y
26
各自独立地是n或cr
2a
；
[0266]z21
、z
22
、z
23
、z
24
、z
25
和z
26
各自独立地是n或c；并且
[0267]r2a
是氢原子或取代基；
[0268]
限制条件是，b
100
或b
200
之一通过-nh-基团与式(i)中的羰基连接。
[0269]
如本文所述，式(iii)和式(iiia)(下文)化合物在某些位置包含取代基。合适的取代基包括卤素原子、氰基、硝基、任选地取代的烃基、任选地取代的杂环基、酰基、任选地取代的氨基、任选地取代的氨基甲酰基、任选地取代的硫代氨基甲酰基、任选地取代的氨磺酰基、任选地取代的羟基、任选地取代的硫烷基(sh)和任选地取代的甲硅烷基，其中任选地取代的基团具有一个或多个选自取代基组a的取代基：
[0270]“取代基组a：”[0271]
(1)卤素原子，
[0272]
(2)硝基，
[0273]
(3)氰基，
[0274]
(4)氧代基团，
[0275]
(5)羟基，
[0276]
(6)任选地卤代的c
1-6
烷氧基，
[0277]
(7)c
6-14
芳氧基(例如，苯氧基、萘氧基)，
[0278]
(8)c
7-16
芳烷基氧基(例如，苄氧基)，
[0279]
(9)5至14元芳族杂环基氧基(例如，吡啶基氧基)，
[0280]
(10)3至14元非芳族杂环基氧基(例如，吗啉基氧基、哌啶基氧基)，
[0281]
(11)c
1-6
烷基-羰氧基(例如，乙酰氧基、丙酰氧基)，
[0282]
(12)c
6-14
芳基-羰氧基(例如，苯甲酰氧基、1-萘甲酰氧基、2-萘甲酰氧基)，
[0283]
(13)c
1-6
烷氧基-羰氧基(例如，甲氧基羰氧基、乙氧基羰氧基、丙氧基羰氧基、丁氧基羰氧基)，
[0284]
(14)单或二c
1-6
烷基-氨基甲酰氧基(例如，甲基氨基甲酰氧基、乙基氨基甲酰氧基、二甲基氨基甲酰氧基、二乙基氨基甲酰氧基)，
[0285]
(15)c
6-14
芳基-氨基甲酰氧基(例如，苯基氨基甲酰氧基、萘基氨基甲酰氧基)，
[0286]
(16)5至14元芳族杂环基羰氧基(例如，烟酰氧基)，
[0287]
(17)3至14元非芳族杂环基羰氧基(例如，吗啉基羰氧基、哌啶基羰氧基)，
[0288]
(18)任选地卤代的c
1-6
烷基磺酰氧基(例如，甲基磺酰氧基、三氟甲基磺酰氧基)，
[0289]
(19)任选地被c
1-6
烷基取代的c
6-14
芳基磺酰氧基(例如，苯基磺酰氧基、甲苯磺酰氧基)，
[0290]
(20)任选地卤代的c
1-6
烷硫基，
[0291]
(21)5至14元芳族杂环基，
[0292]
(22)3至14元非芳族杂环基，
[0293]
(23)甲酰基，
[0294]
(24)羧基，
[0295]
(25)任选地卤代的c
1-6
烷基-羰基，
[0296]
(26)c
6-14
芳基-羰基，
[0297]
(27)5至14元芳族杂环基羰基，
[0298]
(28)3至14元非芳族杂环基羰基，
[0299]
(29)c
1-6
烷氧基-羰基，
[0300]
(30)c
6-14
芳氧基-羰基(例如，苯氧基羰基、1-萘氧基羰基、2-萘氧基羰基)，
[0301]
(31)c
7-16
芳烷基氧基-羰基(例如，苄氧基羰基、苯乙氧基羰基)，
[0302]
(32)氨基甲酰基，
[0303]
(33)硫代氨基甲酰基，
[0304]
(34)单或二c
1-6
烷基-氨基甲酰基，
[0305]
(35)c
6-14
芳基-氨基甲酰基(例如，苯基氨基甲酰基)，
[0306]
(36)5至14元芳族杂环基氨基甲酰基(例如，吡啶基氨基甲酰基、噻吩基氨基甲酰基)，
[0307]
(37)3至14元非芳族杂环基氨基甲酰基(例如，吗啉基氨基甲酰基、哌啶基氨基甲酰基)，
[0308]
(38)任选地卤代的c
1-6
烷基磺酰基，
[0309]
(39)c
6-14
芳基磺酰基，
[0310]
(40)5至14元芳族杂环基磺酰基(例如，吡啶基磺酰基、噻吩基磺酰基)，
[0311]
(41)任选地卤代的c
1-6
烷基亚磺酰基，
[0312]
(42)c
6-14
芳基亚磺酰基(例如，苯基亚磺酰基、1-萘基亚磺酰基、2-萘基亚磺酰基)，
[0313]
(43)5至14元芳族杂环基亚磺酰基(例如，吡啶基亚磺酰基、噻吩基亚磺酰基)，
[0314]
(44)氨基，
[0315]
(45)单或二c
1-6
烷氨基(例如，甲氨基、乙氨基、丙氨基、异丙氨基、丁氨基、二甲氨基、二乙氨基、二丙氨基、二丁氨基、n-乙基-n-甲氨基)，
[0316]
(46)单或二c
6-14
芳基氨基(例如，苯基氨基)，
[0317]
(47)5至14元芳族杂环基氨基(例如，吡啶基氨基)，
[0318]
(48)c
7-16
芳烷基氨基(例如，苯甲基氨基)，
[0319]
(49)甲酰基氨基，
[0320]
(50)c
1-6
烷基-羰基氨基(例如，乙酰基氨基、丙酰基氨基、丁酰基氨基)，
[0321]
(51)(c
1-6
烷基)(c
1-6
烷基-羰基)氨基(例如，n-乙酰基-n-甲氨基)，
[0322]
(52)c
6-14
芳基-羰基氨基(例如，苯基羰基氨基、萘基羰基氨基)，
[0323]
(53)c
1-6
烷氧基-羰基氨基(例如，甲氧基羰基氨基、乙氧基羰基氨基、丙氧基羰基氨基、丁氧基羰基氨基、叔丁氧基羰基氨基)，
[0324]
(54)c
7-16
芳烷基氧基-羰基氨基(例如，苄氧基羰基氨基)，
[0325]
(55)c
1-6
烷基磺酰基氨基(例如，甲基磺酰基氨基、乙基磺酰基氨基)，
[0326]
(56)任选地被c
1-6
烷基取代的c
6-14
芳基磺酰基氨基(例如，苯基磺酰基氨基、甲苯磺酰基氨基)，
[0327]
(57)任选地卤代的c
1-6
烷基，
[0328]
(58)c
2-6
烯基，
[0329]
(59)c
2-6
炔基，
[0330]
(60)c
3-10
环烷基，
[0331]
(61)c
3-10
环烯基，和
[0332]
(62)c
6-14
芳基。
[0333]
在一些实施方案中，sting调节剂是式(iiia)化合物或其药学上可接受的盐：
[0334][0335]
或其药学上可接受的盐；其中
[0336]b100
是由式(b
1-a)或式(b
1-b)表示的基团：
[0337][0338]r13
、r
14
、r
15
、r
16
和r
17
各自独立地是氢原子或取代基；
[0339]r1000
是氢或与式(i)的羰基的键；
[0340]y11
、y
12
、y
13
、y
14
、y
15
和y
16
各自独立地是n或cr
1a
，其中r
1a
是氢或取代基；
[0341]z11
、z
12
、z
13
、z
14
、z
15
和z
16
各自独立地是n或c；
[0342]r105
是氢原子或取代基；
[0343]b200
是由式(b
2-a)或式(b
2-b)表示的基团：
[0344][0345]r23
、r
24
、r
25
、r
26
和r
27
各自独立地是氢原子或取代基；
[0346]r100'
是氢或与式(i)的羰基的键；
[0347]y21
、y
22
、y
23
、y
24
、y
25
和y
26
各自独立地是n或cr
2a
，其中r
2a
是氢或取代基；
[0348]z21
、z
22
、z
23
、z
24
、z
25
和z
26
各自独立地是n或c；并且
[0349]r205
是氢原子或取代基；其中r
105
和r
205
各自独立地与其所分别连接的5元环的2或3位连接；
[0350]
限制条件是：
[0351]b100
或b
200
之一是：
[0352][0353]
其中：
[0354]r18
是氢或c
1-6
烷基；并且
[0355]r19
是卤素原子；
[0356]
并且另一者通过-nh-基团与式(i)的羰基连接。
[0357]
在一些实施方案中，sting调节剂是式(iv)化合物或其药学上可接受的盐：
[0358][0359]
或其药学上可接受的盐，其中：
[0360]
r1和r2各自独立地是羟基或卤素原子；
[0361]
b1是：
[0362][0363]r18
是氢或c
1-6
烷基；
[0364]r19
是卤素原子；
[0365]
b2是：
[0366]
并且
[0367]
q2和q4各自独立地是氧原子或硫原子。
[0368]
在一些实施方案中，环状二核苷酸是：
[0369][0370]
或其药学上可接受的盐，其中是
‘
l’的点。
[0371]
接头部分
[0372]
基团“l”是接头。如本文所用，术语“接头”是指能够将抗体、抗体片段或抗原结合片段(ab)与式(i)和(iv)化合物内的含药物部分连接的任何化学部分。接头可以是分支的，并且可被1至20个含药物部分取代。在一些实施方案中，接头可被1至10个含药物部分取代。在一些实施方案中，接头可被1至5个含药物部分取代。在一些实施方案中，接头可被一个或两个含药物部分取代。在一些实施方案中，接头可被一个含药物部分取代。
[0373]
在一些实施方案中，接头“l”是可切割接头。在某些实施方案中，在药物和/或抗体可保持活性的条件下，接头可易于受酸诱导的切割、光诱导的切割、酶促切割等影响。在一些实施方案中，可切割接头可被酶促切割。在一些实施方案中，可切割接头可被蛋白酶、肽酶、酯酶、糖苷酶、磷酸二酯酶、磷酸酶或脂肪酶切割。在一些实施方案中，可切割接头可被蛋白酶切割。蛋白酶的实例包括但不限于组织蛋白酶b、vagp四肽等。
[0374]
在某些实施方案中，接头可以是pct公布wo 2018/200812、wo 2018/100558中所公开的接头中的任一种，所述公布以引用的方式整体并入。
[0375]
在某些实施方案中，“l”具有式：
[0376][0377]
其中：
[0378]
是与氮原子的连接点；并且
[0379]
是与ab的连接点。
[0380]
在一些实施方案中，“l”具有式：
[0381][0382]
其中：
[0383]
是与氮原子的连接点；
[0384]
是与抗体的连接点。
[0385]
基团“w”不存在或是自降解基团。如本文所用，术语“自降解”是指基团经历电子级联，从而导致其所连接的基团的释放。在一些实施方案中，自降解基团包含一个或多个可经历1,4-消除、1,6-消除、1,8-消除、1,6-环化消除、1,5-环化消除、1,3-环化消除、分子内5-exo-trig环化和/或6-exo-trig环化的基团。在某些实施方案中，自降解基团可以是pct公布wo 2018/200812、wo 2018/100558中所公开的自降解基团中的任一种，所述公布以引用的方式整体并入。
[0386]
基团“z”不存在或是2至5个氨基酸的肽。在某些实施方案中，肽是接头的切割位点，从而促进暴露于细胞内蛋白酶(诸如溶酶体酶)之后的药物释放(doronina等人(2003)nat.biotechnol.21:778-784)。具有两个氨基酸的肽的实例包括但不限于丙氨酸-丙氨酸(ala-ala)、缬氨酸-丙氨酸(va或val-ala)、缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯基丙氨酸(af或ala-phe)、苯基丙氨酸-赖氨酸(fk或phe-lys)、苯基丙氨酸-高赖氨酸(phe-homolys)和n-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(me-val-cit)。具有三个氨基酸的肽的实例包括但不限于甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。上文氨基酸组合也可以相反顺序存在(即，cit-val)。
[0387]
本公开的肽可包含天然存在和/或非天然存在的氨基酸残基。术语“天然存在的氨基酸”是指ala、asp、cys、glu、phe、gly、his、he、lys、leu、met、asn、pro、gin、arg、ser、thr、val、trp和tyr。“非天然氨基酸”(即，氨基酸不是天然存在的)包括(作为非限制性实例)高丝氨酸、高精氨酸、瓜氨酸、苯基甘氨酸、牛磺酸、碘酪氨酸、硒代半胱氨酸、正亮氨酸(“nle”)、正缬氨酸(“nva”)、β-丙氨酸、l-或d-萘基丙氨酸、鸟氨酸(“orn”)等。肽可针对特定酶的酶促切割而进行设计和优化，例如肿瘤相关蛋白酶、组织蛋白酶b、c或d或血纤维蛋白溶酶蛋白酶。
[0388]
氨基酸还包括d形式的天然和非天然氨基酸。“d
‑”
指示具有“d”(右旋)构型的氨基酸，与天然存在的(“l
‑”
)氨基酸的构型相反。天然和非天然氨基酸可商购获得(sigma chemical co.，advanced chemtech)或使用本领域已知的方法合成。
[0389]
基团“u”和“u'”独立地不存在或是间隔物。如本文所用，术语“间隔物”是指充当连接物的化学部分。在本公开中，间隔物可将抗体、抗体片段或抗原片段与异双官能团连接和/或将异双官能团与肽“z”连接，或者当“z”不存在时，与基团“w”连接。非限制性示例性间隔物包括-nh-、-s-、-o-、-nhc(＝o)ch2ch
2-、-s(＝o)
2-ch2ch
2-、-c(＝o)nhnh-、-c(＝o)o-、-c(＝o)nh-、-ch
2-、-ch2ch
2-、-ch2ch2ch
2-、-ch2＝ch
2-、-c≡c-、-ch＝n-o-、聚乙二醇(peg)、
[0390][0391]
在本公开的化合物中，当“u”存在时，其可以是被1至10个
“‑
c(o)-w-z
‑”
基团取代的分支基团。在一些实施方案中，“u”被1至5个
“‑
c(o)-w-z
‑”
基团取代。在一些实施方案中，“u”被1或2个
“‑
c(o)-w-z
‑”
基团取代。在一些实施方案中，“u”被1个
“‑
c(o)-w-z
‑”
基团取代。在某些实施方案中，间隔物可以是pct公布wo 2018/200812、wo 2018/100558中所公开的间隔物中的任一种，所述公布以引用的方式整体并入。
[0392]
基团“q”是异双官能团。在本公开中，术语“异双官能团”是指将作为其一部分的接头与抗体、抗体片段或抗原结合片段连接的化学部分。参见例如wo 2017/191579。异双官能团的特征为在化学分子的两端具有不同的反应性基团。异双官能团可与“ab”直接连接，或者可通过接头“u'”连接。与“ab”的连接可通过化学或酶促缀合或两者的组合来完成。化学缀合涉及抗体表面上的可及氨基酸残基与“q”或“u'”上的反应柄的受控反应。化学缀合的实例包括但不限于赖氨酸酰胺偶联、半胱氨酸偶联和经由通过基因工程改造所掺入的非天然氨基酸的偶联，其中具有所需反应柄的非天然氨基酸残基被安装至“ab”上。在酶促缀合中，酶介导接头与抗体、抗体片段或抗原结合片段上的可及氨基酸残基的偶联。酶促缀合的实例包括但不限于使用分选酶(sortase)的转肽作用、使用微生物转谷氨酰胺酶的转肽作用和n-聚糖工程改造。化学缀合和酶促缀合也可依序使用。例如，酶促缀合也可用于在“ab”上安装独特的反应柄，以便在随后的化学缀合中加以利用。在某些实施方案中，异双官能团可以是pct公布wo 2018/200812、wo 2018/100558中所公开的任一种，所述公布以引用的方式整体并入。
[0393]
在一些实施方案中，“q”选自
[0394][0395]
其中
[0396]
是与u的连接点，或当u不存在时是与z的连接点；并且
[0397]
是与u'的连接点，或当u'不存在时是与ab的连接点。
[0398]
在某些实施方案中，本公开提供了一种式(xx)化合物：
[0399][0400]
或其药学上可接受的盐，其中n、m、a、t、d-nh-、r1、r2、r3、r
3'
、w、z和u如本文所述，并且其中q*是能够与抗体、抗体片段或抗原结合片段缀合的反应性官能团。合适的q*基团的实例包括但不限于活化的羧基(诸如酰氯-c(o)-cl和酸酐)、卤代乙酰胺、马来酰亚胺、炔烃、环炔烃(诸如环辛炔)、氧杂降冰片二烯(oxanoboradiene)、降冰片烯、叠氮化物、二芳基四嗪、单芳基四嗪、醛、酮、羟胺、乙烯砜和氮丙啶。在某些实施方案中，反应官能基可以是pct公布wo 2018/200812、wo 2018/100558中所公开的反应官能基中的任一种，所述公布以引用的方式整体并入。
[0401]
抗ccr2抗体、抗体片段和抗原结合片段
[0402]
基团“ab”为抗ccr2抗体、抗ccr2抗体片段或抗ccr2抗原结合片段。抗体是由免疫系统产生的蛋白质，其能够识别并与特定抗原结合。靶抗原通常具有许多结合位点，也称为表位，由多种抗体上的cdr识别。与不同表位特异性结合的每种抗体都具有不同结构。因此，一种抗原可具有多于一种对应抗体。本文术语“抗体”以最广泛意义使用并且尤其涵盖单克隆抗体、单结构域抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要
其表现出所需生物活性即可。抗体可以是鼠抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或来源于其他物种的抗体。(janeway,c.,travers,p.,walport,m.,shlomchik(2001)immuno biology,第5版,garland publishing,new york)。
[0403]
有用的抗ccr2抗体、抗体片段和抗原结合片段包括与哺乳动物cc-趋化因子受体2(也称为ccr2、ckr-2、cd192、mcp-1ra或mcp-1rb)或所述受体的一部分结合的抗体(免疫球蛋白)或其功能片段(例如，抗原结合片段)。在一个实施方案中，抗体或其片段对人或恒河猴ccr2或其一部分具有特异性。在另一个实施方案中，抗体或片段阻断配体(例如，mcp-1、mcp-2、mcp-3、mcp-4)与受体的结合并抑制和配体与受体的结合相关的功能(例如，白细胞移行(trafficking))。例如，如本文所述，可用于本公开的抗体及其片段结合人或恒河猴ccr2或其一部分，并且可阻断趋化因子(例如，mcp-1、mcp-2、mcp-3、mcp-4)与受体的结合并抑制与趋化因子与受体的结合相关的功能。在一个实施方案中，抗体是单克隆抗体(mab)ls132.1d9(1d9)或可与1d9竞争结合人ccr2或人ccr2的一部分的抗体。还设想了前述抗体的功能性片段。
[0404]
在一些实施方案中，采用对ccr2具有结合特异性的人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段，所述免疫球蛋白包含非人来源(例如，啮齿类)的抗原结合区和人来源的免疫球蛋白的至少一部分(例如，人框架区、γ型人恒定区)。在一个实施方案中，人源化免疫球蛋白或其片段可与1d9竞争结合ccr2。在一个实施方案中，人源化免疫球蛋白的抗原结合区来源于单克隆抗体1d9(例如，如下文所示，包含轻链和重链的可变区的免疫球蛋白)。
[0405]
例如，人源化免疫球蛋白或其抗原结合片段可包含：抗原结合区，其包含至少一个非人来源的互补决定区(cdr)；和框架区(fr)，其来源于人框架区。在一个方面中，对ccr2具有结合特异性的人源化免疫球蛋白包含：轻链，其包含至少一个来源于非人来源的结合ccr2的抗体的cdr和来源于人来源(例如，来自hf-21/28)的轻链的fr；和重链，其包含来源于非人来源的结合ccr2的抗体的cdr和来源于人来源(例如，来自4b4'cl)的重链的fr。在另一个方面中，轻链包含三个来源于1d9抗体的轻链的cdr，并且重链包含三个来源于1d9抗体的重链的cdr。
