非环式苏氨醇核酸的制作方法

1.本发明涉及细胞膜透过性优异的非环式苏氨醇型核酸。
2.本技术要求以2021年3月3日在日本提出申请的日本特愿2021-033170号为基础的优先权，并在此引用其内容。


背景技术：

3.针对低分子医药无法靶向的蛋白质，如果能够利用免疫系统制作抗体，则也能够作为医药，因此抗体医药作为对癌、疑难杂症的治疗药优异。另外，抗体医药具有对靶分子的特异性高、副作用少这样的优点。但是，抗体医药难以通过细胞膜进入细胞内，因此，难以将细胞表面的分子以外作为靶分子。
4.作为抗体医药的下一代药物研发，正在研究使用寡核苷酸的核酸医药。核酸医药具有对靶分子的特异性高、副作用少这样的优点。但是，核酸医药与抗体医药同样地，细胞膜透过性低，难以到达存在于细胞内的靶分子。特别是由于sirna为双链，因此与反义rna相比，分子量和负电荷均大，细胞膜透过性比反义rna低，需要利用载体的药物递送。作为药物递送剂，已知有使用脂质纳米粒子的递送剂(专利文献1)、使用阳离子性聚合物纳米粒子的递送剂(专利文献2)。但是，从细胞膜透过性的效率、担心毒性的方面出发，多应该改善。
5.例如，已知具有多氟结构的化合物在生物体内稳定且毒性低，向细胞内的摄入和从核内体的脱离优异(非专利文献1)。报告了可以利用该性质，在基因的递送中使用肽树枝状大分子，该肽树枝状大分子使用将侧链的氨基进行全氟酰化而得的赖氨酸作为构成氨基酸(非专利文献2)。另外，也研究了向寡核苷酸、肽核酸导入多氟结构作为具有细胞膜透过能力的部分(专利文献3和非专利文献3～6)。
6.另一方面，由于核酸的磷酸二酯键容易受到核酸酶的分解，因此核酸医药还存在被给予生物体时的稳定性的课题。这是因为如果稳定性低，则在到达靶组织前在生物体内被分解，得不到目标药效。为了提高核酸的稳定性，使用了与人工核酸的嵌合核酸，该人工核酸的核酸酶耐性等比天然核酸优异。作为该人工核酸，例如，可举出非环式乙二醇核酸(gna)、肽核酸(pna)、非环式苏氨醇核酸(atna)和丝氨醇核酸(sna)等(非专利文献7)。
7.现有技术文献
8.专利文献
9.专利文献1：国际公开第2011/036557号
10.专利文献2：国际公开第2017/212006号
11.专利文献3：国际公开第2012/130941号
12.专利文献4：日本特开2006-321797号公报
13.专利文献5：国际公开第2000/056694号
14.非专利文献
15.非专利文献1：zhang et al.,mrs communications,2018,vol.8,p.303-313.
16.非专利文献2：cai et al.,acs applied materials and interfaces,2016,
vol.8,p.5821-5832.
17.非专利文献3：godeauet al.,medicinal chemistry communications,2010,vol.1.p.76-78.
18.非专利文献4：ellipilli et al.,chemical communications,2016,vol.52,p.521-524.
19.非专利文献5：rochambeaua et al.,polymer chemistry,2016,vol.7,p.4998-5003.
20.非专利文献6：metelev et al.,theranostics,2017,vol.7,p.3354-3368.
21.非专利文献7：murayama et al.,chemistry a european journal,2013,vol.19,p.14151-14158.


技术实现要素：

22.本发明的目的在于提供细胞膜透过性优异的核酸。
23.本发明人等发现通过向非环式苏氨醇型核酸(atna型核酸)的侧链导入可以被氟原子取代的烷基，细胞膜透过性提高，完成了本发明。
24.即，本发明如下。
25.[1]一种核酸，具有下述通式(a1)或(a2)表示的结构。
[0026][0027]
[式中，r0为被1个以上的氟原子取代的碳原子数1～30个的烷基、在被1个以上的氟原子取代的碳原子数2～30个的烷基的碳原子间具有1～5个醚键性的氧原子的基团、未被氟原子取代的碳原子数10～30个的烷基或在未被氟原子取代的碳原子数10～30个的烷基的碳原子间具有1～5个醚键性的氧原子的基团，n11和n12各自独立地为1以上的整数，b为核酸碱基，黑点表示键合位点]
[0028]
[2]根据上述[1]的核酸，其中，上述r0为被至少2个氟原子取代的碳原子数1～30个的烷基。
[0029]
[3]根据上述[2]的核酸，其中，上述r0为碳原子数1～10个的全氟烷基或在碳原子数1～10个的全氟烷基的碳原子间具有1～5个醚键性的氧原子的基团。
[0030]
[4]根据上述[1]的核酸，其中，上述r0为未被氟原子取代的碳原子数10～30个的烷基或在未被氟原子取代的碳原子数10～30个的烷基的碳原子间具有1～5个醚键性的氧原子的基团。
[0031]
[5]根据上述[1]～[4]中任一项的核酸，其中，n11或n12为5以上。
[0032]
[6]根据上述[1]～[5]中任一项的核酸，其为细胞膜透过性。
[0033]
[7]一种细胞膜透过剂，以上述[1]～[6]中任一项的核酸作为有效成分。
[0034]
[8]一种核酸医药，以上述[1]～[6]中任一项的核酸作为有效成分。
[0035]
本发明的核酸由于在atna型核酸的侧链导入了烷基，因此，细胞膜透过性优异。因此，可期待该核酸作为生理活性物质在医药领域中利用。
附图说明
[0036]
图1是表示实施例1中导入了各荧光素标记核酸的细胞的流式细胞术的结果的图。
[0037]
图2是表示实施例2中导入了各荧光素标记核酸的细胞的流式细胞术的结果的图。
[0038]
图3是表示实施例3中导入了各荧光素标记核酸的细胞的流式细胞术的结果的图。
[0039]
图4是表示实施例4中导入了各荧光素标记核酸的细胞的流式细胞术的结果的图。
[0040]
图5是表示实施例5中导入了各荧光素标记核酸的细胞的流式细胞术的结果的图。
[0041]
图6是表示实施例6中导入了各荧光素标记核酸的细胞的流式细胞术的结果的图。
具体实施方式
[0042]
本发明和本技术说明书中，“核酸”是指核苷酸进行磷酸二酯键合而成的分子。该核苷酸中不仅包括dna、rna这样的天然型核苷酸(天然存在的核苷酸)，也包括对天然型核苷酸进行改造并能够与天然型核苷酸进行磷酸二酯键合的人工核苷酸。对于人工核苷酸，可举出天然型核苷酸的侧链等被氨基等官能团修饰而成的人工核苷酸、核糖骨架的2’位的羟基被甲氧基、氟基、甲氧基乙基等取代的人工核苷酸、硫代磷酸酯型核苷酸(磷酸基的氧原子被取代为硫原子的核苷酸)、吗啉代(morpholino)型核苷酸(核糖、脱氧核糖被取代为吗啉环的核苷酸)、bna(桥联核酸，bridged nucleic acid)、hna(己糖醇核酸，hexitol nucleicacid)、lna(锁核酸，locked nucleic acid)、pna(肽核酸，peptide nucleic acid)、tna(苏糖核酸，threose nucleic acid)、gna(甘油核酸，glycerol nucleic acid)、cena(环己烯基核酸，cyclohexenyl nucleic acid)等。另外，“核酸”中也包括下述分子中的任一种：如dna、rna那样仅1种以上的天然型核苷酸进行磷酸二酯键合而成的分子、1种以上的天然型核苷酸与1种以上的人工核苷酸进行磷酸二酯键合而成的分子以及仅1种以上的人工核苷酸进行磷酸二酯键合而成的分子。
[0043]
本发明和本技术说明书中，“c
p1-p2”(p1和p2为满足p1＜p2的正整数)是指碳原子数为p1～p2的基团。
[0044]
本发明和本技术说明书中，“c
1-30
烷基”为碳原子数1～30的烷基，可以为直链，也可以为支链。“c
2-30
烷基”为碳原子数2～30的烷基，可以为直链，也可以为支链。作为c
1-30
烷基的例子，可举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、二十三烷基、二十四烷基、二十五烷基、二十六烷基、二十七烷基、二十八烷基、二十九烷基、三十烷基等。
[0045]
本发明和本技术说明书中，“c
1-20
烷基”为碳原子数1～20的烷基，可以为直链，也可以为支链。“c
2-20
烷基”为碳原子数2～20的烷基，可以为直链，也可以为支链。作为c
1-20
烷基的例子，可举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五
烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基等。
[0046]
本发明和本技术说明书中，“c
1-10
烷基”为碳原子数1～10的烷基，可以为直链，也可以为支链。“c
2-10