[0406]
在一个实施方案中，对ccr2具有结合特异性的人源化免疫球蛋白包含1d9抗体的轻链的cdr1、cdr2和cdr3以及人轻链fr，并且包含1d9抗体的重链的cdr1、cdr2和cdr3以及人重链fr。在一个实施方案中，人源化免疫球蛋白包含本文所述的人源化重链和轻链，例如，包含下文所示的轻链的可变区的人源化轻链，包含下文所示的重链的可变区的人源化重链。还涵盖了包含一个或多个人源化轻链和/或重链的人源化免疫球蛋白。
[0407]
以下示出了人源化1d9抗体的κ轻链可变区(vl)的氨基酸序列。cdr以粗体突出显示：
[0408][0409]
以下示出了人源化1d9抗体的重链可变区(vh)的氨基酸序列。cdr以粗体突出显示：
[0410][0411]
在某些实施方案中，抗ccr2抗体、抗ccr2抗体片段或抗ccr2抗原结合片段包含：轻链cdr1，其包含seq id no:1的氨基酸24-39；轻链cdr2，其包含seq id no:1的氨基酸55-61；轻链cdr3，其包含seq id no:1的氨基酸94-102；重链cdr1，其包含seq id no:2的氨基酸31-35；重链cdr2，其包含seq id no:2的氨基酸50-68；和重链cdr3，其包含seq id no:2的氨基酸101-106。
[0412]
在一些实施方案中，抗ccr2抗体、抗ccr2抗体片段或抗ccr2抗原结合片段包含有包含氨基酸序列seq id no:2的重链可变区。
[0413]
在一些实施方案中，抗ccr2抗体、抗ccr2抗体片段或抗ccr2抗原结合片段包含有包含氨基酸序列seq id no:1的轻链可变区。
[0414]
在一些实施方案中，抗ccr2抗体、抗ccr2抗体片段或抗ccr2抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含氨基酸序列seq id no:2。
[0415]
在一些实施方案中，抗ccr2抗体、抗ccr2抗体片段或抗ccr2抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述轻链可变区包含氨基酸序列seq id no:1。
[0416]
在一些实施方案中，抗ccr2抗体、抗ccr2抗体片段或抗ccr2抗原结合片段包含有包含氨基酸序列seq id no:2的重链可变区以及轻链可变区，其中所述轻链可变区包含氨基酸序列seq id no:1。
[0417]
在某些实施方案中，抗ccr2抗体、抗ccr2抗体片段或抗ccr2抗原结合片段还包含重链恒定区。在一些实施方案中，重链恒定区选自人免疫球蛋白igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2重链恒定区。
[0418]
在一些实施方案中，抗ccr2抗体、抗ccr2抗体片段或抗ccr2抗原结合片段还包含轻链恒定区。在一些实施方案中，轻链恒定区选自由人免疫球蛋白iggκ和iggλ轻链恒定区组成的组。
[0419]
在某些实施方案中，抗ccr2抗体、抗ccr2抗体片段或抗ccr2抗原结合片段与包含seq id no:2的重链可变区和seq id no:1的轻链可变区的抗体结合相同表位。
[0420]“同一性百分比”是指两个序列(例如，氨基酸序列或核酸序列)之间的同一性程度。同一性百分比可通过对两个序列进行比对来确定，引入间隔以使序列之间的同一性最大化。可使用本领域已知的程序来生成比对。出于本文的目的，核苷酸序列的比对可用以默认参数设定的blastn程序进行，并且氨基酸序列的比对可用以默认参数设定的blastp程序进行(参见万维网ncbi.nlm.nih.gov的美国国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information；ncbi))。
[0421]“结合与参考ccr2抗体相同的表位”的ccr2抗体是指结合与参考ccr2抗体相同的ccr2氨基酸残基的抗体。ccr2抗体结合与参考ccr2抗体相同的表位的能力通过氢/氘交换测定来确定(参见coales等人.rapid commun.mass spectrom.2009；23:639-647)。
[0422]
在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段与人ccr2结合，包含seq id no:1和seq id no:2中所列的抗体的六个cdr，并且包含序列与seq id no:2的vh序列至少80％同一的vh和序列与seq id no:1的vl序列至少80％同一的vl。在某些实施方案中，本
文所述的抗体或其抗原结合片段与人ccr2结合，包含seq id no:1和seq id no:2中所列的抗体的六个cdr(即，seq id no:2中所列的抗体的三个vh cdr和seq id no:1的三个vl cdr)，并且包含序列与seq id no:2的vh序列至少85％同一的vh和序列与seq id no:1的vl序列至少85％同一的vl。
[0423]
在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段与人ccr2结合，包含seq id no:1和seq id no:2中所列的抗体的六个cdr(即，seq id no:2的三个vh cdr和seq id no:1的三个vl cdr)，并且包含序列与seq id no:2的vh序列至少90％同一的vh和序列与seq id no:1的vl序列至少90％同一的vl。在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段与人ccr2结合，包含seq id no:1和seq id no:2中所列的抗体的六个cdr(即，抗体的三个vh cdr和seq id no:1的三个vl cdr)，并且包含序列与seq id no:2的vh序列至少95％同一的vh和序列与seq id no:1的vl序列至少95％同一的vl。
[0424]
在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段与人ccr2结合，包含seq id no:1和seq id no:2中所列的抗体的六个cdr(即，seq id no:2的三个vh cdr和seq id no:1的三个vl cdr)，并且包含序列与seq id no:2的vh序列至少96％同一的vh和序列与seq id no:1的vl序列至少96％同一的vl。在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段与人ccr1结合，包含seq id no:1和seq id no:2中所列的抗体的六个cdr(即，seq id no:2的三个vh cdr和seq id no:1的三个vl cdr)，并且包含序列与seq id no:2的vh序列至少97％同一的vh和序列与seq id no:的vl序列至少97％同一的vl。在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段与人ccr2结合，包含seq id no:1和seq id no:2中所列的抗体的六个cdr(即，seq id no:2的三个vh cdr和seq id no:1的三个vl cdr)，并且包含序列与seq id no:2的vh序列至少98％同一的vh和序列与seq id no:1的vl序列至少98％同一的vl。在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段与人ccr2结合，包含seq id no:1和seq id no:2中所列的抗体的六个cdr(即，seq id no:2的三个vh cdr，seq id no:1的三个vl cdr)，并且包含序列与seq id no:2的vh序列至少99％同一的vh和序列与seq id no:1的vl序列至少99％同一的vl。
[0425]
在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段与人ccr2结合，包含seq id no:1和seq id no:2中所列的抗体的六个cdr(即，seq id no:2的三个vh cdr和seq id no:1的三个vl cdr)，包含序列与seq id no:2的vh序列至少80％同一的vh和序列与seq id no:1的vl序列至少80％同一的vl，并且与人、石蟹猕猴、大鼠和/或小鼠ccr2结合。在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段与ccr2结合，包含seq id no:1和seq id no:2中所列的抗体的六个cdr(即，seq id no:2的三个vh cdr和seq id no:1的三个vl cdr)，包含序列与seq id no:2的vh序列至少85％同一的vh和序列与seq id no:1的vl序列至少85％同一的vl，并且与人、石蟹猕猴、大鼠和/或小鼠ccr2结合。
[0426]
在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段与人ccr2结合，包含seq id no:1和seq id no:2中所列的抗体的六个cdr(即，抗体的三个vh cdr和seq id no:1的三个vl cdr)，包含序列与seq id no:2的vh序列至少90％同一的vh和序列与seq id no:1的vl序列至少90％同一的vl，并且与人、石蟹猕猴、大鼠和/或小鼠ccr2结合。在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段与人ccr2结合，包含seq id no:1和seq id no:2中所列的抗体的六个cdr(即，seq id no:2的三个vh cdr和seq id no:1的三个vl cdr)，包
含序列与seq id no:2的vh序列至少95％同一的vh和序列与seq id no:1的vl序列至少95％同一的vl，并且与人、石蟹猕猴、大鼠和/或小鼠ccr2结合。
[0427]
在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段与人ccr2结合，包含seq id no:1和seq id no:2中所列的抗体的六个cdr(即，seq id no:2的三个vh cdr和seq id no:1的三个vl cdr)，包含序列与seq id no:2的vh序列至少96％同一的vh和序列与seq id no:1的vl序列至少96％同一的vl，并且与人、石蟹猕猴、大鼠和/或小鼠ccr2结合。在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段与人ccr2结合，包含seq id no:1和seq id no:2中所列的抗体的六个cdr(即，seq id no:2的三个vh cdr和seq id no:1的三个vl cdr)，包含序列与seq id no:2的vh序列至少97％同一的vh和序列与seq id no:1的vl序列至少97％同一的vl，并且与人、石蟹猕猴、大鼠和/或小鼠ccr2结合。在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段与人ccr2结合，包含seq id no:1和seq id no:2中所列的抗体的六个cdr(即，seq id no:2的三个vh cdr和seq id no:1的三个vl cdr)，包含序列与seq id no:2的vh序列至少98％同一的vh和序列与seq id no:1的vl序列至少98％同一的vl，并且与人、石蟹猕猴、大鼠和/或小鼠ccr2结合。在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段与人ccr2结合，包含seq id no:1和seq id no:2中所列的抗体的六个cdr(即，seq id no:2的三个vh cdr和seq id no:1的三个vl cdr)，包含序列与seq id no:2的vh序列至少99％同一的vh和序列与seq id no:1的vl序列至少99％同一的vl，并且与人、石蟹猕猴、大鼠和/或小鼠ccr2结合。
[0428]
在某些实施方案中，式(i)化合物与结合pd-1的抗体、抗体片段或抗原结合片段和/或结合pd-l1的抗体、抗体片段和/或抗原结合片段组合。pd-1是在活化t细胞、b细胞和单核细胞上表达的免疫检查点蛋白，其在与其配体pd-l1结合之后，例如通过促进抗原特异性t细胞的凋亡和减少调节性t细胞的凋亡来调节免疫系统。pd-l1可由肿瘤表达，以帮助肿瘤逃避免疫系统的检测和消除。对pd-1/pd-l1相互作用的拮抗性抑制有利地增加t细胞活化并增强免疫系统对肿瘤细胞的识别和消除。在某些实施方案中，抗pd-1抗体选自由以下组成的组：帕博利珠单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、西米普利单抗(cemiplimab)、皮米单抗(pimivalimab)、斯巴达珠单抗(spartalizumab)、卡瑞利珠单抗(camrelizumab)、信迪利单抗(sintilimab)、替雷利珠单抗(tislelizumab)、特瑞普利单抗(toripalimab)、多斯塔利单抗(dostarlimab)、埃本利单抗(ezabenlimab)、incmga0012、amp-224、amp-514、sym-021、lzm-009、cs-1003、syn-125、gnr-051、mw-11、ty-101、bat-1306、f520、萨善利单抗(sasanlimab)、派安普利单抗(penpulimab)、普特利单抗(pucotenlimab)、cx-188、赛帕利单抗(zimberelimab)和特泊利单抗(tebotelimab)或可与帕博利珠单抗、纳武单抗、西米普利单抗、皮米单抗、斯巴达珠单抗、卡瑞利珠单抗、信迪利单抗、替雷利珠单抗、特瑞普利单抗、多斯塔利单抗、埃本利单抗、incmga0012、amp-224、amp-514、sym-021、lzm-009、cs-1003、syn-125、gnr-051、mw-11、ty-101、bat-1306、f520、萨善利单抗、派安普利单抗、普特利单抗、cx-188、赛帕利单抗或特泊利单抗竞争结合人pd-1或pd-1的一部分的抗体。
[0429]
在一些实施方案中，抗pd-1抗体是帕博利珠单抗。
[0430]
在某些实施方案中，抗pd-l1抗体选自由以下组成的组：阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、度伐利尤单抗(durvalumab)、柯希利单抗
(cosibelimab)、msb-2311、zkab-001、faz-053、mdx-1105、cbt-502、imc-001、rc-98、kl-a167、gr-1405、洛达利单抗(lodapolimab)、舒格利单抗(sugemalimab)、恩沃利单抗(envafolimab)、欧可利单抗(opucolimab)和加列夫利单抗(garivulimab)或可与阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗、柯希利单抗、msb-2311、zkab-001、faz-053、mdx-1105、cbt-502、imc-001、rc-98、kl-a167、gr-1405、洛达利单抗、舒格利单抗、恩沃利单抗、欧可利单抗或加列夫利单抗竞争结合人pd-l1或pd-l1的一部分的抗体。
[0431]
在一些实施方案中，抗pd-l1抗体是阿特珠单抗。
[0432]
可用于与式(i)化合物组合的其他抗pd-1抗体是nat105(abcam ab5287)；cal20(abcam ab237728)；epr20665(abcam ab214421)；nat105-嵌合(abcam ab216352)；epr4877(2)(abcam ab137132)；ep23119-111(abcam ab 243644)；sp269(abcam ab227681)；pdcd1/1410r(abcam ab218475)；eh12.22h7(abcam ab 223562)；pdcd1/922(abcam ab216037)；j43(abcam ab95789)；j43.1(abcam ab218768)；spm597(abcam ab218474)；j116(abcam ab171267)；rmp1-14(abcam ab171265)；epr18017-203(abcam ab242810)；epr18017-253(abcam ab242562)；epr22234-127(abcam ab259656)；epr22234-42(abcam ab259655)；mab10861(r&d systems)；mab10864(r&dsystems)；mab1086(r&d systems)；mab10863(r&d systems)；mab8578(r&d systems)；mab77381(r&d systems)；mab7738(r&d systems)；mab10866(r&d systems)；mab10865(r&dsystems)；mab10867(r&d systems)；sj01-91(huabio)；1f2(huabio)；3a11 pd-1阻断ab(huabio)；j43(mybiosource)；rmp1-30(mybiosource)；8a1(bioss inc.)；bsr1(abeomics)；pdcd1/922(abeomics)；pd1.3,1.3(miltenyi biotec)；abx174170(abbexa)；pdcd1(fitzgerald industries intl.)；j116(united states biological)；bsr1(nordic biosite)；pdcd1(bosterbio)；10b3(prosci inc.)；4c7(prosci inc.)；mht28阻断(sino biological inc.)；hf06中和(sino biological inc.)；或tk12-02(creative diagnostics)或可与前述抗体中任一种竞争结合pd-1或pd-1的一部分的抗体。
[0433]
可用于与式(i)化合物组合的其他抗pd-l1抗体是28-8(abcam ab205921)；epr19759(abcam ab213524)；cal10(abcam ab237726)；73-10(abcam ab228415)；epr20529(abcam ab213480)；sp142(abcam ab228462)；blr020e(abcam ab243877)；rm1012(abcam ab282458)；epr23546-160(abcam ab252436)；abm4e54(abcam ab210931)；pdl1/2744(abcam ab269674)；mih5(abcam ab269253)；29e,2a3(abcam ab259283)；mih6(abcam ab80276)；bms-5-28(abcam ab278010)；epr23939-25(abcam ab278009)；mab1561(r&dsystems)；mab90871(r&d systems)；mab1562(r&d systems)；mab90783(r&d systems)；mab10348(r&d systems)；mab1561r(r&d systems)；mab9078(r&d systems)；mab10355(r&dsystems)；mih1(invitrogen)；mih5(invitrogen)；rm320(invitrogen)；jj08-95(invitrogen)；485(invitrogen)；ma5-37856(invitrogen)；10d4(invitrogen)；15(invitrogen)；1-111a(invitrogen)；2b11d11(proteintech)；oti2c7(origene)；umab228(origene)；or-5h8(origene)；oti9e12(origene)；umab229(origene)；oti11g4(origene)；oti2c11(origene)；oti14h4(origene)；oti7d4(origene)；oti9e1(origene)；oti11g4(origene)；oti2f5(origene)；oti9a5(origene)；oti3f5(origene)；oti4g4(origene)；oti9e5(origene)；oti13g7(origene)；oti9e10(origene)；oti20g10(origene)；or-5e3
(origene)；oti4d4(origene)；oti13d11(origene)；oti8c8(origene)；oti16h9(origene)；oti12g7(origene)；oti1b12(origene)；oti2e3(origene)；oti2b12(origene)；or-5e4(origene)；blr020e(bethyl laboratories)；3f2(abnova)；3d2(abnova)；2e6(abnova)；2e11(abnova)；1h3(abnova)；2c4(abnova)；ac10(abnova)；3c10(abnova)；或4c11(abnova)或者可与前述抗体中任一种竞争结合pd-l1或pd-l1的一部分的抗体。
[0434]
如本文所用的术语“抗体”也指全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有抗原结合位点的分子，所述抗原结合位点免疫特异性地结合感兴趣的靶标或其部分的抗原，此类靶标包括但不限于癌细胞或产生与自身免疫疾病相关的自身免疫抗体的细胞。本文所公开的免疫球蛋白可以是任何类型(例如，igg、ige、igm、igd和iga)、类别(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或亚类的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白可来源于任何物种。然而，在一个方面中，免疫球蛋白是人、鼠或兔来源。
[0435]
术语“单结构域抗体”也称为纳米抗体，是由单一单体可变抗体结构域组成的抗体片段，分子量为约12kda至约15kda。单体抗体可基于重链可变结构域或轻链。单结构域抗体的实例包括但不限于vhh片段和v
nar
片段。参见例如harmsen m.m.等人applied microbiology and biotechnology 77(1):13-22。
[0436]“抗体片段”包含完整抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段；双抗体；线性抗体；由fab表达文库产生的片段、抗独特型(抗id)抗体、cdr(互补决定区)和上文免疫特异性地结合癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原中任一种的表位结合片段、单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0437]“完整抗体”是包含抗原结合可变区以及轻链恒定结构域(cl)与重链恒定结构域ch1、ch2和ch3的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。
[0438]
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能少量存在的可能天然存在的突变以外，构成所述群体的个别抗体是相同的。单克隆抗体具有高特异性，针对单一抗原位点。此外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备剂相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除其特异性之外，单克隆抗体的优点在于其可在不受其他抗体的污染的情况下合成。修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上均质的抗体群体获得，并且不应解释为需要通过任何特定方法来产生抗体。例如，要根据本公开使用的单克隆抗体可通过首先由kohler等人,nature256:495(1975)描述的杂交瘤方法制成，或可通过重组dna方法制成(参见例如美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”也可使用例如clackson等人(1991)nature，352:624-628；marks等人(1991)j.mol.biol.222:581-597中所描述的技术从噬菌体抗体文库分离。
[0439]
本文的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中对应序列相同或同源，而链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段的对应序列相同或同源，只要它们表现出所需生物活性即可(美国专利号4,816,567；和morrison等人(1984)proc.natl.acad.sci.usa,81:6851-6855)。本文感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，其包含来源于非人灵长类(例如，旧大陆猴、猿等)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列。
497)描述的杂交瘤技术、人b细胞杂交瘤技术(kozbor等人,1983,immunology today 4:72)和ebv-杂交瘤技术(cole等人,1985,monoclonal antibodies and cancer therapy,alan r.liss,inc.,第77-96页)。此类抗体可以是任何免疫球蛋白类别，包括igg、igm、ige、iga和igd以及其任何亚类。本公开中所用的产生mab的杂交瘤可在体外或在体内培养。
[0447]
可用的单克隆抗体包括但不限于人单克隆抗体、人源化单克隆抗体、抗体片段或嵌合人-小鼠(或其他物种)单克隆抗体。人单克隆抗体可通过本领域已知的许多技术中的任一种制成(例如，teng等人,1983,proc.natl.acad.sci.u.s.a.80,7308-7312；kozbor等人,1983,immunology today 4,72-79；以及olsson等人,1982,meth.enzymol.92,3-16)。
[0448]
抗体也可以是双特异性抗体。用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统产生系基于两条免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条链具有不同特异性(milstein等人,1983,nature 305:537-539).。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机组合，这些杂交瘤(四源杂交瘤)产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅一种具有正确双特异性结构。通常使用亲和色谱步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦并且产物产率低。类似程序公开于wo 93/08829以及traunecker等人,embo j.10:3655-3659(1991)中。
[0449]
根据不同方法，将具有所需结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原组合位点)与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。融合物可具有免疫球蛋白重链恒定结构域，其包含铰链区、c
h2
、和c
h3
区的至少一部分。第一重链恒定区(c
h1
)可含有轻链结合所必需的位点，其存在于至少一种融合物中。将具有编码免疫球蛋白重链融合物和必要时免疫球蛋白轻链的序列的核酸插入到单独的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物体中。在当用于构建的三条多肽链的不等比率提供最佳产率时的实施方案中，这为调整三条多肽片段的相互比例提供了极大的灵活性。然而，当以相等比率表达至少两条多肽链产生高产率时或当所述比率不具有特定重要性时，有可能在一个表达载体中插入两条或所有三条多肽链的编码序列。
[0450]
双特异性抗体可在一个臂中具有杂交免疫球蛋白重链(具有第一结合特异性)并且在另一臂中具有杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)。这种不对称结构促进所需双特异性化合物与非所需免疫球蛋白链组合的分离，因为仅在双特异性分子的一半中存在免疫球蛋白轻链提供了容易的分离方式(wo 94/04690；suresh等人,methods in enzymology,1986,121:210；rodrigues等人,1993,j.of immunology 151:6954-6961；carter等人,1992,bio/technology10:163-167；carter等人,1995,j.of hematotherapy 4:463-470；merchant等人,1998,nature biotechnology 16:677-681)。使用此类技术，可制备双特异性抗体，以用于在如本文所定义的疾病的治疗或预防中缀合为adc。
[0451]
杂交或双功能抗体可以生物学方式(即，通过细胞融合技术)或以化学方式(尤其用交联剂或二硫键形成试剂)衍生，并且可包含全抗体或其片段(ep 105360；wo 83/03679；ep 217577)。
[0452]
抗体可以是免疫特异性结合癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的抗体或者与肿瘤细胞或基质结合的其他抗体的功能活性片段、衍生物或类似物。就此而言，“功能活性”表示片段、衍生物或类似物能够引发抗抗独特型抗体，所述抗体识别与衍生出所述片段、衍生物或类似物的抗体所识别的抗原相同的抗原。具体地说，在示例性实施方案中，免疫球蛋白分子的独特型的抗原性可通过缺失框架和在特异性识别抗原的cdr序列的c末端的cdr序列
来增强。为了确定哪些cdr序列结合抗原，可通过本领域已知的任何结合测定方法(例如，bia核测定)，在以抗原进行的结合测定中，使用含有cdr序列的合成肽(参见例如，kabat等人,1991,sequences of proteins ofimmunological interest,第五版,national institute of health,bethesda,md.；kabat e等人,1980,j.of immunology 125(3):961-969)。
[0453]
其他可用的抗体包括抗体片段，诸如但不限于f(ab')2片段，其含有可变区、轻链恒定区和重链ch1结构域，其可通过抗体分子的胃蛋白酶消化来产生；和fab片段，其可通过还原f(ab')2片段的二硫键来产生。其他可用的抗体是抗体重链和轻链二聚物、或其任何最小片段(诸如fvs或单链抗体(sca))(例如，如美国专利号4,946,778；bird,1988,science 242:423-42；huston等人,1988,proc.natl.acad.sci.usa 85:5879-5883；和ward等人,(1989)nature 334:544-54中所述)、或具有与所述抗体相同特异性的任何其他分子。
[0454]
另外，可使用标准重组dna技术制成的包含人和非人部分的重组抗体(诸如嵌合和人源化单克隆抗体)是可用的抗体。嵌合抗体是不同部分来源于不同动物物种的分子，诸如具有来源于鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的分子。(参见例如，cabilly等人,美国专利号4,816,567；和boss等人,美国专利号4,816,397)。人源化抗体是来自非人物种的抗体分子，其具有一个或多个来自非人物种的互补决定区(cdr)和来自人免疫球蛋白分子的框架区。(参见例如，queen,美国专利号5,585,089)此类嵌合和人源化单克隆抗体可通过本领域已知的重组dna技术产生，例如使用以下中所描述的方法：wo 87/02671；ep 184,187；ep 171496；ep 173494；wo 86/01533；美国专利号4,816,567；ep 12023；berter等人,1988,science 240:1041-1043；liu等人,1987,proc.natl.acad.sci.usa 84:3439-3443；liu等人,1987,j.immunol.139:3521-3526；sun等人,1987,proc.natl.acad.sci.usa 84:214-218；nishimura等人,1987,cancer.res.47:999-1005；wood等人,1985,nature 314:446-449；以及shaw等人,1988,j.natl.cancer inst.80:1553-1559；morrison,1985,science 229:1202-1207；oi等人,1986,biotechniques 4:214；美国专利号5,225,539；jones等人,1986,nature 321:552-525；verhoeyan等人(1988)science 239:1534；以及beidler等人,1988,j.immunol.141:4053-4060。
[0455]
可使用不能表达内源性免疫球蛋白重链和轻链基因，但可表达人重链和轻链基因的转基因小鼠来产生完全人抗体。用选定抗原(例如，本公开的多肽的全部或一部分)，以正常方式使转基因小鼠免疫。针对抗原的单克隆抗体可使用常规杂交瘤技术获得。转基因小鼠具有的人免疫球蛋白转基因在b细胞分化期间重排，并且随后经历类别转换和体细胞突变。因此，使用此技术，有可能产生治疗上可用的igg、iga、igm和ige抗体。关于这种用于产生人抗体的技术的概述，参见lonberg和huszar(1995,int.rev.immunol.13:65-93)。关于这种用于产生人抗体和人单克隆抗体的技术以及用于产生此类抗体的方案的详细讨论。参见例如，美国专利号5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806。其他人抗体可商购自例如abgenix,inc.(freemont,calif.)和genpharm(san jose,calif.)。
[0456]
识别选定表位的完全人抗体可使用称为“引导选择”的技术来产生。在这种方法中，使用选定非人单克隆抗体(例如，小鼠抗体)引导识别相同表位的完全人抗体的选择。(jespers等人,(1994)biotechnology 12:899-903)。也可使用本领域已知的各种技术来产生人抗体，包括噬菌体展示文库(hoogenboom和winter,j.mol.biol.,227:381(1991)；
marks等人,j.mol.biol.,222:581(1991))。
[0457]
抗体可以是抗体的融合蛋白或其功能活性片段，例如在所述抗体的融合蛋白或其功能活性片段中，抗体经由共价键(例如，肽键)在n末端或c末端处与不是抗体的另一种蛋白质(或其部分，诸如蛋白质的至少10、20或50个氨基酸的部分)的氨基酸序列融合。抗体或其片段可在恒定区的n末端处共价连接至另一蛋白质。
[0458]
抗体包括被任一修饰的类似物和衍生物，即通过任何类型的分子的共价连接，只要此类共价连接使抗体保留其抗原结合免疫特异性即可。例如，但不加以限制，抗体的衍生物和类似物包括例如通过以下被进一步修饰的抗体的衍生物和类似物：糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过任何已知保护/阻断基衍生化、蛋白酶水解切割、与细胞抗体单元或其他蛋白质键联等。众多化学修饰中的任一种均都可通过已知技术进行，包括但不限于特定化学切割、乙酰化、甲酰化、在存在衣霉素的情况下的代谢合成等。另外，类似物或衍生物可含有一种或多种非天然氨基酸。
[0459]
抗体药物缀合物中的抗体包括在与fc受体相互作用的氨基酸残基中具有修饰(例如，取代、缺失或添加)的抗体。具体而言，抗体包括在鉴定为参与抗fc结构域与fcrn受体之间的相互作用的氨基酸残基中具有修饰的抗体(参见例如，wo 97/34631)。对癌细胞抗原具有免疫特异性的抗体可例如从genentech(san francisco,calif.)商购获得或通过本领域技术人员已知的任何方法(例如，化学合成或重组表达技术)产生。编码对癌细胞抗原具有免疫特异性的抗体的核苷酸序列可例如从genbank数据库或与其类似的数据库、文献出版物或通过常规克隆和测序来获得。
[0460]
adc的抗体可以是单克隆抗体(例如，鼠单克隆抗体)、嵌合抗体或人源化抗体。抗体可以是抗体片段，例如fab片段。
[0461]