烷基”为碳原子数2～10的烷基，可以为直链，也可以为支链。作为c
1-10
烷基的例子，可举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等。
[0047]
本发明和本技术说明书中，“c
10-30
烷基”为碳原子数10～30的烷基，可以为直链，也可以为支链。作为c
10-30
烷基的例子，可举出十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、二十三烷基、二十四烷基、二十五烷基、二十六烷基、二十七烷基、二十八烷基、二十九烷基、三十烷基等。
[0048]
本发明和本技术说明书中，“c
1-6
烷基”为碳原子数1～6的烷基，可以为直链，也可以为支链。作为c
1-6
烷基的例子，可举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、己基等。
[0049]
本发明和本技术说明书中，“亚烷基”为从饱和烃除去2个氢原子而得的2价的基团，可以为直链，也可以为支链。作为亚烷基的例子，可举出亚甲基、亚乙基、三亚甲基、四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基、七亚甲基、八亚甲基、九亚甲基、甲基亚甲基、乙基亚甲基、甲基亚乙基、甲基亚丙基、乙基亚乙基、二甲基亚甲基、1,2-二甲基亚乙基、1,1-二甲基亚乙基、1-乙基亚丙基、2-乙基亚丙基、1,2-二甲基亚丙基、2,2-二甲基亚丙基、1-丙基亚丙基、2-丙基亚丙基、1-甲基-1-乙基亚丙基、1-甲基-2-乙基-亚丙基、1-乙基-2-甲基-亚丙基、2-甲基-2-乙基-亚丙基、1-甲基亚丁基、2-甲基亚丁基、3-甲基亚丁基、2-乙基亚丁基、1-甲基亚戊基、2-乙基亚戊基、1-甲基亚己基等。
[0050]
本发明和本技术说明书中，“c
1-20
全氟烷基”为碳原子数1～20的烷基的全部氢原子被取代为氟原子的基团。作为c
1-10
全氟烷基的例子，可举出全氟甲基、全氟乙基、全氟丙基、全氟异丙基、全氟丁基、全氟异丁基、全氟仲丁基、全氟叔丁基、全氟戊基、全氟异戊基、全氟新戊基、全氟叔戊基、全氟己基、全氟庚基、全氟辛基、全氟壬基、全氟癸基、全氟十一烷基、全氟十二烷基、全氟十三烷基、全氟十四烷基、全氟十五烷基、全氟十六烷基、全氟十七烷基、全氟十八烷基、全氟十九烷基、全氟二十烷基等。
[0051]
本发明和本技术说明书中，“全氟亚烷基”为亚烷基的全部氢原子被取代为氟原子的基团。作为全氟亚烷基的例子，可举出上述举出的亚烷基的全部氢原子被取代为氟原子的基团。
[0052]
本发明和本技术说明书中，“醚键性的氧原子”是指将碳原子间连接的氧原子，不包括氧原子彼此直列连接的氧原子。碳原子数nc(nc为2以上的整数)的烷基可具有的醚键性的氧原子最多为nc-1个。另外，“在碳原子间具有醚键性的氧原子的c
2-10
烷基”是指在c
2-10
烷基的碳原子间具有至少1个醚键性的氧原子的基团。以下，有时将具有醚键性的氧原子的烷基称为“含有醚键的烷基”。
[0053]
本发明和本技术说明书中，“在碳原子间具有醚键性的氧原子的c
2-10
全氟烷基”是在c
2-10
烷基的碳原子间具有至少1个醚键性的氧原子的含有醚键的c
2-10
烷基的全部氢原子被氟原子取代的基团。以下，将具有醚键性的氧原子的全氟烷基有时称为“含有醚键的全氟烷基”。
[0054]
本发明和本技术说明书中，“卤素原子”是指氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。“除氟原子以外的卤素原子”是指氯原子、溴原子或碘原子。作为“除氟原子以外的卤素原子”的例子，优选氯原子或溴原子，特别优选氯原子。
[0055]
另外，以下，“化合物(x)”是指式(x)表示的化合物。
[0056]
＜核酸＞
[0057]
本发明的核酸在atna型核酸的特定部位具有可以被氟原子取代的烷基。该核酸与其它人工核酸同样地，可期待作为生理活性物质在医药领域中利用。具体而言，本发明的核酸具有下述通式(a1)或(a2)表示的结构。应予说明，以下，“通式(a1)表示的结构”有时称为“结构(a1)”，“通式(a2)表示的结构”有时称为“结构(a2)”。
[0058][0059]
通式(a1)和(a2)中，r0为被至少1个氟原子取代的c
1-30
烷基(c
1-30
氟烷基)或未被氟原子取代的c
10-30
烷基。该烷基的碳原子数为2个以上时，该烷基可以在碳原子间具有1～5个醚键性的氧原子。本发明和本技术说明书中，“c
1-30
氟烷基(该烷基的碳原子数为2个以上时，该烷基可以在碳原子间具有1～5个醚键性的氧原子)”是指“在c
1-30
氟烷基或c
2-30
氟烷基的碳原子间具有1～5个醚键性的氧原子的基团”。
[0060]
r0为c
1-30
氟烷基时，键合于碳原子的1个以上的氢原子可以被除氟原子以外的卤素原子进一步取代。作为结构(a1)或结构(a2)，r0优选为被至少2个氟原子取代的c
1-30
氟烷基。其中，作为r0，优选为c
1-20
氟烷基，更优选为c
1-15
氟烷基，进一步优选为c
2-15
氟烷基，更进一步优选为c
6-10
氟烷基。r0为c
1-30
氟烷基时，取代为氟原子的氢原子的数量只要为1个以上就没有特别限定，例如，优选为3个以上，更优选为6个以上，进一步优选为7个以上。
[0061]
r0为c
1-30
氟烷基时，作为r0，具体而言，优选下述通式(f-1)或(f-2)表示的基团。在此，rf
p
为完全卤化c
1-20
烷基(c
1-20
烷基的氢原子全部被取代为卤素原子的基团)中具有1个以上的氟原子的基团。rf
p
为碳原子数2以上时，即，在完全卤化c
2-20
烷基的情况下，可以在碳原子间具有1～5个醚键性的氧原子。本发明和本技术说明书中，“可以在碳原子间具有1～5个醚键性的氧原子的完全卤化c
2-20
烷基”是指“完全卤化c
2-20
烷基或在完全卤化c
2-20
烷基的碳原子间具有1～5个醚键性的氧原子的基团”。
[0062]
通式(f-2)中，2个rf
p
可以为相互相同种类的基团，也可以为不同种类的基团。作为rf
p
，优选为c
1-20
全氟烷基(c
1-20
烷基的氢原子全部被取代为氟原子的基团)。
[0063]
下述通式(f-1)或(f-2)中，n1为0～10的整数，n2为0～9的整数。n1和n2为0时，均表示单键。即，n1为0时，通式(f-1)表示的基团为-rf
p
，n2为0时，通式(f-2)表示的基团为-ch(rf
p
)2。
[0064][0065]
r0为通式(f-1)表示的基团时，r0优选rf
p
为三氟甲基、五氟乙基、七氟丙基、九氟丁基、全氟戊基、全氟己基、全氟庚基、全氟辛基、全氟壬基或全氟癸基且n1为0～4的整数的基团，更优选rf
p
为三氟甲基、五氟乙基、七氟丙基、九氟丁基、全氟戊基、全氟己基、全氟庚基、全氟辛基、全氟壬基或全氟癸基且n1为0～2的整数的基团，进一步优选rf
p
为三氟甲基、五氟乙基、七氟丙基、九氟丁基、全氟戊基或全氟己基且n1为0～2的整数的基团(其中不包括n1为1且rf
p
为三氟甲基的基团)，更进一步优选rf
p
为五氟乙基、七氟丙基、九氟丁基、全氟戊基、全氟己基、全氟庚基、全氟辛基、全氟壬基或全氟癸基且n1为0的基团。
[0066]
r0为通式(f-2)表示的基团时，r0优选rf
p
为三氟甲基、五氟乙基、七氟丙基、九氟丁基、全氟戊基、全氟己基、全氟庚基、全氟辛基、全氟壬基或全氟癸基且n2为0～4的整数的基团，更优选rf
p
为三氟甲基、五氟乙基、七氟丙基、九氟丁基、全氟戊基、全氟己基、全氟庚基、全氟辛基、全氟壬基或全氟癸基且n2为0～2的整数的基团，进一步优选rf
p
为三氟甲基、五氟乙基、七氟丙基、九氟丁基、全氟戊基或全氟己基且n2为0～2的整数的基团(其中不包括n2为0或1且rf
p
为三氟甲基的基团)，更进一步优选rf
p
为五氟乙基、七氟丙基、九氟丁基、全氟戊基、全氟己基且n2为0的基团。
[0067]
r0为c
1-30
氟烷基时，作为r0，可举出三氟甲基、五氟乙基、七氟丙基、九氟丁基、全氟戊基、全氟己基、全氟庚基、全氟辛基、全氟壬基、全氟癸基、二氟甲基、1,1-二氟乙基、2,2-二氟乙基、1,1,2,2-四氟乙基、1,1,2,2,3,3-六氟丙基、1,1,2,3,3,3-六氟丙基、1,1,2,2,3,3-六氟己基、1,1,2,2,3,3-六氟辛基、1,1,2,2,3,3-六氟癸基、1,1,2,2,3,3-六氟十八烷基、1,1,2,2,3,3-六氟二十六烷基等。作为本发明的核酸，优选具有通式(a1)或(a2)中r0为c
1-30
全氟烷基的结构的核酸，更优选具有通式(a1)或(a2)中r0为c
1-20
全氟烷基的结构的核酸，更优选具有通式(a1)或(a2)中r0为c
1-10
全氟烷基的结构的核酸。
[0068]
r0为c
10-30
烷基时，作为结构(a1)或结构(a2)，r0优选为c
10-25
烷基，更优选为c
15-25
烷基，进一步优选为c
15-23
烷基。足够长的烷基与氟烷基同样地疏水性高，有助于具有结构(a1)或结构(a2)的核酸的细胞膜透过性。
[0069]
通式(a2)中，b为核酸碱基。作为核酸碱基，优选天然的核酸所具有的核酸碱基、与天然的核酸碱基结构类似的核酸碱基以及这些碱基受到各种修饰而成的修饰碱基。作为碱基的修饰，可举出烷基化、羟基化、烷氧基化、酰化、二氢化、氨基化、甲酰化、卤化等。作为与天然的核酸碱基结构类似的核酸碱基，可举出三唑、咪唑、氮杂嘧啶、氮杂嘌呤等。对于b的核酸碱基，具体而言，可举出腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、1-甲基腺嘌呤、n6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基胞嘧啶、1-甲基胸腺嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-羟基尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、二氢胸腺嘧啶、二氢胞嘧啶、2,6-二氨基腺嘌呤、2,6-二氨基鸟嘌呤、6-硫鸟嘌呤、2-硫腺嘌呤、2-硫胞嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-氟尿嘧
啶、5-碘尿嘧啶、5-卤代胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-三卤代甲基尿嘧啶、5-三氟甲基尿嘧啶、5-氮杂胸腺嘧啶、5-氮杂胞嘧啶、6-氮杂尿嘧啶、8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮尿嘧啶等。作为本发明的核酸，优选为具有通式(a2)中b为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶的结构的核酸。
[0070]
通式(a1)和(a2)中，n11和n12各自独立地为1以上的整数。n11和n12为各结构的每一分子的重复数，数越大，疏水性越高。由此，该核酸的细胞膜透过性变得更良好。作为本发明的核酸，n11和n12优选为2以上，更优选为5以上。另外，从容易获取与天然的双链核酸或单链核酸近似的结构的方面出发，n11和n12优选为10以下，更优选为8以下，进一步优选为6以下。n11和n12为2以上时，存在多个的结构(a1)或结构(a2)可以相互相同，也可以为不同的结构。
[0071]
通式(a1)和(a2)中，黑点表示键合位点。作为本发明的核酸，只要为具有结构(a1)或结构(a2)的核酸即可，导入结构(a1)或结构(a2)的位置没有特别限定，可以在不损害该核酸的功能的范围内导入到任一部位。例如，结构(a1)或结构(a2)可以直接或间接地键合于核酸的5’末端或3’末端，也可以导入到2个核苷酸之间。
[0072]
本发明的核酸中，作为在核酸的5’末端具有结构(a1)或结构(a2)的核酸，优选结构(a1)或结构(a2)的末端中的从碳原子延伸的键合位点与羟基键合，结构(a1)或结构(a2)的末端中的从磷酸基的氧原子延伸的键合位点与核酸的5’末端的糖键合。本发明的核酸中，作为在核酸的3’末端具有结构(a1)或结构(a2)的核酸，优选结构(a1)或结构(a2)的末端中的从碳原子延伸的键合位点与核酸的3’末端的磷酸基键合，结构(a1)或结构(a2)的末端中的从磷酸基的氧原子延伸的键合位点与氢原子键合。
[0073]
本发明的核酸中，作为将结构(a1)或结构(a2)导入到2个核苷酸之间的核酸，从更近似天然的核酸的结构的方面出发，优选结构(a1)或结构(a2)的末端中的从碳原子延伸的键合位点与其它核苷酸的磷酸基键合，结构(a1)或结构(a2)的末端中的从磷酸基的氧原子延伸的键合位点向其它核苷酸的糖键合。
[0074]
本发明的核酸在向atna型核酸导入疏水性高的r0基时，由于以结构(a1)或结构(a2)的形式导入，因此，例如在形成dna双螺旋结构时，r0基在螺旋结构的外侧露出，能够形成更稳定的双螺旋结构，而且能够利用在表面露出的r0基来改善细胞膜透过性。即，本发明的核酸作为细胞膜透过剂是有用的。此外，由于本发明的核酸在由核酸的磷酸基和糖的磷酸二酯键构成的链中不含氮原子，因此，例如通过亚磷酰胺法合成时的中间体较稳定，合成也容易。
[0075]
本发明的核酸中，导入结构(a1)或结构(a2)的核酸没有特别限定，可以为含有的核苷酸全部为天然型核苷酸的核酸，也可以为一部分或全部为人工核苷酸的核酸。另外，可以为单链核酸，也可以为双链核酸。作为该核酸，例如，可举出基因组dna、cdna、mrna、microrna、sirna、反义寡核苷酸、核酸适体、decoy核酸、cpg(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤)寡核苷酸等。另外，也可以为在细胞内表达靶基因或sirna的表达载体。
[0076]
本发明的核酸中，结构(a1)或结构(a2)可以通过各种偶联反应向导入该结构的对象的核酸导入。例如，通过将包含结构(a1)或结构(a2)的亚磷酰胺作为原料并进行亚磷酰胺法，能够容易地向核酸导入结构(a1)或结构(a2)。通用的核酸自动合成装置利用了亚磷酰胺法。因此，通过将包含结构(a1)或结构(a2)的亚磷酰胺作为原料，能够利用自动合成装
置容易地合成对各种碱基序列的核酸在期望的位置导入结构(a1)或结构(a2)的核酸。
[0077]
作为包含结构(a1)或结构(a2)的亚磷酰胺，例如，可举出一般用于核酸合成的亚磷酰胺中的介由结构(a1)将糖与磷酸基连接而成的化合物或将核苷部分替换成包含结构(a2)的有机基团的化合物。
[0078]
作为本发明的核酸，可以为仅具有结构(a1)或结构(a2)的核酸。这种情况下，结构(a1)或结构(a2)的两末端的键合位点与氢原子或羟基键合。
[0079]
所合成的目标核酸例如可以通过离子色谱、凝胶过滤色谱、反相色谱、正相色谱等各种方法进行分离、纯化。
[0080]
只要不损害导入结构(a1)或结构(a2)的核酸的功能且不损害本发明的效果，则可以对本发明的核酸进行各种修饰。作为该修饰，可举出糖链修饰、脂质修饰、肽修饰等。
[0081]
r0基的疏水性高，对细胞膜的亲和性高。因此，导入了含有r0基的结构(a1)或结构(a2)的本发明的核酸与未导入r0基的核酸相比，细胞膜透过性优异。利用该性质，本发明的核酸特别优选作为核酸医药的有效成分。例如，向通过被摄入到生物体内的靶细胞内而显示某些生理活性的功能性核酸以不损害其功能的方式导入结构(a1)或结构(a2)，由此能够改善该功能性核酸向靶细胞的摄入效率。例如，对于虽然具有药理活性但无法到达生物体内的靶细胞内的核酸，通过导入结构(a1)或结构(a2)，能够改善该核酸向靶细胞的摄入效率。即，通过使用本发明的核酸，能够简便地构建将核酸医药递送至细胞内的药物递送系统。
[0082]
实施例
[0083]
以下，通过实施例对本发明进行说明，但本发明不限于这些实施例。
[0084]
实施例、比较例的分析中使用的nmr装置为日本电子制jnm-ecz400s(400mhz)，1h nmr中使四甲基硅烷为0ppm的基准值，
19
f nmr中使c6f6为-162ppm的基准值。
[0085]
＜dna合成＞
[0086]
以下的实验中，dna合成使用市售的试剂、各种亚磷酰胺(乙腈溶液，0.1m)和作为活化剂的5-乙硫基-1h-四唑(乙腈溶液，0.25m)，利用nts h-8dna/rna合成仪(nihon techno service公司制)进行。
[0087]5’‑
atna-n[pfc8]修饰dna的合成如下进行。首先，进行的cpg固体支承柱(1μmole规格)中的dna合成(脱三苯甲基(trityl off))。接下来，在氮气氛下，使用注射器，将atna-n[pfc8]亚磷酰胺溶液(0.1m的乙腈溶液，300μl)与活化剂溶液(300μl)在cpg的存在下混合。其5分钟后，将混合而得到的溶液从柱中取出，在dna合成仪上进行dna链的加帽、氧化和解除封闭。
[0088]
所合成的5
’‑
atna-n[pfc8]修饰dna的脱保护如下进行。首先，将被cpg固体支承的dna(脱三苯甲基)在28％氢氧化铵水溶液中以50℃处理12小时。接下来，将该粗产物溶液从该固体支承体分离，减压下，在30℃浓缩。将得到的浓缩物在hplc纯化之前用0.45μm离心过滤器进行过滤。将得到的滤液用0.45μm离心过滤器进行过滤后，进行hplc纯化。将得到的溶液以260nm的吸光度进行定量。
[0089]
经脱保护的dna利用hplc进行纯化。hplc纯化在以下的条件下进行。
[0090]
溶剂(已0.45μm离心过滤器过滤)：100mm三乙基乙酸铵(teaa)缓冲液(ph 7.0)和乙腈(hplc级)