用于治疗或预防癌症的已知抗ccr2抗体可缀合为adc。对癌细胞抗原具有免疫特异性的抗体可商购获得或通过本领域技术人员已知的任何方法(例如，重组表达技术)产生。编码对癌细胞抗原具有免疫特异性的抗体的核苷酸序列可例如从genbank数据库或与其类似的数据库、文献出版物或通过常规克隆和测序来获得。可用于治疗癌症的抗体的实例包括但不限于sti-b020x(抗ccr2单克隆抗体，sorrento therapeutics)、mc-21(抗ccr2人源化抗体，university of regensburt/mrc；描述于欧洲专利号2004692中，其以引用的方式并入本文)、4.40a68g(pfizer/amgen；描述于美国专利号8710191中，其以引用的方式并入本文)、uniti-101(csf-1r x ccr2双特异性抗体，elstar therapeutics)和wo97/31949(其以引用的方式并入本文)中所描述的那些。
[0462]
术语“氨基酸序列变体”是指氨基酸序列与天然序列多肽有一定程度差异的多肽。通常，氨基酸序列变体应与天然抗体的至少一个受体结合结构域或与天然受体的至少一个配体结合结构域具有至少约70％序列同一性，并且通常，其与此类受体或配体结合结构域具有至少约80％、更通常至少约90％序列同源性。氨基酸序列变体在天然氨基酸序列的氨基酸序列内的某些位置处具有取代、缺失基/或插入。氨基酸由常规名称、单字母和三字母代码来指定。
[0463]“序列同一性”定义为在比对序列并在必要时引入间隔以实现最大百分比序列同一性之后，氨基酸序列变体中相同残基的百分比。用于比对的方法和计算机程序是本领域众所周知的。一种此类计算机程序是“align 2”，由genentech,inc.编写，其在1991年12月
10日连同用户文档一起提交给华盛顿特区20559号的美国版权局(united states copyright office,washington,d.c.20559)。
[0464]
术语“fc受体”或“fcr”用于描述与抗体fc区结合的受体。示例性fcr是天然序列人fcr。此外，fcr可以是结合igg抗体的受体(γ受体)并包括fcγri、fcγrii和fcγriii亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和选择性剪接形式。fcγrii受体包括fcγriia(“活化受体”)和fcγriib(“抑制受体”)，其具有主要在其细胞质结构域方面有差异的类似氨基酸序列。活化受体fcγriia在其细胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif；itam)。抑制受体fcγriib在其细胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸抑制基序(itim)。(综述参见m.daeron,annu.rev.immunol.,15:203-234(1997))。fcr综述于ravetch和kinet,annu.rev.immunol.,9:457-92(1991)；capel等人,immunomethods,4:25-34(1994)；和de haas等人,j.lab.clin.med.,126:330-41(1995)中。其他fcr(包括将来要鉴定的fcr)在本文中由术语“fcr”涵盖。所述术语还包括新生儿受体fcrn，其负责将母体igg转移至胎儿(guyer等人,j.immunol.,117:587(1976)和kim等人,j.immunol.,24:249(1994))。
[0465]“补体依赖性细胞毒性”或“cdc”是指在存在补体的情况下，分子裂解靶标的能力。补体活化途径通过补体系统的第一组分(c1q)结合与同源抗原复合的分子(例如，抗体)来起始。为了评定补体活化，可进行cdc测定，例如，如gazzano-santoro等人,j.immunol.methods,202:163(1996)中所述。
[0466]“天然抗体”通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由两条相同的轻(l)链和两条相同的重(h)链构成。每条轻链通过一个共价二硫键连接至重链，而在不同免疫球蛋白同种型的重链中，二硫键联的数目不同。每条重链和轻链也具有规则间隔的链内二硫键。每条重链在一端具有可变结构域(vh)，接着是多个恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(vl)，并且在其另一端具有恒定结构域。轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。据信，特定氨基酸残基在轻链可变结构域与重链可变结构域之间的形成界面。
[0467]
术语“可变”是指以下事实，即抗体之间可变结构域的某些部分的序列广泛不同并且用于每个特定抗体对其特定抗原的结合和特异性中。然而，可变性并非在抗体可变结构域中均匀分布。其集中于轻链和重链可变结构域中的三个称作高变区的区段中。可变结构域的较高度保守部分称为框架区(fr)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个fr，主要采用β-折叠构型，通过三个高变区连接，所述三个高变区形成环连接β-折叠结构，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过fr紧密保持在一起，并且与另一条链中的高变区一起，有助于形成抗体的抗原结合位点(参见kabat等人(1991)sequences of proteins of immunological interest,第5版public health service,national institutes of health,bethesda,md.)。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(adcc)。
[0468]
术语“高变区”当在本文中使用时是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含“互补决定区”或“cdr”的氨基酸残基(例如，轻链可变结构域中的残基24-34(l1)、50-56(l2)和89-97(l3)以及重链可变结构域中的残基31-35(h1)、50-65(h2)和95-102(h3)；kabat等人同上)和/或“高变环”的残基(例如，轻链可变结构域中的残基26-32(l1)、
50-52(l2)和91-96(l3)以及重链可变结构域中的残基26-32(h1)、53-55(h2)和96-101(h3)；chothia和lesk(1987)j.mol.biol.,196:901-917)。“框架区”或“fr”残基为除如本文所定义的高变区残基之外的可变结构域残基。
[0469]
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“fab”片段(其各自具有单一抗原接合位点)和残基“fc”片段(其名称反映其易于结晶的能力)。木瓜蛋白酶处理得到f(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点并且仍能够交联抗原。
[0470]“fv”是最小抗体片段，其含有完整抗原识别和抗原结合位点。此区域由一条重链和一条轻链可变结构域以紧密、非共价缔合的二聚物组成。在此构型中，每个可变结构域的三个高变区相互作用以在vh-vl二聚物的表面上限定抗原结合位点。总之，六个高变区赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单一可变结构域(或仅包含三个对抗原具有特异性的高变区的fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，但亲和力低于完整结合位点。
[0471]
fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(ch1)。fab'片段与fab片段的不同之处在于在重链ch1结构域的羧基末端处添加了数个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。fab'-sh在本文中是其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有至少一个游离硫醇基的fab'的指定。f(ab')2抗体片段最初作为在其之间具有铰链半胱氨酸的成对fab'片段而产生。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
[0472]
来自任何脊椎动物物种的抗体的“轻链”均可基于其恒定结构域的氨基酸序列而归为两种截然不同类型(称为κ和λ)之一。
[0473]“单链fv”或“scfv”抗体片段包含抗体的vh和vl结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。fv多肽还可在vh与vl结构域之间包含多肽接头，这使得scfv能够形成抗原结合的所需结构。关于scfv的综述，参见pluckthun,the pharmacology of monoclonal antibodies,第113卷,rosenburg和moore编,springer-verlag,new york,第269-315页(1994)。抗erbb2抗体scfv片段描述于wo 93/16185、美国专利号5,571,894和5,587,458中。
[0474]
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段在同一多肽链(vh-vl)中包含连接至轻链可变结构域(vl)的重链可变结构域(vh)。通过使用过短而使得同一链上的两个结构域之间不能配对的接头，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体更充分地描述于例如ep 404,097；wo 93/11161；以及hollinger等人(1993)proc.natl.acad.sci.usa 90:6444-6448中。
[0475]“人源化”形式的非人(例如，啮齿动物)抗体是含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。人源化是将鼠抗原结合信息转移至非免疫原性人抗体受体的方法，并且已得到许多治疗上可用的药物。人源化的方法通常通过将全部六个鼠互补决定区(cdr)转移至人抗原框架来开始(jones等人,(1986)nature 321:522-525)。这些cdr嫁接抗体通常不保留其原始抗原结合亲和力，并且实际上，亲和力常常被严重削弱。除cdr之外，还必须掺入选择非人抗体框架残基以维持适当的cdr构形(chothia等人(1989)nature 342:877)。已经证明将关键的小鼠框架残基转移至人接受者以支持嫁接cdr的结构构形可恢复抗原结合和亲和力(riechmann等人,(1992)j.mol.biol.224,487-499；foote和winter,(1992)j.mol.biol.224:487-499；prest a等人,(1993)j.immunol.151,2623-2632；werther等人,(1996)j.immunol.methods 157:4986-4995；以及presta等人(2001)thromb.haemost.85:379-389)。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受体抗体)，其中来自接受体的
高变区的残基被来自非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、兔或具有所需特异性、亲和力和能力的非人灵长类动物)的高变区的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(fr)残基被对应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含存在于接受体抗体或供体抗体中的残基。进行这些修饰以进一步完善抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含基本上全部至少一个并且通常两个可变结构域，其中全部或基本上全部高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且全部或基本上全部fr是人免疫球蛋白序列的fr。人源化抗体任选地还将包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。有关进一步细节参见，美国专利号6,407,213；jones等人(1986)nature,321:522-525；riechmann等人(1988)nature 332:323-329；以及presta,(1992)curr.op.struct.biol.,2:593-596。
[0476]“母体抗体”是氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基被一个或多个半胱氨酸残基替换的抗体。母体抗体可包含天然或野生型序列。相对于其他天然、野生型或修饰形式的抗体，母体抗体可具有预先存在的氨基酸序列修饰(诸如添加、缺失和/或取代)。母体抗体针对感兴趣的靶抗原。针对非多肽抗原(诸如肿瘤相关糖脂抗原；参见美国专利号5,091,178)的抗体也在考虑之列。
[0477]“分离的”抗体是已鉴定并与其天然环境的组分分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染物组分是干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白溶质。在某些实施方案中，抗体将纯化至(1)按重量计大于95％抗体(如通过劳里(lowry)法所确定)或多于按重量计99％，(2)通过使用气相蛋白质测序仪足以获得至少15个残基的n末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)通过sds-page在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或银染色剂具有均一性。分离的抗体包括原位处于重组细胞内的抗体，因为抗体天然环境的至少一种组分将不存在。然而通常，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来制备。
[0478]“结合”分子靶标或感兴趣的抗原的抗体是能够以足够亲和力结合所述抗原的抗体，使得抗体可用于靶向表达抗原的细胞。
[0479]
术语“治疗”是指治疗性治疗和防治性或预防性措施，其中目标是预防或减缓(减轻)非所需生理变化或病症，诸如癌症的发展或扩散。出于本公开的目的，有益或所需临床结果包括但不限于减轻症状、减弱疾病程度、疾病状态稳定(即，未恶化)、延迟或减慢疾病进展、改善或缓和疾病状态和缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可表示如与未接受治疗的情况下的预期生存期相比使生存期延长。需要治疗者包括已经患有疾患或病症者以及倾向于患有疾患或病症者或其中要预防疾患或病症者。
[0480]“噬菌体展示”是使变体多肽呈与噬菌体(例如，丝状噬菌体)颗粒表面上的包被蛋白质的融合蛋白来展示的技术。噬菌体展示的一种效用在于以下事实，即可针对以高亲和力与靶分子结合的序列对大型随机化的蛋白质变体的文库进行快速且有效的分选。噬菌体上肽和蛋白质文库的展示已用于筛选数百万种多肽中具有特异性结合特性的多肽。多价噬菌体展示方法已用于展示小的随机肽和小的蛋白质，其通常通过与丝状噬菌体的piii或pviii的融合物来进行。wells和low man,curr.opin.struct.biol.,3:355-362(1992)，以及其中所引用的参考文献。在单价噬菌体展示中，将蛋白质或多肽文库与噬菌体包被蛋白质或其部分融合，并且在存在野生型蛋白质的情况下以低水平表达。亲合力效果相对于多价噬菌体而减少，使得分选是基于内在配体亲合力，并且使用噬菌粒(phagemid)载体，其简
化dna操作。lowm an和wells,methods:a companion to methods in enzymology,3:205-0216(1991)。噬菌体展示包括用于产生抗体样分子的技术(janewa y,c.,travers,p.,walport,m.,shlomchik(2001)immunobiology,第5版,garland publishing,new york,第627-628页)。
[0481]“噬菌粒”是具有细菌复制原点(例如，co1e1)和噬菌体的基因间区域的拷贝的质粒载体。噬菌粒可用于任何已知噬菌体，包括丝状噬菌体和λ形噬菌体。质粒通常还含有抗生素耐药性的可选择标志物。克隆到这些载体中的dna区段可作为质粒繁殖。当携带这些载体的细胞具有产生噬菌体颗粒所必需的所有基因时，质粒的复制模式改变成滚环式复制，以产生一股质粒dna的拷贝并包装噬菌体颗粒。噬菌粒可形成感染性或非感染性噬菌体颗粒。此术语包括含有噬菌体包被蛋白质基因或其片段的噬菌粒，所述噬菌体包被蛋白质基因或其片段作为基因融合物连接至异源多肽基因，使得所述异源多肽基因展示于噬菌体颗粒表面。本文所述的化合物可呈药学上或药学上可接受的盐的形式。在一些实施方案中，此类盐来源于无机或有机酸或碱。有关合适盐的综述参见例如，berge等人,j.pharm.sci.,1977,66,1-19以及remington:the science and practice of pharmacy,第20版,a.gennaro(编),lippincott williams&wilkins(2000)。
[0482]
在本公开中，基团“ab”(即，抗体、抗体片段和/或抗原片段)可与多于一个含药物部分缀合。在一些实施方案中，“ab”可与1至20个含药物部分缀合。在一些实施方案中，“ab”可与1至10个含药物部分缀合。在一些实施方案中，“ab”可与1至5个含药物部分缀合。在一些实施方案中，“ab”可与1或2个含药物部分缀合。在一些实施方案中，“ab”可与一个含药物部分缀合。
[0483]
在本公开的一些方面中，adc与结合pd-1的抗体和/或结合pdl-1的抗体组合。
[0484]
本文所述的化合物可呈药学上或药学上可接受的盐的形式。在一些实施方案中，此类盐衍生自无机或有机酸或碱。关于合适盐的综述参见例如，berge等人,j.pharm.sci.,1977,66,1-19以及remington:the science and practice of pharmacy,第20版,a.gennaro(编),lippincott williams&wilkins(2000)。
[0485]
合适的酸加成盐的实例包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡萄糖庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐(pamoate)、果胶酯酸盐(pectinate)、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐和十一酸盐。