[0091]
洗脱梯度：3-95％乙腈(40分钟)
[0092]
柱：cosmosil填充柱“5c18-ms-ii”(4.6id
×
150nm，nacalai tesque公司制)
[0093]
针对各分析的供试样品：注射将粗dna溶解于20～50μl的超纯水而成的溶液。
[0094]
检测：一边监测260nm的吸光度一边使用二极管阵列检测器执行。
[0095]
＜细胞培养＞
[0096]
以下的实验中，细胞培养如下进行。
[0097]
hela细胞用添加了10％fbs和0.5％青霉素/链霉素的dulbecco改良eagle培养基(dmem，thermo fischer scientific公司制)，在37℃的加湿气氛(5容量％co2)下培养。用于图像解析的细胞在35mm的玻底培养皿(iwaki公司制)中培养。
[0098]
＜共聚焦显微镜观察＞
[0099]
以下的实验中，细胞的共聚焦显微镜观察如下进行。
[0100]
将结合有荧光素的核酸(500μm，5μl)添加到hela细胞中，在37℃孵育3小时。接下来，向该细胞中加入作为核染色剂的hoechst33342(2μg/ml，0.5ml)，进一步孵育1小时。从孵育后的各培养皿除去溶液，用pbs(-)清洗后，添加dmem(1ml)。接下来，将各培养皿设置于共聚焦激光扫描显微镜，利用488nm的激发波长和超过505nm的发光滤波器取得荧光图像。
[0101]
＜流式细胞术＞
[0102]
以下的实验中，流式细胞术如下进行。
[0103]
将hela细胞以成为105个/孔的方式接种于12孔板，进行培养。在接种的次日，将各孔的培养基换成含有结合有荧光素的核酸(2.5μm)的dmem培养基(1ml)，孵育4小时或24小时。其后，将孔中的细胞层用pbs清洗2次后，用0.05％(w/v)胰蛋白酶(200μl)在37℃处理5分钟将细胞剥离。回收的细胞悬浮于dmem(600μl)。将该细胞悬浮液通过离心分离处理(400
×
g，3分钟)进行分离，加入pbs/1％bsa(500μl)。用流式细胞仪(“guava easycyte8”，luminex公司制)分析该细胞悬浮液的荧光细胞的比例和平均荧光强度。
[0104]
[实施例1]
[0105]
合成具有r0为全氟辛基的结构(a1)的核酸，调查细胞膜透过性。
[0106]
具有r0为全氟辛基的结构(a1)的亚磷酰胺(atna-n[pfc8])如下合成。
[0107]
(1)亚磷酰胺缩合
[0108][0109]
使d-苏氨醇(0.95g，9mmol)在冰浴中溶解于干燥甲醇(10ml)，接着滴加加入十七氟壬酸乙酯(4.8g，9.9mmol，5ml的甲醇溶液)。在0℃搅拌2小时后，通过蒸发除去溶剂，得到目标中间体(n-(1,3-二羟基丁烷-2-基)壬酰胺)4.9g(收率99％)。
[0110]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.81(d,j＝6.9hz,1h),δ4.14-4.07(m,1h),δ4.02(t,j＝5.5hz,1h),δ3.95-3.88(m,1h),δ3.76-3.64(m,2h)
[0111]
19
f nmr(376mhz,cdcl3)δ-81.6(s,3f),δ-119.6(s,2f),δ-122.0(s,2f),δ-122.4
(s,2f),δ-112.8(s,2f),δ-123.4(s,2f),δ-126.8(s,2f)
[0112]
(2)dmtr保护
[0113][0114]
将包含中间体(n-(1,3-二羟基丁烷-2-基)壬酰胺)(1.8g，8.8mmol)和二异丙基乙胺(dipea)(1.7ml，1.4g，10.5mmol)的干燥吡啶溶液(20ml)在氮气下，在冰上冷却。接下来，向该混合物中加入包含4,4
’‑
二甲氧基三苯甲基氯(3.6g，10.5mmol)和4-二甲基氨基吡啶(0.16g，1.3mmol)的干燥二氯甲烷溶液(15ml)。将该混合物在室温下搅拌2.5小时后，除去溶剂，接着进行硅胶柱色谱(己烷：乙酸乙酯：et3n＝80：20：3(体积比))，得到经dmtr保护的中间体3.6g(7.2mmol)(收率60％)。
[0115]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.36-7.20(m,8h),δ7.06(d,j＝8.7hz,1h),δ3.78(s,6h),δ3.48(dd,j＝4.2hz,9.6hz,1h),δ3.28(dd,j＝3.7hz,9.8hz,1h),δ1.13(d,j＝6.4hz,3h)
[0116]
19
f nmr(376mhz,cdcl3)δ-80.6(s,3f),δ-118.8(dt,j＝271hz,14hz,1f),δ-119.7(dt,j＝272hz,14hz,1f),δ-121.3(s,2f),δ-121.7(s,2f),δ-122.2(s,2f),δ-122.6(s,2f),δ-126.0(s,2f)
[0117]
(3)亚磷酰胺化
[0118][0119]
在使3-((双(二异丙基氨基)磷烷基)氧基)丙腈(2.38g，7.9mmol)溶解于干燥乙腈而得的溶液中，在氩气下加入5-乙硫基四唑(ett)(1.03g，7.9mmol)，进一步一点点地加入经dmtr保护的中间体(4.5g、5.3mmol，溶解于2ml的四氢呋喃(thf)与10ml的乙腈的混合溶剂而成的溶液)。将得到的反应混合物在氩气下以室温持续搅拌14小时。使溶剂在减压下蒸发后，在氩气下，将得到的粗产物通过以脱气的己烷/乙酸乙酯(1：4(体积比))为流动相的柱色谱进行纯化。由此，分离出作为无色油的atna-n[pfc](收率28％)。
[0120]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.41-7.13(m,9h),δ6.84-6.79(m,4h),δ4.33-4.20(m,1h),δ4.14-4.07(m,1h),δ3.82-3.72(m,6h)δ3.63-3.43(m,4h)δ3.33-3.13(m,2h),δ2.57(t,6.4hz,1h),δ2.43-2.39(m,1h),δ1.27-1.08(m,12h),δ0.96(d,j＝6.9hz,3h)
[0121]
19
f nmr(376mhz,cdcl3)δ-80.6(m,2f),δ-118.8(dt,j＝278hz,13hz,1f),δ-119.8(dt,j＝272hz,13hz,1f),δ-121.3(s,2f),δ-121.7(s,2f),δ-122.1(s,2f),δ-122.6(s,2f)
31
p nmr(162mhz,cdcl 3
),δ-149.6(s),δ-148.5(s)
[0122]
使用合成的atna-n[pfc8]，如上所述，合成在天然型的单链dna即对照dna(序列号
1)的5’末端连接有5个下述所示的结构(atna-n1[pfc8]：式中，黑点表示键合位点)的核酸(atna-n5[pfc8])。
[0123][0124]
将在合成的atna-n5[pfc8]的3’端结合有荧光素的核酸(荧光素标记atna-n5[pfc8])导入hela细胞后，进行流式细胞术，基于荧光素的荧光强度对导入了荧光素标记核酸的细胞数和导入各细胞内的荧光素标记核酸的量进行定量。作为对照，对于在对照dna的3’端结合有荧光素的核酸(荧光素标记对照dna)也同样地在导入hela细胞后，进行流式细胞术，进行分析。
[0125]
将导入了荧光素标记对照dna的细胞的荧光强度设为1，将导入了各荧光素标记核酸的细胞的相对荧光强度([导入了荧光素标记核酸的细胞的荧光强度]/[导入了荧光素标记对照dna的细胞的荧光强度])示于表1。另外，将导入了荧光素标记对照dna的细胞和导入了荧光素标记atna-n5[pfc8]的细胞的流式细胞术的结果示于图1。图中，“none”表示未摄入dna的细胞的结果，“dna”表示导入了荧光素标记对照dna的细胞的结果，“atna-n5”表示导入了荧光素标记atna-n5[pfc8]的细胞的结果。
[0126]
[表1]
[0127][0128]
如表1所示，导入了荧光素标记atna-n5[pfc8]的细胞比导入了荧光素标记对照dna的细胞多将近2倍。另外，如图1所示，导入了荧光素标记atna-n5[pfc8]的细胞中，每1个细胞的荧光强度强的细胞多，向每1个细胞导入的荧光素标记核酸的量多。由这些结果可知atna-n5[pfc8]与对照dna相比，细胞膜透过性高。
[0129]
[实施例2]
[0130]
使实施例1中制造的荧光素标记atna-n5[pfc8]与由与对照dna互补的碱基排列(序列号2)构成的单链dna(对照rdna)杂交，制作在5’端具有结构(a1)的重复结构且在3’端结合有荧光素的荧光素标记双链dna(荧光素标记atna-n5[pfc8]/rdna)。同样地，制作荧光素标记对照dna与对照rdna杂交而成的荧光素标记双链dna(荧光素标记对照dna/rdna)。对于这些荧光素标记双链dna，与实施例1同样地在导入hela细胞后，进行流式细胞术，进行分析。