[0486]
合适的碱加成盐的实例包括铵盐；碱金属盐，诸如钠盐和钾盐；碱土金属盐，诸如钙盐和镁盐；与有机碱的盐，诸如二环己胺盐、n-甲基-d-葡糖胺；以及与氨基酸的盐，诸如精氨酸、赖氨酸等。
[0487]
例如，berge列出了以下fda批准的市售盐：阴离子乙酸盐、苯磺酸盐(besylate；benzenesulfonate)、苯甲酸盐、碳酸氢盐、酒石酸氢盐、溴化物、依地酸钙(乙二胺四乙酸盐)、樟脑磺酸盐(camsylate；camphorsulfonate)、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、二盐酸盐、依地酸盐(乙二胺四乙酸盐)、乙二磺酸盐(1,2-乙二磺酸盐)、月桂基硫酸盐(estolate；
lauryl sulfate)、乙磺酸盐(esylate；ethanesulfonate)、富马酸盐、葡萄糖庚酸盐(gluceptate；glucoheptonate)、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酰基对氨基苯胂酸盐(glycollylarsanilate；glycollamidophenylarsonate)、己基间苯二酚酸盐(hexylresorcinate)、海巴胺(hydrabamine)(n,n'-二(脱氢枞)乙二胺)、氢溴酸盐、盐酸盐、羟基萘甲酸盐、碘化物、羟基乙磺酸盐(2-羟基乙磺酸盐)、乳酸盐、乳糖酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐(mandelate)、甲磺酸盐(mesylate；methanesulfonate)、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐(mucate)、萘磺酸盐(2-萘磺酸盐)、硝酸盐、双羟萘酸盐(embonate)、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐(polygalacturonate)、水杨酸盐、硬脂酸盐、次乙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐(teoclate)(8-氯茶酸盐)和三乙碘化物；有机阳离子苄星(n,n'-二苄基乙二胺)、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(meglumine)(n-甲基葡糖胺)和普鲁卡因；和金属阳离子铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌。
[0488]
berge另外列出了以下非fda批准的市售(美国以外)盐：阴离子己二酸盐、藻酸盐、氨基水杨酸盐、脱水亚甲基柠檬酸盐、槟榔碱、天冬氨酸盐、硫酸氢盐、丁基溴化物、樟脑酸盐、二葡糖酸盐、二氢溴酸盐、二琥珀酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、氢氟酸盐、氢碘酸盐、亚甲基双(水杨酸盐)、萘二磺酸盐(napadisylate)(1,5-萘二磺酸盐)、草酸盐、果胶酯酸盐、过硫酸盐、苯丁酰巴比土酸盐(phenylethylbarbiturate)、苦味酸盐、丙酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐和十一酸盐；有机阳离子苯乙胺(n-苄基苯乙胺)、克立咪唑(clemizole)(1-对氯苄基-2-吡咯烷-1'-基甲基苯并咪唑)、二乙胺、哌嗪和氨丁三醇(tromethamine)(三(羟基甲基)氨基甲烷)；以及金属阳离子钡和铋。
[0489]
本文所述的化合物还可包含合适的载剂、赋形剂和助剂，其可根据施用方式而有所不同。
[0490]
在一些实施方案中，药物组合物可配制为合适的胃肠外剂型。所述制剂可通过本领域已知的各种方法制备。药物组合物可直接施用至血流、肌肉或直接施用至器官中。用于胃肠外施用的合适手段包括静脉内施用、动脉内施用、腹膜内施用、鞘内施用、心室内施用、尿道内施用、胸骨内施用、颅内施用、肌肉内施用和皮下施用。用于胃肠外施用的合适装置包括针式注射器、无针注射器和输注技术。
[0491]
胃肠外组合物通常是水溶液，其可含有赋形剂，诸如盐、碳水化合物和缓冲剂。然而，组合物也可配制成无菌非水溶液或有待与合适的媒介物(诸如无菌无热原水)一起使用的干燥形式。
[0492]
在无菌条件下(例如，通过冻干)制备胃肠外组合物可易于使用本领域技术人员众所周知的标准技术完成。
[0493]
用于胃肠外施用的制剂可配制成立即释放型和/或调节释放型。调节释放型制剂包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、靶向释放和程序化释放。因此，组合物可配制为固体、半固体或触变性液体以便作为植入贮库施用，提供活性剂的调节释放。
[0494]
胃肠外制剂可与胃肠外剂型中所用的其他药学上可接受的赋形剂掺混，诸如但不限于防腐剂。
[0495]
在另一个实施方案中，药物组合物可配制为合适的口服剂型，诸如片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、悬浮液、溶液、乳液等。可存在其他合适的载剂，诸如崩解剂、稀释剂、螯合剂、粘
合剂、助滑剂、润滑剂、填充剂、增量剂、膨松剂、防粘剂等。
[0496]
口服剂量制剂还可含有其他合适的药物赋形剂，诸如甜味剂、媒介物/湿润剂、着色剂、风味剂、防腐剂、增粘/增稠剂等。
[0497]
本公开的药物组合物的剂量可针对个别患者定制。
[0498]
术语“放射”是指光子放射或粒子放射。在一些实施方案中，放射可以是光子放射(x射线和γ射线)。在此类实施方案中，光子可呈高能量光子束从放射性源诸如钴或直线加速器产生。在一些实施方案中，放射可以是粒子放射(诸如，电子、质子、中子、碳离子、α粒子和β粒子)。粒子放射可由直线加速器产生。在一些实施方案中，放射可以是电子束。在一些实施方案中，放射可以是质子束。在一些实施方案中，放射可以是中子束。
[0499]
在一些实施方案中，放射可通过外部束放射递送。在一些实施方案中，外部束放射可以是三维适形放射疗法(3d-crt)。在一些实施方案中，外部束放射可以是调强放射疗法(imrt)。在一些实施方案中，外部束放射可以是图像引导放射疗法(igrt)。在一些实施方案中，外部束放射可以是调强质子疗法(impt)。在一些实施方案中，外部束放射可以是立体定位放射外科手术(srs)。在一些实施方案中，外部束疗法可以是分次立体定向放射疗法。在一些实施方案中，外部束放射可以是身体立体定向放射疗法(sbrt)。提供sbrt的机器的实例是gamma和在一些实施方案中，可使用三维适形或身体立体定向放射疗法递送来施用放射。
[0500]
在一些实施方案中，放射可通过体内放射疗法(internal radiation therapy)(近距离放射疗法(brachytherapy))递送。在此类实施方案中，体内放射疗法可以是例如使用靠近癌症或肿瘤部位放置的小颗粒、种子(seed)、线或管进行的间隔放射。在此类实施方案中，体内放射疗法可以是例如使用可放置在体腔中的放射性物质容器进行的腔内放射。
[0501]
化合物和组合物的使用方法
[0502]
本文所述的某些化合物是sting激动剂，并且因此可用于刺激其受试者的免疫反应。组合物可用于治疗癌症。
[0503]
本公开的化合物显示出sting的调节/激动活性。本公开的某些化合物就功效表达、药物动力学(例如，吸收、分布、代谢、排泄)、溶解性(例如，水溶性)、与其他药剂的相互作用(例如，药物代谢酶抑制作用)、安全性(例如，急性毒性、慢性毒性、遗传毒性、生殖毒性、心脏毒性、致癌性、中枢毒性)和/或稳定性(例如，化学稳定性、对酶的稳定性)而言是优良的，并且可用作药剂。
[0504]
本公开的化合物可用于增加哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、狗、奶牛、绵羊、猴、人)的sting活性。
[0505]
本公开的化合物可用作药剂，诸如用于预防或治疗可受sting影响的疾病(在本说明书中，有时缩写为“sting相关疾病”)，例如癌症，例如结肠直肠癌(例如，结肠直肠癌、直肠癌、肛门癌、家族性结肠直肠癌、遗传性非息肉病性结肠直肠癌、胃肠道间质瘤)、肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、恶性间皮瘤)、间皮瘤、胰脏癌(例如，胰脏导管癌、胰脏内分泌瘤)、咽癌、喉癌、食道癌、胃癌(例如，乳头状腺癌、粘液腺癌、腺鳞癌)、十二指肠癌、小肠癌、乳腺癌(例如，侵袭性导管癌、非侵袭性导管癌、炎性乳腺癌)、卵巢癌(例如，卵巢上皮癌、性腺外生殖细胞瘤、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤(ovarian low-malignant potential tumor))、睾丸肿瘤、前列腺癌(例如，激素依赖性前列腺癌、非激素依赖性前列
腺癌、去势抗性前列腺癌)、肝癌(例如，肝细胞癌、原发性肝癌、肝外胆管癌)、甲状腺癌(例如，甲状腺髓样癌)、肾癌(例如，肾细胞癌(例如，透明细胞肾细胞癌)、肾盂和输尿管的移行细胞癌)、子宫癌(例如，宫颈癌、子宫体癌、子宫肉瘤)、妊娠绒毛膜癌、脑瘤(例如，髓母细胞瘤、神经胶质瘤、松果体星形细胞瘤、毛状星形细胞瘤、弥漫性星形细胞瘤、间变型星形细胞瘤、垂体腺瘤)、视网膜母细胞瘤、皮肤癌(例如，基底细胞瘤、恶性黑色素瘤)、肉瘤(例如，横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、软组织肉瘤、梭形细胞肉瘤)、恶性骨肿瘤、膀胱癌、血癌(例如，多发性骨髓瘤、白血病(例如，急性骨髓性白血病)、恶性淋巴瘤、霍奇金氏病(hodgkin'sdisease)、慢性骨髓增生性疾病)、原发灶不明癌；癌症生长抑制剂；癌症转移抑制剂；细胞凋亡促进剂；用于治疗癌前病变(例如，骨髓增生异常综合征)的剂；等。
[0506]
在某些实施方案中，本公开的化合物可用作结肠直肠癌、乳腺癌、皮肤癌、恶性淋巴瘤或肺癌的药剂。
[0507]
在某些实施方案中，本公开的化合物可与抗体疗法同时使用。在一些实施方案中，抗体疗法包括抗pd-1抗体。在一些实施方案中，抗体疗法包括抗pd-l1抗体。
[0508]
在某些实施方案中，本公开的化合物可与抗体疗法和放射疗法同时使用。在一些实施方案中，放射疗法可以是光子放射疗法。在一些实施方案中，放射疗法可以是粒子放射疗法。
[0509]
此外，本公开的化合物可与非药物疗法同时使用。准确地说，本公开的化合物或本公开的组合剂可与非药物疗法组合，诸如(1)手术、(2)使用血管紧张素ii等的高血压化疗、(3)基因疗法、(4)热疗、(5)冷疗、(6)激光烧灼和(7)放射疗法。
[0510]
例如，通过在上文提及的手术等之前或之后，或在其中两种或三种的组合治疗之前或之后使用本公开的化合物，可获得诸如预防耐药性出现、延长无疾病生存期、抑制癌症转移或复发、延长生命等的效果。
[0511]
在一些实施方案中，本公开涉及一种治疗患者的癌症的方法，其通过向需要所述治疗的患者施用式(i)化合物或其药学上可接受的盐和放射的组合来进行。
[0512]
在一些实施方案中，本公开涉及一种治疗患者的癌症的方法，其通过向需要所述治疗的患者施用式(i)化合物或其药学上可接受的盐、一种或多种检查点抑制剂和放射的组合来进行。在一些实施方案中，一种或多种检查点抑制剂包含抗体。在一些实施方案中，一种或多种检查点抑制剂包含抗pd-1抗体，在一些实施方案中，一种或多种检查点抑制剂包含抗pd-l1抗体。
[0513]
在一些实施方案中，本公开涉及式(i)化合物或其药学上可接受的盐与检查点抑制剂和放射组合用于治疗患者的癌症的用途。
[0514]
在一些实施方案中，本公开涉及一种组合物，其包含式(i)化合物或其药学上可接受的盐，用于治疗患者的癌症，其中患者也用一种或多种检查点抑制剂和放射治疗。在一些实施方案中，本公开涉及一种组合物，其包含式(i)化合物或其药学上可接受的盐，用于治疗患者的癌症，其中式(i)化合物或其药学上可接受的盐与一种或多种检查点抑制剂和放射组合。在一些实施方案中，式(i)化合物可与检查点抑制剂、放射和/或其组合同时或依序施用。在一些实施方案中，本公开涉及治疗癌症的方法，其包括向需要此类治疗的患者施用治疗有效量的式(i)化合物、一种或多种检查点抑制剂和放射的组合。
[0515]
在一些实施方案中，放射可在施用检查点抑制剂和/或式(i)化合物之前至少5小
时施用。在一些实施方案中，放射可在施用检查点抑制剂和/或式(i)化合物之前至少10小时施用。在一些实施方案中，放射可在施用检查点抑制剂和/或式(i)化合物之前至少20小时施用。在一些实施方案中，放射可在施用检查点抑制剂和/或式(i)化合物之前至少40小时施用。在一些实施方案中，放射可在施用检查点抑制剂和/或式(i)化合物之前至少80小时施用。
[0516]
在一些实施方案中，放射可在每周第1-5天中的每天施用并重复2至8周。在一些实施方案中，放射可在每周第1-5天中的每天施用并重复6至8周。在一些实施方案中，放射可在每周第1-5天中的每天施用并重复2周。在一些实施方案中，放射可在每周第1-5天中的每天施用并重复3周。在一些实施方案中，放射可在每周第1-5天中的每天施用并重复4周。在一些实施方案中，放射可在每周第1-5天中的每天施用并重复5周。在一些实施方案中，放射可在每周第1-5天中的每天施用并重复6周。在一些实施方案中，放射可在每周第1-5天中的每天施用并重复7周。在一些实施方案中，放射可在每周第1-5天中的每天施用并重复8周。
[0517]
在一些实施方案中，放射可在每周第1-5天中的任两天施用并重复5至8周。在一些实施方案中，放射可在每周第1-5天中的任两天施用并重复6至8周。在一些实施方案中，放射可在每周第1-5天中的任两天施用并重复5周。在一些实施方案中，放射可在每周第1-5天中的任两天施用并重复6周。在一些实施方案中，放射可在每周第1-5天中的任两天施用并重复7周。在一些实施方案中，放射可在每周第1-5天中的任两天施用并重复8周。
[0518]
在一些实施方案中，检查点抑制剂可每十二周施用一次，每四周施用一次，每三周施用一次，每两周施用一次，每周施用一次，每周施用两次，每周施用三次或每天施用。在一些实施方案中，检查点抑制剂可每两周施用一次。在一些实施方案中，检查点抑制剂可每三周施用一次。在一些实施方案中，检查点抑制剂可每四周施用一次。在一些实施方案中，检查点抑制剂可每十二周施用一次。
[0519]
在某些实施方案中，放射在施用检查点抑制剂和/或式(i)化合物之前至少40小时施用。在某些实施方案中，放射在施用检查点抑制剂和/或式(i)化合物之前至少30小时施用。在某些实施方案中，放射在施用检查点抑制剂和/或式(i)化合物之前至少20小时施用。在某些实施方案中，放射在施用检查点抑制剂和/或式(i)化合物之前至少10小时施用。在某些实施方案中，放射在施用检查点抑制剂和/或式(i)化合物之前至少5小时施用。在某些实施方案中，放射在施用检查点抑制剂和/或式(i)化合物之前至少1小时施用。
[0520]
在一些实施方案中，式(i)化合物和/或检查点抑制剂可在患者接受放射治疗之后1天至3个月向患者施用。在一些实施方案中，式(i)化合物和/或检查点抑制剂可在患者接受放射治疗之后1天至2个月向患者施用。在一些实施方案中，式(i)化合物和/或检查点抑制剂可在患者接受放射治疗之后1天至1个月向患者施用。在一些实施方案中，式(i)化合物和/或检查点抑制剂可在患者接受放射治疗之后1天至15天向患者施用。在一些实施方案中，式(i)化合物和/或检查点抑制剂可在患者接受放射治疗之后1天至7天向患者施用。
[0521]
在一些实施方案中，放射可以约1gy至约100gy的分次剂量施用。在一些实施方案中，放射可以约1gy至约50gy的分次剂量施用。在一些实施方案中，放射可以约1gy至约20gy的分次剂量施用。在一些实施方案中，放射可以约5gy至约20gy的分次剂量施用。在一些实施方案中，放射可以约6gy至约18gy的分次剂量施用。在一些实施方案中，放射可以约8gy至约16gy的分次剂量施用。在一些实施方案中，放射可以约5gy至约10gy的分次剂量施用。在
一些实施方案中，放射可以约10gy至约15gy的分次剂量施用。在一些实施方案中，放射可以约15gy至约20gy的分次剂量施用。在一些实施方案中，放射可以约8gy或约16gy的分次剂量施用。
[0522]
在一些实施方案中，放射可以约1gy的分次剂量施用。在一些实施方案中，放射可以约2gy的分次剂量施用。在一些实施方案中，放射可以约3gy的分次剂量施用。在一些实施方案中，放射可以约4gy的分次剂量施用。在一些实施方案中，放射可以约5gy的分次剂量施用。在一些实施方案中，放射可以约6gy的分次剂量施用。在一些实施方案中，放射可以约7gy的分次剂量施用。在一些实施方案中，放射可以约8gy的分次剂量施用。在一些实施方案中，放射可以约9gy的分次剂量施用。在一些实施方案中，放射可以约10gy的分次剂量施用。在一些实施方案中，放射可以约11gy的分次剂量施用。在一些实施方案中，放射可以约12gy的分次剂量施用。在一些实施方案中，放射可以约13gy的分次剂量施用。在一些实施方案中，放射可以约14gy的分次剂量施用。在一些实施方案中，放射可以约15gy的分次剂量施用。在一些实施方案中，放射可以约16gy的分次剂量施用。在一些实施方案中，放射可以约17gy的分次剂量施用。在一些实施方案中，放射可以约18gy的分次剂量施用。在一些实施方案中，放射可以约19gy的分次剂量施用。在一些实施方案中，放射可以约20gy的分次剂量施用。
[0523]
在一些实施方案中，放射可分次施用。在一些实施方案中，放射可分1至10次施用。在一些实施方案中，放射可分1至5次施用。在一些实施方案中，放射可分1次、或2次、或3次、或4次、或5次施用。在一些实施方案中，放射可分1次或3次施用。
[0524]
在一些实施方案中，放射可以约1-5gy的分次剂量施用1-3次。在一些实施方案中，放射可以约5-10gy的分次剂量施用1-3次。在一些实施方案中，放射可以约10-15gy的分次剂量施用1-3次。在一些实施方案中，放射可以约15-20gy的分次剂量施用1-3次。在一些实施方案中，放射可以约5-10gy的分次剂量施用1-3次或以约15-20gy的分次剂量施用1-3次。在一些实施方案中，放射可以约8gy的分次剂量施用1次。在一些实施方案中，放射可以约8gy的分次剂量施用3次。在一些实施方案中，放射可以约16gy的分次剂量施用1次。在一些实施方案中，放射可以约8gy的分次剂量施用1次，或以约8gy的分次剂量施用3次，或以约16gy的分次剂量施用1次。
[0525]
另外，有可能将用本公开的化合物或本公开的组合剂进行的治疗与支持疗法组合：(i)施用针对各种感染性疾病的并发症的抗生素(例如，β-内酰胺类，诸如泛司博林(pansporin)等；大环内酯类，诸如克拉霉素等)；(ii)施用针对营养不良的改善的高热量输注、氨基酸制备剂或一般维生素制备剂；(iii)施用针对疼痛减轻的吗啡；(iv)施用针对改善副作用(诸如恶心、呕吐、厌食、腹泻、白细胞减少症、血小板减少症、血红蛋白浓度减小、脱发、肝病、肾病、dic、发热等)的药剂；以及(v)施用针对抑制癌症的多药耐药性等的药剂。
[0526]
实施例
[0527]
定义
[0528]
ab
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
抗体
[0529]
acn
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
乙腈
[0530]
ada
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
抗药物抗体
[0531]
adc
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
抗体药物缀合物
[0532]
blq
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
低于量化限
[0533]cꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
摄氏温度
[0534]
ccr2
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
c-c基序趋化因子受体2
[0535]
cr
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
完全反应
[0536]
cd
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
分化簇
[0537]
dar
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
药物抗体比率
[0538]
dma
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
n,n-二甲基乙酰胺
[0539]
dmso
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
二甲基亚砜
[0540]
dtt
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
二硫苏糖醇
[0541]
ε
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
消光系数
[0542]
e 0.1％
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.1％溶液消光系数
[0543]
ec
50
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
半数最大有效浓度
[0544]
edta
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
乙二胺四乙酸
[0545]hꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
小时
[0546]
hic
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
疏水相互作用色谱
[0547]
higg
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
人免疫球蛋白g
[0548]
hplc
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
高压液相色谱
[0549]
iacuc
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
实验动物护理和使用委员会
[0550]
ifn
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
干扰素
[0551]
igg
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
免疫球蛋白g
[0552]
igm
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
免疫球蛋白m
[0553]
il
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
白细胞介素
[0554]
ip
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
干扰素γ诱导的蛋白质
[0555]
lc
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
液相色谱
[0556]
lcms
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
液相色谱-质谱法
[0557]
μm
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
微摩尔
[0558]
mcp
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
单核细胞趋化蛋白
[0559]
mdsc
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
髓系来源的抑制细胞
[0560]
ml
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
毫升
[0561]
ms
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
质谱
[0562]
mtd
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
最大耐受剂量
[0563]
na
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
不适用
[0564]
oac
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
乙酸盐
[0565]
pbs
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
磷酸盐缓冲盐水
[0566]
peg
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
聚乙二醇
[0567]
qtof
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
四极杆飞行时间
[0568]
rt
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
室温
[0569]
sec
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
体积排阻色谱
[0570]
sting
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
干扰素基因的刺激物
sciex triple quad 4500esi质谱法进行lc/ms/ms分析。
[0589]
通常，在通过waters xselect c18 csh 3.5u 2.1mm id x 30mm柱之后，将5ul样品等分试样注入lc/ms/ms中。流动相a含有在水中的0.1％甲酸，并且流动相b含有在5％水和95％乙腈中的0.1％甲酸。总运行时间为在1.5ml/min下3min，其中线性梯度在1.5min流速内为100％ a至100％ b。最初，仪器在100％水性流动相溶剂下运行0.5min，并且然后在接下来的1.5min内使其增加至100％有机溶剂。
[0590]
制备型sec：
[0591]
在具有uv检测器的gilson制备型hplc系统上，使用sec柱(通常是ge superdex 200increase 10/300gl)，记录制备型sec纯化。流动相是1xpbs(ph 7.4)。典型的运行是以1ml/min的流速等度进行30min。基于uv阈值(以214和280nm)触发级分收集。
[0592]
adc浓度：
[0593]
在减去对应接头-有效载荷构建体的uv吸光度之后，由通过nanodrop(2000c；fisher scientific)系数测量的在280nm下的uv吸光度来计算adc浓度。
[0594]
表2列出了用于adc制备剂的接头-有效载荷构建体。化合物含有14号化合物(描述于wo2018/100558a2中)或化合物i-5c(描述于wo2019/092660中)作为有效载荷。接头-有效载荷的合成描述于pct申请pct/ib2020/054400中。
[0595]
表2
[0596]
[0597]
[0598][0599]
如us 7,473,421 b2中所述产生抗人ccr2单克隆抗体，其包含1d9小鼠单克隆抗体重链和轻链的人源化可变结构域以及人igg1重链和人κ轻链的恒定结构域(人源化1d9也称为tak-202，在下文也可称为higg1同种型)。人源化1d9的higg4同种型以类似于anticancer research 2006年3月-4月第26卷第2a期1057-1063中所描述的方法的方式制备。
[0600]
人源化1d9的序列
[0601]
重链：
[0602][0603]
轻链：
[0604][0605]
人源化1d9 higg4同种型的序列
[0606]
重链：
[0607][0608]
轻链：
[0609][0610]
实施例1
[0611]
经由随机半胱氨酸缀合来制备ab-sting激动剂缀合物的程序
[0612]
向抗ccr2抗体(人源化1d9，10mg/ml)在50mm组氨酸、125mm精氨酸和ph 6.1缓冲液中的溶液中添加tcep(在h2o中的1mm溶液，2-3当量)。反应混合物用氩气吹扫并在轻微振荡的情况下在rt或37℃下孵育1-3h。然后将所需接头-有效载荷构建体(在dma中的5mm溶液，6-9当量)缓慢添加至上述混合物中。反应物用氩气吹扫并在轻微振荡的情况下在rt或℃下再孵育1-2h。反应混合物按照本文所述的制备型sec方法进行纯化以得到adc。如分析方法中所述，分别通过uv吸光度、分析型sec和lc-qtof确定adc浓度、百分比聚集和dar。
[0613]
此程序的示意图示于图1中。
[0614]
使用上文所述的类似程序制备其他抗体缀合物。
[0615]
实施例2
[0616]
经由随机半胱氨酸缀合的额外ab-sting激动剂缀合物的制备
[0617]
使用示出为起始材料的接头-有效载荷构建体和抗体，如实施例1中所述制备表3中所列出的抗体药物缀合物。
[0618]
表3
[0619][0620][0621]
实施例3
[0622]
经由转谷氨酰胺酶缀合来制备ab-sting激动剂缀合物的程序
[0623]
去糖基化：将抗ccr2抗体(人源化1d9，如us 7,473,421 b2中所述产生，60mg/ml)在50mm组氨酸、125mm精氨酸、ph 6.1缓冲液中的溶液用等体积ph 7.2pbs稀释。向溶液中添加n-糖苷酶f(n-glycosydase f)(new england biolabs，p0704s，500,000单位/ml，每1mg抗体300单位)，并且将反应混合物加热至37℃，轻轻混合过夜。将所得去糖基化的人源化1d9用pbs ph 7.2进行缓冲液交换。
[0624]
转谷氨酰胺酶缀合：向上文所制备的去糖基化的人源化1d9的pbs溶液(10～20mg/ml)中添加胺-peg-叠氮化物的0.1m dmso溶液(40当量)，接着添加转谷氨酰胺酶(activa
tm
，ajinomoto，每1mg抗体5～10mg)。将反应混合物加热至37℃，轻轻混合过夜。产物按照本文所述的制备型sec方法进行纯化以得到人源化1d9-nh-peg-叠氮化物。
[0625]
应变促进的叠氮化物-炔烃环加成：向上文所制备的人源化1d9-nh-peg-叠氮化物缀合物(2～15mg/ml，于pbs中)的溶液中添加含有接头-有效载荷构建体的应变炔烃的4～10mm dmso溶液(3-5当量，其中dmso《总溶剂体积的10％)。将所得溶液在rt下轻轻搅拌过夜。产物按照本文所述的制备型sec方法进行纯化以得到adc。如分析方法中所述，分别通过uv吸光度、分析型sec和lc-qtof确定adc浓度、百分比聚集和dar。
[0626]
此程序的示意图示于图2中(rg＝n3)。使用上文所述的类似程序制备其他抗体缀合物。
[0627]
实施例4
[0628]
经由转谷氨酰胺酶缀合的ab-sting激动剂缀合物的制备
[0629]
使用表中示出为起始材料的起始接头-有效载荷构建体，如实施例3中所述制备表4中所列出的抗体药物缀合物。
[0630]
表4
[0631][0632]
实施例5
[0633]
经由转谷氨酰胺酶缀合来制备ab-sting激动剂缀合物的程序
[0634]
转谷氨酰胺酶缀合(修饰之后按照tumey,l.n.等人mol.pharmaceutics 2019,16,6,2795-2807中所描述的程序)：向转谷氨酰胺酶(activa
tm
，ajinomoto，每1mg抗体50mg)在ph 6.1磷酸盐缓冲液中的溶液中添加在pbs中的去糖基化的人源化1d9溶液(10～20mg/ml，按照实施例3中所描述的去糖基化程序制备)，接着添加在ph 6.1磷酸盐缓冲液中的30mm胱胺.2hcl(50当量)溶液。将反应混合物加热至37℃，轻轻混合过夜。使用hitrap protein a hp柱(ge healthcare，17-0402-01)，通过首先用20mm磷酸盐ph 7.0洗涤，并且然后用0.1m柠檬酸ph 4.0洗脱adc来纯化产物。根据本文所述的制备型sec方法进行进一步纯化以得到人源化1d9-nh-(ch2)
2-s-s-(ch2)
2-nh2。
[0635]
马来酰亚胺加成：在0℃下，向上文所制备的人源化1d9-nh-(ch2)
2-s-s-(ch2)
2-nh2缀合物溶液(2～15mg/ml在20mm ph 5nao ac缓冲液中)中添加在水中的5mm tppts溶液(5当量)。在0℃下，将所得溶液孵育过夜。通过渗析去除小分子之后，将溶液在0℃下再孵育24h。然后将所需接头-有效载荷构建体(于dma中的5mm溶液，2.05当量)缓慢添加至上述混合物中。将反应物在轻微振荡的情况下在0℃下孵育1.5-2h。反应混合物按照本文所述的制备型sec方法进行纯化以得到adc。如分析方法中所述，分别通过uv吸光度、分析型sec和lc-qtof确定adc浓度、百分比聚集和dar。
[0636]
此程序的示意图描绘于图2中(rg＝sh)。使用上文所述的类似程序制备其他抗体缀合物。
[0637]
实施例6
[0638]
经由转谷氨酰胺酶缀合的ab-sting激动剂缀合物的制备
[0639]
使用表中示出为起始材料的起始接头-有效载荷构建体，如实施例5中所述制备表5中所列出的抗体药物缀合物。
[0640]
表5
[0641][0642]
实施例7
[0643]
经由转谷氨酰胺酶缀合的ab-sting激动剂缀合物的制备
[0644]
向在pbs中的去糖基化的人源化1d9溶液(10～20mg/ml，按照实施例3中所描述的去糖基化程序制备)中添加1m tris、5m nacl ph8.0缓冲液(总体积的10～20％)，以将ph调节至8.0。向溶液中添加含伯胺的接头-有效载荷构建体(20当量)的10mm dmso溶液，接着添加转谷氨酰胺酶(activa
tm
，ajinomoto，每1mg抗体100-150mg)。将反应混合物加热至37℃，轻轻混合过夜。使用hitrap protein a hp柱(ge healthcare，17-0402-01)，通过首先用20mm磷酸盐ph 7.0洗涤，并且然后用0.1m柠檬酸ph 4.0洗脱adc来纯化产物。产物按照本文所述的制备型sec方法进行进一步纯化以得到adc。如分析方法中所述，分别通过uv吸光度、分析型sec和lc-qtof确定adc浓度、百分比聚集和dar。
[0645]
程序的示意图描绘于图3中。使用上文所述的类似程序制备其他抗体缀合物。
[0646]
实施例8
[0647]
经由转谷氨酰胺酶缀合的ab-sting激动剂缀合物的制备
[0648]
使用表中示出为起始材料的起始接头-有效载荷构建体，如实施例7中所述制备表6中所列出的抗体药物缀合物。
[0649]
表6
[0650][0651]
实施例9
[0652]
经由随机半胱氨酸缀合来制备小鼠ab-sting激动剂缀合物的程序
[0653]
向抗mccr2 mc-21抗体(universitaetsklinikum regensburg，regensburg，germany；描述于mack,m.等人j.immunol.2001,166,4697-4704和wo 2007/115713)(重链中具有l235a-g237a-e318a突变的migg2a)在25mm柠檬酸钠ph 5.5缓冲液(3.4mg/ml)中的溶液中添加0.5m tris、25mm edta ph 8溶液(总体积的10％)和tcep(在h2o中的10mm溶液，20当量)。反应混合物用氩气吹扫并在轻微振荡的情况下在37℃下孵育1.5h。反应混合物按照本文所述的制备型sec方法进行纯化。将纯化的还原抗体溶液冷却至4℃。添加在dmso中的脱氢抗坏血酸溶液(2mm，3当量，相对于还原抗体)，并且将所得混合物在4℃下储存过夜。将溶液升温至rt，然后缓慢添加所需接头-有效载荷构建体(在dma中的5mm溶液，7当量，相对于还原抗体)。将反应物在轻微振荡的情况下在rt下再孵育1.5-2h。反应混合物按照本文所述的制备型sec方法进行纯化以得到adc。如分析方法中所述，分别通过uv吸光度、分析型
sec和lc-qtof确定adc浓度、百分比聚集和dar。
[0654]
此程序的示意图描绘于图1中。
[0655]
实施例10
[0656]
经由随机半胱氨酸缀合的额外小鼠ab-sting激动剂缀合物的制备
[0657]
使用示出为起始材料的接头-有效载荷构建体和抗体，如实施例9中所述制备表7中所列出的抗体药物缀合物。
[0658]
表7
[0659][0660]
实施例11
[0661]
血浆稳定性测定条件
[0662]
将测试化合物以浓度10μg/ml添加至1ml血浆中，并且然后将5当量体积等分试样分配至2ml eppendorf微量离心管(标记0、24、48、72和96小时)中。对于0h时间点，将管立即储存在-80℃下，并且在适度振荡的情况下，将剩余管在37℃下孵育。将等分试样在其对应时间点从恒温箱中取出并在-80℃下储存。收集所有样品之后，将其在rt下解冻并放置在湿冰上。将50μl每个样品一式三份地分配至96孔微量滴定板中。用200μl冰冷的含有50nm内标的甲醇淬灭样品。将样品涡旋2min，然后以3000rpm离心10min。将185μl上清液转移至干净的注入板，然后在40℃、n2气体下干燥。将干燥的样品提取物用100μl lcms级水复原，然后涡旋1min，准备进行lc-ms/ms分析。