[0131]
将导入了各荧光素标记核酸的细胞的相对荧光强度(将导入了荧光素标记对照dna/rdna的细胞的荧光强度设为1)示于表2。另外，将导入了各荧光素标记核酸的细胞的流式细胞术的结果示于图2。图中，“none”表示未摄入dna的细胞的结果，“dna/rdna”表示导入了荧光素标记对照dna/rdna的细胞的结果，“atna-nf5”表示导入了荧光素标记atna-n5[pfc8]/rdna的细胞的结果。
[0132]
[表2]
[0133][0134]
如表2和图2所示，导入了荧光素标记atna-n5[pfc8]/rdna的细胞比导入了荧光素标记对照dna/rdna的细胞多。根据这些结果，确认了即便为双链dna，也与单链dna同样地，利用结构(a1)发挥改善细胞膜透过性的效果。
[0135]
[实施例3]
[0136]
合成具有r0为全氟辛基的结构(a2)的核酸。
[0137]
具有r0为全氟辛基的结构(a2)的亚磷酰胺(atna-c[pfc8])如下合成。
[0138][0139]
使(s)-garner醛(3.82g，7.0mmol)溶解于烘干的50ml容积双颈圆底烧瓶内的干燥醚(25ml)，接着添加c8f
17
i(1.76g，7.7mmol)，冷却至-78℃。接下来，用30分钟向该烧瓶中滴加醚中的meli(1.1m，7.7mmol，7ml的et2o溶液)后，将该反应混合物在-78℃搅拌4小时。其后，用饱和nh4cl将反应淬灭后，用et2o萃取产物。合并有机级分，用盐水清洗，用mgso4干燥后，在真空下除去溶剂。将得到的粗物质通过使用etoac/己烷(1：20(体积比))混合溶剂的色谱进行纯化，得到作为化合物1a与化合物1b的混合物的白色固体(收率：化合物1a为25％，化合物1b为21％)。
[0140]
化合物1a：
[0141]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ4.79(m,1h),4.46(m,1h),4.14(m,1h),4.01(dd,j＝10.0,5.0hz,1h),3.90(d,j＝9.6hz,1h),1.60(s,3h),1.49(m,12h)
[0142]
19
f nmr(376mhz,cdcl3)δ-80.9(s,3f),-118.8(d,j ff
＝289.0hz,1f),-121.5
‑‑
123.7(m,10f),-125.3
‑‑
127.1(m,2f),-127.5(d,j ff
＝283.2hz,1f)
[0143]
化合物1b：
[0144]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ4.60(m,1h),4.27(m,2h),4.03(m,1h),3.82(s)and 3.19(s)(1h),1.60(m,3h),1.46(m,12h)
[0145]
19
f nmr(376mhz,cdcl3)δ-80.9(s,3f),-119.6(d,j ff
＝283.2hz)and(d,j ff
＝283.2hz)(1f),-121.8
‑‑
123.7(m,10f),-125.4
‑‑
127.1(m,3f)
[0146][0147]
使化合物1b(1.69g，2.6mmol)溶解于空气中的100ml容积圆底烧瓶中的meoh(25ml)，冷却至0℃。接下来，向该烧瓶中加入对甲苯磺酸一水合物(49.5mg，0.26mmol)后，将该烧瓶内的反应混合物加热至室温，进一步搅拌17小时。其后，用饱和nahco3将反应淬灭后，用etoac萃取产物。合并有机级分，用盐水清洗，用mgso4干燥后，在真空下除去溶剂。将得到的粗物质通过使用etoac/己烷(1：2(体积比))混合溶剂的色谱进行纯化，以白色固体的形式得到目标化合物2b(收率47％)。
[0148]
化合物2b：
[0149]1h nmr(500mhz,丙酮-d6)δ6.13(d,j＝8.6hz,1h),5.58(d,j＝6.9hz,1h),4.52(d,j＝24.1hz,1h),4.18(m,1h),4.04(m,1h),3.92(m,1h),3.81(m,1h),1.41(s,9h)
[0150]
19
f nmr(470mhz,丙酮-d6)δ-81.6(s,3f),-118.7(d,j
ff
＝278.8hz,1f),-121.1
‑‑
123.8(m,10f),-125.4(d,j
ff
＝278.8hz,1f),-126.5(d,j
ff
＝264.1hz,1f),-127.0(d,j
ff
＝293.4,1f)
[0151]
使用化合物1a代替化合物1b，同样地得到化合物2a。
[0152]
化合物2a：
[0153]1h nmr(400mhz,丙酮-d6)δ5.67(dd,j＝16.9,8.2hz,1h),4.60(dt,j＝22.3,5.3hz,1h),4.20(t,j＝5.3hz,1h),4.03(m,1h),3.55(m,2h),.35(s,9h)
[0154]
19
f nmr(376mhz,丙酮-d6)δ-81.5(s,3f),-119.3(d,j
ff
＝286.1hz,1f),-121.1
‑‑
123.3(m,10f),-126.2(d,j
ff
＝300.5hz,1f),-126.8(d,j
ff
＝283.2hz,1f),-127.1(d,j
ff
＝289.0hz,1f)
[0155][0156]
使化合物2b(746mg，1.2mmol)溶解于200ml容积双颈圆底烧瓶内的干燥二氯甲烷(dcm)(10ml)，冷却至0℃。接下来，用10分钟向该烧瓶中滴加三氟乙酸(tfa)(0.94ml，12.2mmol)后，将该烧瓶内的反应混合物加热至室温，进一步搅拌18.5小时。其后，用饱和nahco3将反应淬灭后，用etoac萃取产物。合并有机级分，用盐水清洗，用mgso4干燥后，在真空下除去溶剂。将得到的粗物质通过使用etoac/己烷(1：2(体积比))混合溶剂的色谱进行纯化，以白色固体的形式得到目标化合物3b(收率98％)。
[0157]
化合物3b：
[0158]1h nmr(500mhz,丙酮-d6)δ5.68(s,1h),4.45(d,j＝23.5hz,1h),3.86(t,j＝10.9hz,1h),3.78(d,j＝8.0hz,1h),3.76(d,j＝7.5hz,1h)
[0159]
19
f nmr(470mhz,丙酮-d6)δ-81.6(s,3f),-118.6(d,j
ff
＝278.8hz,1f),-121.5
‑‑
123.9(m,10f),-124.9(d,j
ff
＝278.8hz,1f),-126.3(d,j
ff
＝293.4hz,1f),-127.0(d,j
ff
＝293.4hz,1f)
[0160]
使用化合物2a代替化合物2b，同样地得到化合物3a。
[0161]
化合物3a：
[0162]1h nmr(400mhz,丙酮-d6)异构体iδ4.25(dd,j＝23.8,6.9hz,1h),3.72(m,2h),3.55-3.44(m,1h)异构体iiδ4.07(dd,j＝24.9,2.5hz,1h),3.84(d,j＝4.1hz,1h),3.82(d,j＝4.6hz,1h),3.35(t,j＝6.6,1h)
[0163]
19
f nmr(376mhz,丙酮-d6)δ-81.7(s,3f),-120.2(d,j
ff
＝280.3hz,1f),-121.9
‑‑
123.3(m,10f),-126.1
‑‑
127.7(m,2f),-127.5(d,j
ff
＝283.2hz,1f)
[0164][0165]
使化合物3b(598mg，1.2mmol)溶解于25ml容积双颈圆底烧瓶内的干燥meoh(4ml)，冷却至0℃。接下来，用10分钟向该烧瓶中滴加三氟乙酸乙酯(287μl，340mg，2.4mmol)后，将该烧瓶内的反应混合物加热至室温，进一步搅拌35小时。其后，在真空下蒸发溶剂，将得到的白色油通过使用etoac/己烷(1：2(体积比))混合溶剂的色谱进行纯化，以白色固体的形式得到目标化合物4b(收率72％)。
[0166]
化合物4b：
[0167]1h nmr(400mhz,丙酮-d6)δ8.50(d,j＝8.7hz,1h),5.71(d,j＝8.2hz,1h),4.62(m,1h),4.43(m,1h),4.34(m,1h),3.98(m,1h),3.89(m,1h)
[0168]
19
f nmr(376mhz,丙酮-d6)δ-76.5(s,3f),-82.0(s,3f),-118.1(d,j＝283.2hz,1f),-120.9
‑‑