[0663]
通过反相hplc，使用synergi 2.5μpolar-rp 100a c18柱(2.0mm x 30mm)在40℃下使用由在水中的0.1％甲酸(溶剂a)和在乙腈中的0.1％甲酸(溶剂b)组成的梯度，分离每个样品。通过正离子喷雾，以多反应监测(mrm)模式，使用sciex api 4500qtrap仪器检测分析物。在不同时间点，人、灵长类动物和小鼠血浆中的有效载荷损失百分比报告于表8中。
[0664]
表8
[0665]
[0666]
实施例12
[0667]
thp1双lucia报告基因测定条件
[0668]
thp1-dual
tm ki-hsting-r232细胞(invivogen#thpd-r232)来源于人thp-1单核细胞细胞，其通过稳定双等位基因敲除内源性人haq sting基因并敲入人sting的r232变体来实现。在与五个ifn刺激反应元件(isre)缀合的isg54(干扰素刺激基因)最小启动子的控制下，这些细胞还稳定表达诱导型分泌型lucia荧光素酶报告基因。报告基因的表达允许通过评定lucia荧光素酶的活性来研究ifn调控因子(irf)途径。除人sting和荧光素酶之外，这些细胞还被工程改造以稳定表达人ccr2，从而实现irf途径的靶标介导的活化的研究。与过表达人ccr2的工程改造细胞相比，thp-1细胞以低得多的密度表达内源性人ccr2。因此，仍将空载体细胞用作阴性对照。
[0669]
实验当天，将细胞在生长培养基(rpmi 1640、2mm l-谷氨酰胺、25mm hepes、10％热灭活的胎牛血清、100μg/ml normocin
tm
、100u/ml-100μg/ml pen-strep、10μg/ml杀稻瘟菌素、100μg/ml吉欧霉素和1μg/ml嘌呤霉素)中铺板于白色384孔板(corning 356661)中，密度为每孔15,000个细胞/25μl。向细胞板中加入5μl hccr2靶向adc样品或化合物样品，并且然后在37℃下孵育20小时。孵育结束时，添加10μl/孔quanti-luc
tm
(invivogen#rep-qlc1)，并且立即使用leadseeker测量发光。
[0670]
针对上文所述的测定方法，相对于未处理和经对照处理的样品，计算在各种浓度下，每个测试adc或测试化合物的发光信号诱导百分比。拟合化合物浓度对信号诱导百分比曲线，以生成ec
50
值。本领域技术人员应理解，生成为ec
50
值的值受实验变异影响。观察到的ec
50
和emax报告于表9中。表9中的数据明确指示，14号化合物或化合物i-5c与人源化1d9或其igg4同种型的缀合在hccr2过表达thp1细胞系中大大增加体外效力。
[0671]
表9
[0672][0673][0674]
实施例13
[0675]
小鼠的药物动力学评估
[0676]
对于在初试balb/c小鼠中体内评估adc，使用6-8周龄的雌性balb/c小鼠(购自jackson laboratory)。根据实验动物护理和使用指南以及实验动物护理和使用委员会的规定，给小鼠饲喂正常饮食并圈养在spf动物设施中。使动物保持18-26℃的温度、50
±
20％的相对湿度以及12小时的间歇性明暗循环，其中随意供应食物和水。
[0677]
将adc注射至balb/c小鼠中之后，研究了adc的药物动力学。在不同时间点取得血清样品，并冷冻保存以供分析。
[0678]
通过在与sciex 6500qtrap质谱仪接口的shimadzu uhplc系统上进行基于2合1免疫捕获的lc/ms测定，测量小鼠血浆总抗体和缀合的有效载荷水平。简言之，将小鼠血浆样品在室温下与抗人igg包被的磁珠一起孵育45min，然后通过用pbst(ph 7.4pbs缓冲液，含有0.05％吐温20)和pbs缓冲液连续地洗涤磁珠来去除未特异性结合的蛋白质。之后，将裸抗体(dar＝0)和adc(dar≥1)从磁珠洗脱至0.1％三氟乙酸中。在中和洗脱液并添加在稳定同位素标记的内标之后，吸出一个等分试样的样品并用木瓜蛋白酶在37℃下消化1小时，然后用于缀合的有效载荷的lc/ms分析。剩余样品在70℃下进行胰蛋白酶/lys-c消化1小时，然后用于总抗体的lc/ms分析。
[0679]
在进行血浆蛋白质沉淀之后，通过lc/ms测量循环中的游离有效载荷。简言之，将小鼠血浆与8体积的含有稳定同位素标记的内标的甲醇混合，然后在40℃、温和氮气流下，将上清液蒸发至干。最终，将残余物在lc/ms级水中复原，之后进行lc/ms分析。
[0680]
adc-b14、adc-b15、adc-b16、adc-b17和adc-b18的pk概况总结于表10中。血浆pk的图形表示示于图4至图8中。
[0681]
表10
[0682][0683]
实施例14
[0684]
小鼠的耐受性评估
[0685]
在初试c57bl/6小鼠中评估adc的耐受性。在研究第0天，将动物称重，并且然后静脉内施用指定量adc(按有效载荷浓度计)。然后在给药后至少14天内定期对动物进行称重(每次测量之间不超过3天)，并且在每次测量之后，基于给药前起始重量，计算体重减轻。体重减轻大于20％或者濒死或以其他方式表现出超出研究的人道终点的痛苦迹象的任何动物均从研究移除，并根据iacuc协议内的指导进行安乐死。将最大耐受剂量(mtd)计算为无动物死亡或由于体重减轻大于20％或其他方面超出人道终点而需要从研究移除时的最高
剂量(按有效载荷浓度计)。adc-b17的mtd为200μg/kg(按有效载荷浓度计，图9)，并且adc-b20的mtd为250μg/kg(按有效载荷浓度计，图10)。
[0686]
实施例15
[0687]
小鼠的抗肿瘤活性评估
[0688]
在mc38(鼠结肠腺癌)荷瘤c57bl/6小鼠模型中评估adc-b21与14号化合物相比的功效。对于肿瘤植入，将1x106个mc38细胞皮下注射至c57bl/6小鼠中，并且随后监测小鼠的肿瘤生长。当肿瘤体积达到平均大约100mm3时，将动物按肿瘤体积随机化，并且静脉内给药100μl媒介物、2000μg/kg 14号化合物或50μg/kg adc-b21。将给药第一天视为研究第0天。在研究第3天和第6天再次给药14号化合物和媒介物，同时在研究第0天以单次施用的形式施用adc-b21。每周进行肿瘤体积和体重测量至少两次直至研究结束，并且移除与起始体重相比体重减轻大于20％或肿瘤体积超过2000mm3的动物。到研究第63天，化合物14治疗的动物总计6个中有1个有完全反应，相比于adc-b21治疗，其总计6个中有4个完全反应。
[0689]
观察到的抗肿瘤活性的图形表示示于图11中，其表明与单独有效载荷相比，抗ccr2 adc以低得多的剂量水平显著增强功效。
[0690]
实施例16
[0691]
非人灵长类动物的毒性/药效学评估
[0692]
在石蟹猕猴中的毒性研究中评估了2种adc变体。
[0693]
在静脉内施用0.15、0.5、1.5或5mg/kg adc-b2(2只猴/性别/组)(蛋白质剂量)的情况下进行单剂量研究。施用5mg/kg adc-b2与第2天两只动物的早期死亡相关，其归因于与以未缀合的有效载荷(14号化合物)进行的先前研究类似的肺毒性(临床征象为身体苍白粘膜减少和心音降低；以及组织学发现轻度肺血管充血和急性肺泡出血，其与肉眼可见的变红症、肺泡内水肿和纤维蛋白有关；肺泡巨噬细胞和嗜中性粒细胞浸润增加；以及在一只动物中，胸膜和心包积液)。这些早期死亡动物特有的其他发现存在于骨髓(造血细胞性降低、单细胞坏死和组织细胞增加)、肝(多灶性随机坏死病灶)和淋巴组织(脾和扁桃体中细胞性降低和/或生发中心坏死以及胸腺中单细胞坏死)中。一只早期死亡动物的一项临床病理学和细胞因子分析(其中样品可供使用)证明了促炎性/急性期反应以及ip-10、il-6、mcp 1和tnf-α细胞因子水平的升高(其与生存至最终安乐死的动物类似)。在生存至最终安乐死的动物中的组织学发现限于在≥1.5mg/kg下淋巴结增加的细胞性(由于淋巴细胞和组织细胞的增加)以及在5mg/kg下一只动物的淋巴结生发中心坏死。增加到研究中的药理学终点由评估单核细胞群体的流式细胞术组成，并且鉴定了在第1天：给药后6和24小时，经典型、中间型和非经典型单核细胞以及髓系来源的抑制细胞(mdsc)的相对百分比的剂量依赖性减小，到第1天：给药后48小时部分恢复。
[0694]
进行了重复剂量研究，其中计划以0.3、1或3mg/kg(蛋白质剂量)每2周静脉内施用adc-b17，总计3次剂量(2只猴/性别/组)；然而，由于3mg/kg剂量组有2只动物在第15天第二剂量之后早期死亡，所以第4组中剩余2只动物在第29天接受2mg/kg的减少剂量(第三次/最终剂量)。重复施用≥0.3mg/kg adc-b17与第15天之后在1个或多个时间点12只动物中有10只发展出抗药物抗体(ada)相关(信噪比增加1至3个数量级)，其主要针对adc的免疫刺激性有效载荷，其中在时程结束时也观察到一些ada朝向adc的抗体组分。在大多数ada阳性动物中，这些ada与第三剂量之后的暴露(cmax)下降相关。在≥1mg/kg下，观察到adc-b17相关早
期死亡。在第29天，给药后大约7小时，将一只在1mg/kg下的濒死动物安乐死。以3mg/kg，发现1只动物在第15天给药后大约6小时死亡，并且在第15天，给药后大约7小时，将1只濒死动物安乐死。这些动物死亡前的adc-b17相关临床征象包括皮肤(面部)发红、活动减少、驼背姿势、体重减轻、过度流涎、眼睛部分闭合、眼球凹陷、体温升高、心杂音以及/或者心率和/或呼吸率升高。死亡原因归因于被认为可能由于免疫原性/过敏性反应引起的免疫相关效应，但adc-b17的直接效应不能被排除。所有3只早期死者的血清化学发现与存活至最终安乐死的动物大体类似，并且与全身性促炎反应以及肌肉和/或肝细胞损伤一致。在第29天濒死而安乐死的动物中评估了血液学和凝血参数，但未对第15天的动物进行评估；淋巴细胞和嗜酸性粒细胞由于应激而减少最小并且凝血参数无变化。观察到的免疫分型变化与生存动物类似，如下文所述。第15天的早期死亡动物的大多数细微发现与生存至最终安乐死的动物类似但更严重，并且由最小干细胞坏死和与免疫介导的效应一致的全身发现(免疫细胞浸润于肝窦、肾上腺、肺间质和脾中；肺毛细血管的血栓形成；脾的坏死/纤维蛋白沉积；心肌变性；以及肾上腺和心外膜脂肪的微出血)组成。早期死者所特有的其他发现被认为是继发于应激或濒死状态(与胸腺重量减轻相关的胸腺细胞性降低和胰腺腺泡细胞变性)。在第29天濒死而安乐死的动物中，唯一的发现是肾上腺出血最少。
[0695]
在生存至最终安乐死的动物中，在第3天以≥0.3mg/kg观察到临床病理学发现，其由以下中的1种或多种的轻度至中度增加组成：天冬氨酸盐转氨酶、丙氨酸转氨酶、谷氨酸盐脱氢酶和肌酸激酶。这些发现与肌肉和/或肝细胞来源一致，并且缺乏明确的组织学相关性。第3天的其他发现与以下全身性促炎反应/急性期反应(球蛋白和c反应蛋白最少至轻度增加以及总蛋白质、白蛋白和白蛋白/球蛋白比率最少至轻度降低)一致，其在组织学上与多个组织中的炎性细胞浸润相关或与脱水(尿素、肌酐和磷轻度增加)相关而与组织学无关。这些变化中的每个到第30天部分至完全恢复。雄性在第14天和/或第30天的额外血清化学变化仅由球蛋白轻度增加和总胆红素轻度升高组成，这两者都与正在进行的急性期炎性反应一致。在第30天最终安乐死时，≥0.3mg/kg的个别动物的血液学和凝血发现由以下组成：白细胞计数、嗜中性粒细胞计数、纤维蛋白原和活化部分促凝血酶原激酶时间轻度增加以及红细胞计数、血红蛋白、血细胞比容轻度下降。这些发现与全身性促炎反应/急性期反应一致。
[0696]
血浆样品中单核细胞和mdsc的变化使用流式细胞术面板进行评估，其设计用于评估单核细胞和mdsc计数以及单核细胞上的ccr2、cd80和cd86表达。此评估的发现与预期药理学≥0.3mg/kg adc-b17一致，并且由以下组成：每次剂量之后经典型单核细胞、非经典型单核细胞和髓系来源的抑制细胞(mdsc)的绝对计数以剂量反应性轻度至中度减少，其在每次后续剂量之前恢复到或高于基线，如通过流式细胞术所测量。给药之后，经典型单核细胞的ccr2表达减少，所有剂量在后续剂量之前均恢复到基线附近(图12，上图)。另外，发现经典型单核细胞和mdsc中cd80的表达在每次剂量之后增加，并且然后在后续给药之前恢复到基线水平或低于基线水平(图12，分别为中间和底部)。
[0697]
还评估了血浆样品中细胞因子的变化，并且显示在≥0.3mg/kg adc-b17下由以下组成：血浆ip-10和mcp-1浓度(药理学的潜在生物标志物)的大幅度剂量无关性增加，其在给药后6小时达到峰值并在给药后24小时返回或趋于返回至基线值。观察到血清il-1ra、il-6、tnf-α和ifn-γ的额外升高，其在给药后6小时达到峰值并在给药后24小时或下一次
给药之前返回或趋于返回至基线值(图13)。
[0698]
在最终安乐死时，动物的组织学发现由以下组成：在≥0.3mg/kg下多灶性肝细胞坏死而与临床病理学无关。在≥1mg/kg时，骨髓中红细胞和髓系前体的细胞性最少至轻度减少(与血液学发现红细胞轻度减少和在1只动物中淋巴细胞显著减少有关)，在肾上腺和肝窦内零星观察到混合细胞浸润，脾红髓的细胞性(混合细胞)增加(其与脾重量轻度增加有关)，并且十二指肠或心脏的局灶性出血最少。这些具有炎性细胞浸润/出血的器官被认为可能是全身性促炎反应的一部分并且不被认为是直接的靶器官毒性。进行人igg、猴igg和igm、c3和/或c9的免疫组织化学以确定免疫复合物形成和组织沉积是否存在于免疫细胞浸润和/或组织损伤区域中。未检测到指示免疫复合物形成的颗粒沉积物。
[0699]
实施例17
[0700]
非人灵长类动物的药物动力学评估
[0701]
在不同时间点从实施例16中所述的给药adc-b17的非人灵长类动物取得血清样品，并且冷冻储存以供分析。通过在与sciex 6500+qtrap质谱仪接口的shimadzu uhplc系统上进行基于2合1免疫捕获的lc/ms测定，测量猴血浆总抗体和缀合的有效载荷水平。简言之，将猴血浆样品在室温下与抗独特型抗体包被的磁珠一起孵育60min，然后通过用pbs缓冲液洗涤磁珠三次来去除未特异性结合的蛋白质。之后，将裸抗体(dar＝0)和adc(dar≥1)从磁珠洗脱至0.1％三氟乙酸中。在中和洗脱液并掺入稳定同位素标记的内标之后，吸出一个等分试样的样品并用胰蛋白酶/lys-c在60℃下消化1小时，然后用于总抗体的lc/ms分析。剩余样品在37℃下进行木瓜蛋白酶消化1小时，然后用于缀合的有效载荷的lc/ms分析。
[0702]
在进行血浆蛋白质沉淀之后，通过lc/ms测量循环中的游离有效载荷。简言之，首先向猴血浆中掺入稳定同位素标记的14号化合物，接着使用甲醇进行蛋白质沉淀，然后在温和氮气流下将上清液蒸发至干。最后，将残余物用乙酸铵溶液复原，之后进行lc/ms分析。
[0703]
adc-b17的pk概况总结于表11中。血浆pk的图形表示示于图14中。
[0704]
表11
[0705][0706]
实施例18(预示)
[0707]
与pd-1/pd-l1抗体的组合疗法
[0708]
可在初试c57bl/6小鼠中评估adc与抗pd-1和/或抗pd-l1抗体的组合的耐受性。
[0709]
可使用的adc和抗pd-1/抗pd-l1组合示于表12中。
[0710]
表12
[0711][0712]
对于耐受性研究，如表12中所示的adc可以0.05mg/kg给药，并且抗pd-1和抗pd-l1抗体可以0.5、5或50mg/kg给药。由于抗pd-1抗体帕博利珠单抗不与啮齿动物pd-1交叉反应，所以小鼠将接受大鼠抗小鼠pd-1抗体j43和大鼠抗小鼠pd-l1抗体mih5，其各自以0.5、5和50mg/kg给药。
[0713]
在研究第0天，可将动物称重，并且然后静脉内施用指定量adc与指定量抗pd-1和/或抗pd-l1抗体的组合。然后将在给药后至少14天内定期对动物进行称重(每次测量之间不超过3天)，并且在每次测量之后，可基于给药前起始重量，计算体重减轻。体重减轻大于20％或者看起来濒死或以其他方式表现出超出研究的人道终点的痛苦迹象的任何动物都可从研究移除，并且根据iacuc协议内的指导进行安乐死。可将最大耐受剂量(mtd)计算为无动物死亡或由于体重减轻大于20％或其他方面超出人道终点而需要从研究移除时的最高剂量(按有效载荷浓度+pd-1/pd-l1抗体浓度计)。如果在adc和抗pd-1或抗pd-l1抗体的情况下达到令人满意的耐受性，则可以类似方式进行以adc与抗pd-1和抗pd-l1抗体的组合疗法。
[0714]
小鼠中的组合疗法的功效研究
[0715]
可在mc38(鼠结肠腺癌)荷瘤c57bl/6小鼠模型中测试如表12中所示的adc与抗pd-1抗体j43或抗pd-l1抗体mih5的组合的功效。对于肿瘤植入，可将1x106个mc38细胞皮下注射至c57bl/6小鼠中，并且随后可监测小鼠的肿瘤生长。当肿瘤体积达到平均大约100mm3时，可将动物按肿瘤体积随机化，并且静脉内给药100μl媒介物、50μg/kg的表12的相应adc以及0.5、5或50mg/kg的j43或者0.5、5或50mg/kg的mih5。可将给药第一天视为研究第0天。可每周进行肿瘤体积和体重测量至少两次直至研究结束，并且可从研究移除与起始体重相比体重减轻大于20％或肿瘤体积超过2000mm3的动物。可在研究第63天评估动物的完全和部分反应。如果在adc与抗pd-1或抗pd-l1抗体的组合的情况下未实现肿瘤体积的令人满意的减小，则可以类似方式进行以adc与抗pd-1和抗pd-l1抗体的组合疗法。
[0716]
非人灵长类动物中的组合疗法的功效研究
[0717]
可每2周(第1天至第29天)以0.3、0.5或1mg/kg(蛋白质剂量)向石蟹猕猴静脉内施用adc与抗pd-1抗体帕博利珠单抗或抗pd-l1抗体阿特珠单抗的组合，总计3次剂量(2只猴/
性别/组)。帕博利珠单抗可以0.5或15mg/kg给药，并且阿特珠单抗可以0.5或15mg/kg给药。可评估动物的血液学和凝血参数，一般血清化学，并且可在研究结束时进行组织学评定。
[0718]
如上文所述，可在不同时间点从非人灵长类动物取得血液样品，并且可通过在与sciex 6500+qtrap质谱仪接口的shimadzu uhplc系统上进行基于2合1免疫捕获的lc/ms测定，测量猴血浆总抗体和缀合的有效载荷水平。如上文所述，可在进行血浆蛋白质沉淀之后，通过lc/ms测量循环中的游离有效载荷。
[0719]
实施例19(预示)
[0720]
与放射的组合疗法
[0721]
耐受性研究
[0722]
可在初试c57bl/6小鼠中评估adc与抗pd-1和/或抗pd-l1抗体的组合的耐受性。
[0723]
可使用的adc、抗pd-1和/或抗pd-l1与放射的组合示于表13中。
[0724]
表13
[0725][0726][0727]
对于耐受性研究，adc可以0.05mg/kg给药，抗pd-1和抗pd-l1抗体可以0.5、5或50mg/kg给药，并且放射可以0.5gy和1gy给药。