124.4(m,10f),-125.5(d,j＝283.2hz,1f),-126.9(d,j＝294.8hz,1f),-127.5(d,j＝289.0hz,1f)
[0169]
使用化合物3a代替化合物3b，同样地得到化合物4a。
[0170]
化合物4a：
[0171]1h nmr(400mhz,丙酮-d6)δ8.00(d,j＝8.7hz,1h),6.00(s,1h),4.73(dd,j＝21.3,3.9hz,1h),4.49(m,2h),3.69(m,2h)
[0172]
19
f nmr(376mhz,丙酮-d6)δ-76.4(s,3f),-81.6(s,3f),-118.9(d,j ff
＝283.2hz,1f),-121.3
‑‑
123.2(m,10f),-125.8
‑‑
127.5(m,3f)
[0173][0174]
使化合物4b(526mg，0.87mmol)在烘干的25ml容积双颈圆底烧瓶中溶解于干燥吡
啶(2ml)，冷却至0℃。接下来，向该烧瓶中加入dipea(167μl，124mg，0.96mmol)，用10分钟滴加4,4
’‑
二甲氧基三苯甲基氯(325mg，0.96mmol，3ml的干燥二氯甲烷溶液)和4-二甲基氨基吡啶(12.2mg，0.1mmol)后，将该烧瓶内的反应混合物加热至室温，进一步搅拌22小时。其后，在真空下蒸发溶剂，将得到的反应产物通过使用chcl3的色谱进行纯化，以黄色油的形式得到目标化合物5b(收率79％)。
[0175]
化合物5b：
[0176]1h nmr(400mhz,丙酮-d6)δ8.83(d,j＝8.7hz,1h),7.46-7.14(m,9h),6.87(dd,j＝8.9,2.3hz,4h),5.83(d,j＝8.7hz,1h),4.77-4.62(m,2h),3.76(s,6h),3.50(m,2h)
[0177]
19
f nmr(376mhz,丙酮-d6)δ-76.2(s,3f),-81.5(s,3f),-117.4(d,j
ff
＝289.0hz,1f),-120.5
‑‑
123.3(m,10f),-125.5(d,j
ff
＝289.0hz,1f),-126.2(d,j
ff
＝289.0hz,1f),-127.2(d,j
ff
＝289.0hz,1f)
[0178]
使用化合物4a代替化合物4b，同样地得到化合物5a。
[0179]
化合物5a：
[0180]1h nmr(500mhz,丙酮-d6)δ8.10(s,1h),7.41(d,j＝7.5hz,2h)7.29-7.13(m,7h),6.84(dd,j＝8.6,1.7hz,4h),5.94(s,1h),4.76(dd,j＝20.6,3.4hz,1h),4.70(s,1h),δ3.74(s,6h),δ3.34(m,2h)
[0181]
19
f nmr(376mhz,丙酮-d6)δ-76.2(s,3f),-81.5(s,3f),-119.0(d,j
ff
＝283.2hz,1f),-121.3
‑‑
123.2(m,10f),-125.8
‑‑
127.5(m,3f)
[0182][0183]
使化合物5b(623mg，0.68mmol)溶解于50ml容积圆底烧瓶中的乙醇(1.5ml)，加入28％的氨水(3ml)后，在室温下搅拌4天。接下来，在真空下使溶剂从该烧瓶内的反应产物中蒸发，通过使用chcl3/meoh(30：1(体积比))的色谱，以黄色油的形式得到目标化合物6b(收率80％)。
[0184]
化合物6b：
[0185]1h nmr(500mhz,丙酮-d6)δ7.49-7.19(m,9h),6.89(d,j＝8.0hz,4h),4.47(dd,j＝29.8,6.3hz,1h),4.05(m,1h),3.78(s,6h),3.58-3.48(m,2h)
[0186]
19
f nmr(376mhz,丙酮-d6)δ-81.6(s,3f),-119.0(d,j
ff
＝294.8hz,1f),-120.9
‑‑
124.2(m,10f),-125.7
‑‑
127.7(m,3f)
[0187]
使用化合物5a代替化合物5b，同样地得到化合物6a。
[0188]
化合物6a：
[0189]1h nmr(500mhz,丙酮-d6)δ7.44(d,j＝8.0hz,2h),7.32-7.20(m,7h),6.87(d,j＝9.2hz,4h),4.28(dd,j＝23.2,6.5hz,1h),3.86(m,1h),3.78(s,6h),3.40(dd,j＝10.0,4.2hz,1h),3.33(dd,j＝9.7,4.0hz 1h),2.80(s,2h)
[0190]
19
f nmr(470mhz,丙酮-d6)δ-81.5(s,3f),-121.4(d,j
ff
＝278.8hz,1f),-122.1
‑‑
123.9(m,10f),-125.9
‑‑
127.3(m,3f)
[0191][0192]
使化合物6b(332mg，0.41mmol)和胸腺嘧啶-1-乙酸(90mg，0.49mmol)溶解于25ml容积双颈圆底烧瓶内的干燥n,n-二甲基甲酰胺(dmf)(10ml)后，进一步向该烧瓶内加入干燥三乙胺(285μl，2.04mmol)和脱水缩合剂dmt-mm(cas no：3945-69-5)(170mg，0.61mmol)后，在室温下搅拌40小时。其后，用饱和nahco3将反应淬灭后，用chcl3萃取产物。合并有机级分，用盐水清洗，用mgso4干燥后，在真空下除去溶剂。将得到的粗物质通过使用chcl3/meoh(30：1(体积比))混合溶剂的色谱进行纯化，以黄色油的形式得到目标化合物7b(收率28％)。
[0193]
化合物7b：
[0194]1h nmr(400mhz,丙酮-d6)δ10.2(s,1h),8.02(m,h),7.49-7.20(m,10h),6.89(m,4h),4.59(m,1h),4.58(d,j＝16.0hz,1h),4.48(d,j＝16.0hz,1h),3.76(s,6h),3.56(m,2h),3.42(m,1h),1.80(d,j＝0.9hz,3h)
[0195]
19
f nmr(376mhz,丙酮-d6)δ-81.5(s,3f),-117.8(d,j
ff
＝294.8hz,1f),-120.9
‑‑
123.3(m,10f),-125.1(d,j
ff
＝283.2hz,1f),-126.2(d,j
ff
＝294.8hz,1f),-127.1(d,j
ff
＝289.0hz,1f)
[0196]
lrms(esi-tof):calcd for c
39h32f17
n3nao7[m+na]
+
:1000.19,found:999.87
[0197][0198]
使3-((双(二异丙基氨基)磷烷基)氧基)丙腈(57mg，0.19mmol)溶解于干燥乙腈。在氩气下向该溶液中加入ett(57mg，0.19mmol)后，进一步一点点地加入化合物7b(123mg、0.13mmol，溶解于0.6ml的thf与0.6ml的乙腈的混合溶剂而成的溶液)后，在室温下搅拌2天。其后，在真空下蒸发溶剂后，将得到的粗产物在氩气下通过使用etoac/己烷(1：1(体积比))的色谱和在大气下通过使用meoh/hcl 3
(1：100(体积比))的色谱进行纯化，得到作为黄色油的atna-c[pfc8](收率74％)。
[0199]1h nmr(500mhz,丙酮-d6)δ10.2(s,1h),7.95(d,j＝8.0hz,1h),7.49-7.21(m,10h),6.91-6.87(m,4h),4.84-4.47(m,3h),4.00-3.91(m,1h),3.78(s,6h),3.60-3.31(m,7h),2.93-2.67(m,2h),1.81(m,3h),1.31-1.00(m,12h)
[0200]
19
f nmr(470mhz,丙酮-d6)异构体i:δ-81.5(s,3f),-116.6(d,j
ff
＝278.8hz,1f),-120.0(d,j
ff
＝249.4hz,1f),-120.9
‑‑
123.8(m,10f),-126.3(d,j
ff
＝308.1hz,1f),δ-127.0(d,j
ff
＝293.4hz,1f)异构体ii:δ-81.5(s,3f),-117.8(d,j
ff
＝293.4hz,1f),-120.9
‑‑
123.8(m,10f),-125.1(d,j
ff
＝278.8hz,1f),-126.3(d,j
ff
＝308.1hz,1f),-127.0(d,j
ff
＝293.4hz,1f)
[0201]
31
p nmr(202mhz,丙酮-d6),异构体i:δ-154.2(s),异构体ii:δ-152.1(s)
[0202]
lrms(esi-tof)：calcd for c
48h49f17
n5nao8p[m+na]
+
:1200.29,found:1199.86
[0203]
使用合成的atna-c[pfc8]，如上所述，合成在作为天然型的dna的对照dna(序列号1)的5’末端连接有2或5个下述所示的结构(atna-c1[pfc8]：式中，黑点表示键合位点)的核酸(atna-c2[pfc8]，atna-c5[pfc8])。
[0204][0205]
将在合成的atna-c2[pfc8]和atna-c5[pfc8]的3’端结合有荧光素的核酸(荧光素标记atna-c2[pfc8]和荧光素标记atna-c5[pfc8])分别导入hela细胞后，进行流式细胞术，基于荧光素的荧光强度对导入了荧光素标记核酸的细胞数和导入各细胞内的荧光素标记核酸的量进行定量。作为对照，对于荧光素标记对照dna也同样地在导入hela细胞后，进行流式细胞术，进行分析。
[0206]
将导入了各荧光素标记核酸的细胞的相对荧光强度(将导入了荧光素标记对照dna的细胞的荧光强度设为1)示于表3。另外，将导入了各荧光素标记核酸的细胞的流式细胞术的结果示于图3。图中，“none”表示未摄入dna的细胞的结果，“dna”表示导入了荧光素标记对照dna的细胞的结果，“atna-c2”表示导入了荧光素标记atna-c2[pfc8]的细胞的结果，“atna-c5”表示导入了荧光素标记atna-c5[pfc8]的细胞的结果。
[0207]
[表3]
[0208][0209]
如表3和图3所示，可知导入了荧光素标记atna-c2[pfc8]和荧光素标记atna-c5[pfc8]的细胞比导入了荧光素标记对照dna的细胞多，它们比对照dna的细胞膜透过性高。另外，可知与荧光素标记atna-c2[pfc8]相比，导入了荧光素标记atna-c5[pfc8]的细胞数更多，细胞透过性更高。
[0210]
[实施例4]
[0211]
合成具有r0为十七烷基的结构(a1)的核酸，调查细胞膜透过性。
[0212]
具有r0为十七烷基的结构(a1)的亚磷酰胺(atna-n[hc17])如下合成。
[0213]
(1)亚磷酰胺缩合
[0214][0215]
在放入有干燥dmf(10ml)、干燥三乙胺(6.62ml，47.5mmol)和dmt-mm(3.94g，14.3mmol)的200ml容积双颈圆底烧瓶中放入d-苏氨醇(1g，9.5mmol)和硬脂酸(3.24g，11.4mmol)使其溶解。在室温下搅拌22小时后，用饱和nahco3将反应淬灭，用chcl3萃取产物。合并有机级分，用盐水清洗，用mgso4干燥后，在真空下除去溶剂。将得到的粗物质通过使用chcl3/meoh(20：1(体积比))混合溶剂的色谱进行纯化，以黄色油的形式得到目标中间体1(收率99％)。
[0216]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ6.20(d,j＝6.9hz,1h),δ4.21-4.17(m,1h),δ3.87-3.80(m,3h),δ2.76-2.62(m,2h),δ2.25(t,2h),δ1.37-1.25(m,33h),δ0.93-0.82(m,3h)
[0217]
(2)dmtr保护
[0218][0219]
在烘干的200ml容积双颈圆底烧瓶内，使中间体1(2.23g，6.0mmol)溶解于干燥吡啶(20ml)，冷却至0℃。接下来，向该混合物中添加二异丙基乙胺(1.15ml，6.6mmol)，进一步用10分钟滴加溶解于15ml的干燥二氯甲烷的4,4
’‑
二甲氧基三苯甲基氯(2.24g，6.6mmol)和4-二甲基氨基吡啶(80.6mg，0.66mmol)。将该混合物升温至室温后，搅拌24小时。其后，在真空下除去溶剂。将得到的粗物质通过使用etoac/己烷(1：4(体积比))混合溶剂的色谱进行纯化，得到作为经dmtr保护的中间体2的黄色油(收率：61％)。
[0220]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.37-7.19(m,9h),δ6.82(d,j＝9.2hz,4h),δ6.07(d,j＝8.7hz,1h),δ4.09-4.04(m,1h),δ3.94-3.90(m,1h),δ3.78(s,6h),δ3.42(dd,j＝4.1hz,9.6hz,1h),δ3.26(dd,j＝3.2hz,9.6hz,1h),δ3.10(d,j＝2.3hz,1h),δ2.21(t,j＝7.5hz,2h),δ1.30-1.20(m,30h),δ1.11(d,3h),δ0.87(t,j＝6.5hz,3h)
[0221]
(3)亚磷酰胺化
[0222]
[0223]
在氩气下向使3-((双(二异丙基氨基)磷烷基)氧基)丙腈(983mg，3.26mmol)溶解于干燥乙腈而得的溶液中加入ett(424mg，3.26mmol)，进一步一点点地加入经dmtr保护的中间体3(2.0g、2.97mmol，溶解于5ml的thf与10ml的乙腈的混合溶剂而成的溶液)。在氩气下，将得到的反应混合物在室温下持续搅拌14小时。在减压下使溶剂蒸发后，在氩气下，将得到的粗产物通过以己烷/乙酸乙酯(1：4(体积比))为流动相的柱色谱进行纯化。由此，分离出作为黄色油的atna-n[hc17](收率77％)。
[0224]1h nmr(400mhz,cdcl3)
[0225]
异构体i:δ7.41-7.18(m,9h),δ6.82-6.80(m,4h),δ5.75(d,1h),δ4.38-4.30(m,1h),δ4.22-4.16(m,1h)δ3.77(m,6h)δ3.61-3.40(m,4h)δ3.22-3.09(m,2h),δ2.43-2.26(m,2h),δ2.19-2.12(m,2h),δ1.28-1.11(m,45h),δ0.86(d,j＝6.9hz,3h)
[0226]
异构体ii:δ7.39(d,2h),δ7.29-7.16(m,7h),δ6.80(dd,j＝1.4hz,8.70hz,4h),δ5.59(d,j＝8.7hz,1h),δ4.25-4.14(m,2h),δ3.77(m,6h)δ3.68-3.64(m,1h),δ3.50-3.44(m,2h),δ3.21(dd,j＝6.4hz,9.2hz,1h),δ3.21(dd,j＝6.9hz,9.2hz,1h),δ2.57(t,2h),δ2.17-2.14(m,2h),δ1.30-1.19(m,33h),δ1.10(d,j＝6.9hz,6h),δ0.97(d,j＝6.9hz,6h),δ0.86(d,j＝6.6hz,3h)
[0227]
使用合成的atna-n[hc17]，如上所述，合成在作为天然型的dna的对照dna(序列号1)的5’末端连接有1或2个下述所示的结构(atna-n1[hc17]：式中，黑点表示键合位点)的核酸(atna-n1[hc17]和atna-n2[hc17])。
[0228][0229]
将在合成的atna-n1[hc17]和atna-n2[hc17]的3’端结合有荧光素的核酸(荧光素标记atna-n1[hc17]]和荧光素标记atna-n2[hc17]])导入hela细胞。具体而言，通过对以每孔成为104个的方式接种于96孔板的hela细胞，更换成含有荧光素标记的核酸(2.5μm)的dmem培养基(1ml)，孵育4小时而进行。其后，与上述同样地进行流式细胞术，基于荧光素的荧光强度对导入细胞内的荧光素标记atna-n1[hc17]等的量进行定量。作为对照，将在对照dna的3’端结合有荧光素的核酸(荧光素标记对照dna)同样地在导入hela细胞后，进行流式细胞术，对导入细胞内的核酸量进行定量。
[0230]
将导入了荧光素标记对照dna的细胞的荧光强度设为1，将导入了荧光素标记atna-n1[hc17]的细胞的相对荧光强度和导入了荧光素标记atna-n2[hc17]的细胞的相对荧光强度示于表3。另外，将导入了荧光素标记对照dna的细胞和导入了荧光素标记核酸的细胞的流式细胞术的结果示于图3。图中，“none”表示未摄入dna的细胞的结果，“dna”表示导入了荧光素标记对照dna的细胞的结果，“atna-nh1”表示导入了荧光素标记atna-n1[hc17]的细胞的结果，“atna-nh2”表示导入了荧光素标记atna-n2[hc17]的细胞的结果。
[0231]
[表4]
[0232][0233]
如表4和图4所示，导入了荧光素标记atna-n1[hc17]和荧光素标记atna-n2[hc17]的细胞比导入了荧光素标记对照dna的细胞多。另外，与荧光素标记atna-n1[hc17]相比，导入了荧光素标记atna-n2[hc17]的细胞数多。根据这些结果，可知atna-n1[hc17]和atna-n2[hc17]均比对照dna的细胞膜透过性高，另外，导入核酸的结构(a1)的重复数越多，越容易导入细胞内。
[0234]
[实施例5]
[0235]