[0728]
在研究第0天，可将动物称重，施用放射约5h，之后静脉内施用指定量adc与指定量抗pd-1j43和/或抗pd-l1 mih5抗体的组合。然后将在给药后至少14天内定期对动物进行称重(每次测量之间不超过3天)，并且在每次测量之后，可基于给药前起始重量，计算体重减轻。体重减轻大于20％或者看起来濒死或以其他方式表现出超出研究的人道终点的痛苦迹
象的任何动物都可从研究移除，并且根据iacuc协议内的指导进行安乐死。可将最大耐受剂量(mtd)计算为无动物死亡或由于体重减轻大于20％或其他方面超出人道终点而需要从研究移除时放射与治疗方案的组合的最高剂量。如果在adc、抗pd-1或抗pd-l1抗体和放射的情况下达到令人满意的耐受性，则可以类似方式进行以adc和抗pd-1和抗pd-l1抗体与放射的组合疗法。
[0729]
小鼠中与放射疗法的组合的功效研究
[0730]
可在mc38(鼠结肠腺癌)荷瘤c57bl/6小鼠模型中测试如表13中所示的adc与抗pd-1和/或抗pd-l1与放射的组合的功效。对于肿瘤植入，可将1x106个mc38细胞皮下注射至c57bl/6小鼠中，并且随后可监测小鼠的肿瘤生长。当肿瘤体积达到平均大约100mm3时，可将动物按肿瘤体积随机化，并且辐照0.5gy或1gy放射并静脉内给药100μl媒介物、50μg/kg的表13的相应adc以及0.5、5或50mg/kg的抗pd1抗体j43或者0.5、5或50mg/kg的抗pd-l1抗体mih5。可将给药第一天视为研究第0天。可每周进行肿瘤体积和体重测量至少两次直至研究结束，并且可从研究移除与起始体重相比体重减轻大于20％或肿瘤体积超过2000mm3的动物。可在研究第63天评估动物的完全和部分反应。如果在adc与放射和抗pd-1或抗pd-l1抗体的组合的情况下未实现肿瘤体积的令人满意的减小，则可以类似方式进行以adc与放射和抗pd-1和抗pd-l1抗体的组合疗法。
[0731]
非人灵长类动物中与放射疗法的组合的功效研究
[0732]
可在施用adc和抗pd-1和/或抗pd-l1抗体之前，用0.8gy和1.2gy治疗石蟹猕猴。可每2周(第1天至第29天)在放射疗法之后以0.3、0.5或1mg/kg(蛋白质剂量)向石蟹猕猴静脉内施用adc与抗pd-1抗体帕博利珠单抗或抗pd-l1抗体阿特珠单抗的组合，总计3次剂量(2只猴/性别/组)。帕博利珠单抗可以0.5或15mg/kg给药，并且阿特珠单抗可以0.5或15mg/kg给药。可评估动物的血液学和凝血参数，一般血清化学，并且可在研究结束时进行组织学评定。
[0733]
如上文所述，可在不同时间点从非人灵长类动物取得血液样品，并且可通过在与sciex 6500+qtrap质谱仪接口的shimadzu uhplc系统上进行基于2合1免疫捕获的lc/ms测定，测量猴血浆总抗体和缀合的有效载荷水平。如上文所述，可在进行血浆蛋白质沉淀之后，通过lc/ms测量循环中的游离有效载荷。可在动物中评定放射和髓外毒性之后的血液学恢复。
[0734]
应理解，具体实施方式部分意图用于解释权利要求，而发明内容和摘要部分不是。发明内容和摘要部分可阐述一个或多个但不是全部如发明人所考虑的本公开的示例性实施方案，并且因此，不意图以任何方式对本公开和所附权利要求进行限制。
[0735]
上文已借助说明指定功能的实现方式及其关系的功能性构成要素在来描述本公开。这些功能性构成要素的边界已为描述方便起见而在本文中任意地限定。可限定替代边界，只要适当地执行特定功能及其关系即可。
[0736]
特定实施方案的前文描述将充分地揭示本公开的一般特性，以使得其他人可通过应用本领域的知识，在无不当实验并且不背离本公开的一般概念的情况下，可容易地针对各种应用对此类特定实施方案进行修改和/或改适。因此，基于本文呈现的教导和指导，此类改适和修改意图处于所公开的实施方案的等效物的含义和范围内。应理解，本文的措辞或术语是出于描述而非限制的目的，以使得本说明书的术语或措辞应由本领域技术人员根
据教导和指导进行解释。
[0737]
本公开的广度和范围不应受限于任何上述示例性实施方案，而应仅根据以下权利要求及其等效物来限定。

技术特征：
1.一种式(i)化合物：或其药学上可接受的盐，其中：a为1至20的整数；ab是抗ccr2抗体、抗ccr2抗体片段或抗ccr2抗原结合片段；d是sting活性的调节剂，其包含鸟嘌呤碱基、鸟嘌呤碱基衍生物、腺嘌呤碱基或腺嘌呤碱基衍生物上的氨基；并且l是接头，其共价键合至ab；并且还共价键合至d上的所述氨基。2.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中d-l由式(ia)表示：其中：表示与ab的连接点；b为1至20的整数；m为0、1、2、3或4；n为0或1；每个r1独立地选自c
1-c4烷基、o-c
1-c4烷基和卤素；r2选自c
1-c4烷基和-(ch2ch2o)
s-ch3；其中s是1至10的整数；r3和r3'各自独立地选自氢和c
1-c3烷基；并且l1是可切割接头片段。3.如权利要求2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中：a为1至8的整数；b为1至10的整数；并且m为0。4.如权利要求2或3所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中：m为0；
n为0；并且r3和r3'各自是氢。5.如权利要求2至4中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中l1是其中：是与式(ia)的氮原子的连接点；是与ab的连接点；t为1至10的整数；w不存在或是自降解基团；z不存在或是2至5个氨基酸的肽；u和u'独立地不存在或是间隔物；并且q是异双官能团；限制条件是w和z均不存在。6.如权利要求5所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中w是选自以下的自降解基团
其中：是与羰基的连接点；并且是与z的连接点。7.如权利要求5或6所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中w是8.如权利要求5至7中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中w是9.如权利要求5至8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中z是能够被酶促切割的肽。10.如权利要求5至9中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中z是组织蛋白酶可切割的。11.如权利要求5至10中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中z是选自以下的两个氨基酸的肽：val-cit、cit-val、val-ala、ala-val、phe-lys和lys-phe。12.如权利要求5至11中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中z是ala-val或val-ala。13.如权利要求5至12中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中u'不存在且u选自
其中：是与z的连接点；是与q的连接点；p为1至6的整数；q为1至20的整数；x是o或-ch
2-；并且每个r独立地为0或1。14.如权利要求5至13中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中u'不存在且u是：15.如权利要求5至14中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中q是异双官能团，其与u'连接或当u'不存在时通过化学或酶介导的缀合来与ab连接。16.如权利要求5至15中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中q选自
其中是与u的连接点或当u不存在时是与z的连接点；并且是与u'的连接点或当u'不存在时是与ab的连接点。17.如权利要求5至16中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中q是：18.如权利要求5至17中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中t为1。19.如权利要求2至18中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中r2是-ch3，并且r3和r3'各自是氢。20.如权利要求1至19中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中a为2至6。21.如权利要求1至20中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中b为1。22.如权利要求1至21中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中调节sting活性的氨基取代的化合物是式(ii)化合物：
其中：x
10
是sh或oh；x
20
是sh或oh；y
a
是o、s或ch2；y
b
是o、s、nh或nr
a
，其中r
a
是c
1-c4烷基；r
10
是氢、氟、oh、nh2、or
b
或nhr
b
；r
20
是氢或氟；r
30
是氢；r
40
是氢、氟、oh、nh2、or
b
或nhr
b
；或r
30
和r
40
一起形成ch2o；r
50
是氢或氟；r
b
是c
1-c6烷基、卤代(c
1-c6)烷基或c
3-c6环烷基；环a
10
是含有1-4个选自n、o或s的杂原子的任选地取代的5或6元单环杂芳基环或含有1-5个选自n、o或s的杂原子的任选地取代的9或10元双环杂芳基环；其中环a
10
在环中包含至少一个n原子，并且其中y
b
与环a
10
的碳原子连接；并且环b
10
是含有2至5个选自n、o或s的杂原子的任选地取代的9或10元双环杂芳基环；其中环b
10
在环中包含至少两个n原子；限制条件是环a
10
或环b
10
通过氨基与式(i)中的
‘
l’连接。23.如权利要求1至22中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中调节sting活性的氨基取代的化合物是：其中是与式(i)中的
‘
l’的连接点。24.如权利要求1至21中任一项所述的化合物，其中调节sting活性的氨基取代的化合物是式(iii)化合物：或其药学上可接受的盐；其中x
10
是sh或oh；
x
20
是sh或oh；y
c
是o、s或ch2；y
d
是o、s或ch2；b
100
是由式(b
1-a)或式(b
1-b)表示的基团：r
13
、r
14
、r
15
、r
16
和r
17
各自独立地是氢原子或取代基；r
1000
是氢或与式(i)的羰基的键；y
11
、y
12
、y
13
、y
14
、y
15
和y
16
各自独立地是n或cr
1a
，其中r
1a
是氢或取代基；z
11
、z
12
、z
13
、z
14
、z
15
和z
16
各自独立地是n或c；r
105
是氢原子或取代基；b
200
是由式(b
2-a)或式(b
2-b)表示的基团：r
23
、r
24
、r
25
、r
26
和r
27
各自独立地是氢原子或取代基；r
100
'是氢或与式(i)的羰基的键；y
21
、y
22
、y
23
、y
24
、y
25
和y
26
各自独立地是n或cr
2a
，其中r
2a
是氢或取代基；z
21
、z
22
、z
23
、z
24
、z
25
和z
26
各自独立地是n或c；并且r
205
是氢原子或取代基；其中r
105
和r
205
各自独立地与其所分别连接的5元环的2或3位连接；限制条件是：b
100
或b
200
之一通过氨基与式(i)中的
‘
l’连接。25.如权利要求1至21和24中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中调节sting活性的氨基取代的化合物是式(iiia)化合物：
或其药学上可接受的盐；其中b
100
是由式(b
1-a)或式(b
1-b)表示的基团：r
13
、r
14
、r
15
、r
16
和r
17
各自独立地是氢原子或取代基；r
1000
是氢或与式(i)的羰基的键；y
11
、y
12
、y
13
、y
14
、y
15
和y
16
各自独立地是n或cr
1a
，其中r
1a
是氢或取代基；z
11
、z
12
、z
13
、z
14
、z
15
和z
16
各自独立地是n或c；r
105
是氢原子或取代基；b
200
是由式(b
2-a)或式(b
2-b)表示的基团：r
23
、r
24
、r
25
、r
26
和r
27
各自独立地是氢原子或取代基；r
100
'是氢或与式(i)的羰基的键；y
21
、y
22
、y
23
、y
24
、y
25
和y
26
各自独立地是n或cr
2a
，其中r
2a
是氢或取代基；z
21
、z
22
、z
23
、z
24
、z
25
和z
26
各自独立地是n或c；并且r
205
是氢原子或取代基；其中r
105
和r
205
各自独立地与其所分别连接的5元环的2或3位连接；
限制条件是：b
100
或b
200
之一是：其中：r
18
是氢或c
1-6
烷基；并且r
19
是卤素原子；并且另一者通过-nh-基团与式(i)中的
‘
l’基团连接。26.如权利要求1至21和24中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中调节sting活性的氨基取代的化合物是式(iv)化合物：或其药学上可接受的盐，其中：r1和r2各自独立地是羟基或卤素原子；b1是：r
18
是氢或c
1-6
烷基；r
19
是卤素原子；b2是：并且q2和q4各自独立地是氧原子或硫原子。27.如权利要求1至21和24至26中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中调节sting活性的氨基取代的化合物是：
或其药学上可接受的盐，其中是与l的连接点。28.如权利要求1至21和24至26中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其是式(vi)化合物：其中a为1至6的整数。29.如权利要求1至28中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中ab是结合人ccr2或其部分并且能够阻断趋化因子与ccr2的结合并抑制ccr2的功能的抗体或其片段。30.如权利要求29所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述抗体选自由以下组成的组：单克隆抗体1d9或可与1d9竞争结合人ccr2或ccr2的一部分的抗体；mc-21；sti-b020x；uniti-101和4.40a68g。31.如权利要求30所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述抗体是单克隆抗体1d9或可与1d9竞争结合人ccr2或ccr2的一部分的抗体。32.如权利要求1至31中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、小鼠抗体、大鼠抗体、山羊抗体或兔抗体。33.如权利要求31所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述抗ccr2抗体、抗ccr2抗体片段或抗ccr2抗原结合片段包含：轻链cdr1，其包含seq id no:1的氨基酸24-39；轻链cdr2，其包含seq id no:1的氨基酸55-61；轻链cdr3，其包含seq id no:1的氨基酸94-102；重链cdr1，其包含seq id no:2的氨基酸31-35；重链cdr2，其包含seq id no:2的氨基酸50-68；和重链cdr3，其包含seq id no:2的氨基酸101-106。34.如权利要求31所述的化合物或其药学上可接受的盐，所述抗ccr2抗体、抗ccr2抗体
1105、cbt-502、imc-001、rc-98、kl-a167、gr-1405、洛达利单抗、舒格利单抗、恩沃利单抗、欧可利单抗和加列夫利单抗。50.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用药学上可接受的量的如权利要求1至44中任一项所述的化合物。51.一种用于刺激有需要的受试者的免疫反应的方法，所述方法包括向所述受试者施用药学上可接受的量的如权利要求1至44中任一项所述的化合物。52.如权利要求50或51所述的方法，其还包括向所述受试者施用抗pd-1抗体。53.如权利要求50或51所述的方法，其还包括向所述受试者施用抗pd-ll抗体。54.如权利要求52所述的方法，其中所述抗pd-1抗体选自由以下组成的组：帕博利珠单抗、纳武单抗、西米普利单抗、皮米单抗、斯巴达珠单抗、卡瑞利珠单抗、信迪利单抗、替雷利珠单抗、特瑞普利单抗、多斯塔利单抗、埃本利单抗、incmga0012、amp-224、amp-514、sym-021、lzm-009、cs-1003、syn-125、gnr-051、mw-11、ty-101、bat-1306、f520、萨善利单抗、派安普利单抗、普特利单抗、cx-188、赛帕利单抗和特泊利单抗。55.如权利要求53所述的方法，其中所述抗pd-l1抗体选自由以下组成的组：阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗、柯希利单抗、msb-2311、zkab-001、faz-053、mdx-1105、cbt-502、imc-001、rc-98、kl-a167、gr-1405、洛达利单抗、舒格利单抗、恩沃利单抗、欧可利单抗和加列夫利单抗。56.如权利要求52-55中任一项所述的方法，其中所述抗pd-1抗体或所述抗pd-l1抗体与如权利要求1至44中任一项所述的化合物同时施用。57.如权利要求52-55中任一项所述的方法，其中所述抗pd-1抗体或所述抗pd-l1抗体与如权利要求1至44中任一项所述的化合物依序施用。58.如权利要求50-57中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用放射。59.如权利要求58所述的方法，其中所述放射是粒子放射。60.如权利要求58或59所述的方法，其中所述放射通过外部束放射来施用。

技术总结
本公开提供了包含STING调节剂的抗体药物缀合物。还提供了包含所述抗体药物缀合物的组合物。所述化合物和组合物可用于刺激有需要的受试者的免疫反应。受试者的免疫反应。


技术研发人员：徐鹤 H
受保护的技术使用者：武田药品工业株式会社
技术研发日：2021.11.09
技术公布日：2023/10/20