使实施例4中制造的荧光素标记atna-n1[hc17]与对照rdna杂交，制作在5’端具有结构(a1)的重复结构且在3’端结合有荧光素的荧光素标记双链dna(荧光素标记atna-n1[hc17]/rdna)。同样地，使实施例4中制造的荧光素标记atna-n2[hc17]与对照rdna杂交，制作荧光素标记双链dna(荧光素标记atna-n2[hc17]/rdna)。对于这些荧光素标记双链dna和实施例2中使用的荧光素标记对照dna/rdna，与实施例1同样地，在导入hela细胞后，进行流式细胞术，进行分析。
[0236]
将导入了各荧光素标记核酸的细胞的相对荧光强度(将导入了荧光素标记对照dna/rdna的细胞的荧光强度设为1)示于表5。另外，将导入了各荧光素标记核酸的细胞的流式细胞术的结果示于图5。图中，“none”表示未摄入dna的细胞的结果，“dna/rdna”表示导入了荧光素标记对照dna/rdna的细胞的结果，“atna-n1/rdna”表示导入了荧光素标记atna-n1[hc17]/rdna的细胞的结果，“atna-n2/rdna”表示导入了荧光素标记atna-n2[hc17]/rdna的细胞的结果。
[0237]
[表5]
[0238][0239]
如表5和图5所示，导入了荧光素标记atna-n1[hc17]/rdna和荧光素标记atna-n2[hc17]/rdna的细胞比导入了荧光素标记对照dna/rdna的细胞多。根据这些结果，确认了即便为双链dna，也与单链dna同样地，利用结构(a1)发挥改善细胞膜透过性的效果。
[0240]
[实施例6]
[0241]
合成具有r0为通式(f-1)表示的基团中的n1为2且rf
p
为全氟己基的结构(a1)的核酸。
[0242]
具有r0为通式(f-1)表示的基团中的n1为2且rf
p
为全氟己基的结构(a1)的亚磷酰胺(atna-n[fc8])如下合成。
[0243]
(1)亚磷酰胺缩合
[0244][0245]
使溶解于10ml的dmf的化合物8(0.44g，0.82mmol)、pybop(0.43g，0.82mmol)和dipea(0.4ml，2.2当量)在氩气下溶解于15ml的dmf，加入4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,9-十三氟壬酸(0.23g，0.59mmol，0.7当量)而制备反应溶液。将得到的反应溶液在室温下搅拌14小时。其后，将反应混合物用水(45ml)淬灭，用己烷/乙酸乙酯(4：1(体积比))萃取2次。合并有机级分，用水清洗，用na2so4干燥后，过滤，在真空下除去溶剂。将得到的粗产物通过硅胶柱色谱(己烷：乙酸乙酯：et3n＝30：20：1(体积比))纯化，得到化合物9(0.17g，0.22mmol，收率38％)。
[0246]
化合物9：
[0247]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.39-7.21(m,9h),6.84(d,j＝5.9hz,4h),6.06(d,j＝9.1hz,1h),4.13-4.10(m,1h),3.92-3.90(m,1h),3.78(s,6h),3.41(dd,j＝11.2,5.7hz,1h),3.33(dd,j＝9.6,3.2hz,1h),2.90(s,1h),2.53-2.44(m,4h),1.12(d,j＝6.4hz,3h).
[0248]
19
f nmr(376mhz,cdcl3)δ-80.7(s,3f),-114.4(s,2f),-121.8(s,2f),-122.8(s,2f),-123.4(s,2f),-126.0(s,2f).
[0249]
(2)dmtr保护
[0250][0251]
在氩气下，向使2-氰乙基n,n,n’,n
’‑
四异丙基亚磷酰二胺(93mg，0.31mmol)和ett(40mg，0.31mmol)溶解于干燥乙腈(8ml)而得的溶液中滴加加入溶解于thf/乙腈(2ml/2ml)混合溶剂的化合物9(160mg，0.20mmol)。将该反应混合物在室温下搅拌24小时后，将溶剂在减压下蒸发。在氩气下，将得到的粗产物通过以脱气的己烷/乙酸乙酯(3：1(体积比))为流动相的硅胶柱色谱进行纯化。由此，分离出作为无色油的化合物10(经dmtr保护的atna-n[fc8])(收率38％)。
[0252]
化合物10：
[0253]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.41-7.20(m,9h),6.82-6.79(m,4h),5.94(d,9.1hz,1h),4.37-4.32(m,1h),4.20-4.14(m,1h),3.77(s,6h),3.55-3.45(m,4h),3.25-3.12(m,2h),2.59-2.31(m,6h),1.24-0.97(m,15h).
[0254]
19
f nmr(376mhz,cdcl3)δ-80.7(s,3f),-114.5(s,2f),-121.8(s,2f),-122.8(s,2f),-123.4(s,2f),-126.0(s,2f).
[0255]
使用合成的atna-n[fc8]，如上所述，合成在作为天然型的dna的对照dna(序列号1)的5’末端连接有1～5个下述所示的结构(atna-n1[fc8]：式中，黑点表示键合位点)的核
酸(atna-n1[fc8]～atna-n5[fc8])。
[0256][0257]
将在合成的atna-n1[fc8]～atna-n5[fc8]的3’端结合有荧光素的核酸(荧光素标记atna-n1[fc8]]～荧光素标记atna-n5[fc8]])导入hela细胞。具体而言，通过对以每孔成为104个的方式接种于96孔板的hela细胞，更换成含有荧光素标记的核酸(2.0μm)的dmem培养基(100μl)，孵育4小时而进行。其后，与上述同样地进行流式细胞术，基于荧光素的荧光强度对导入细胞内的荧光素标记atna-n1[fc8]等的量进行定量。作为对照，将在对照dna的3’端结合有荧光素的核酸(荧光素标记对照dna)同样地在导入hela细胞后，进行流式细胞术，对导入细胞内的核酸量进行定量。此外，作为其他比较对象，对于hela细胞，更换成将以核酸(荧光素标记对照dna)的浓度成为10μm的方式制备脂质体(lipofectamine)的溶液使用dmem培养基稀释10倍而成的培养基(100μm)，孵育4小时而进行。其后，与上述同样地进行流式细胞术，基于荧光素的荧光强度对导入细胞内的核酸量进行定量。
[0258]
将导入了荧光素标记对照dna的细胞的荧光强度设为1，将导入了荧光素标记atna-n1[fc8]的细胞的相对荧光强度到导入了荧光素标记atna-n5[fc8]的细胞的相对荧光强度示于表6。另外，将导入了荧光素标记对照dna的细胞和导入了荧光素标记核酸的细胞的流式细胞术的结果示于图6。图中，“none”表示未摄入dna的细胞的结果，“dna”表示导入了荧光素标记对照dna的细胞的结果，“脂质体”表示利用脂质体导入了核酸的细胞。“atna-ncf1”表示导入了荧光素标记atna-n1[fc8]的细胞的结果，“atna-ncf2”表示导入了荧光素标记atna-n2[fc8]的细胞的结果，“atna-ncf3”表示导入了荧光素标记atna-n3[fc8]的细胞的结果，“atna-ncf4”表示导入了荧光素标记atna-n4[fc8]的细胞的结果，“atna-ncf5”表示导入了荧光素标记atna-n5[fc8]的细胞的结果。
[0259]
[表6]
[0260][0261]
如表6和图6所示，导入了荧光素标记atna-n1[fc8]～荧光素标记atna-n5[fc8]的细胞比导入了荧光素标记对照dna的细胞多。另外，与荧光素标记atna-n1[fc8]相比，导入了荧光素标记atna-n4[fc8]的细胞数多。根据这些结果，可知atna-n1[fc8]～atna-n5[fc8]的细胞膜透过性虽然均比脂质体差，但比对照dna高，另外，存在导入核酸的结构(a1)
的重复数越多，越容易导入细胞内的趋势。
[0262]
产业上的可利用性
[0263]
本发明提供含有疏水性高的基团、即可以被氟原子取代的c
1-30
烷基的atna型核酸。本发明的核酸的细胞膜透过性优异，因此可期待作为例如将药效成分导入靶细胞的载体等生理活性物质在医药领域中利用。

技术特征：
1.一种核酸，具有下述通式(a1)或(a2)表示的结构，式中，r0为被1个以上的氟原子取代的碳原子数1～30个的烷基、在被1个以上的氟原子取代的碳原子数2～30个的烷基的碳原子间具有1～5个醚键性的氧原子的基团、未被氟原子取代的碳原子数10～30个的烷基或在未被氟原子取代的碳原子数10～30个的烷基的碳原子间具有1～5个醚键性的氧原子的基团，n11和n12各自独立地为1以上的整数，b为核酸碱基，黑点表示键合位点。2.根据权利要求1所述的核酸，其中，所述r0为被至少2个氟原子取代的碳原子数1～30个的烷基。3.根据权利要求2所述的核酸，其中，所述r0为碳原子数1～10个的全氟烷基或在碳原子数1～10个的全氟烷基的碳原子间具有1～5个醚键性的氧原子的基团。4.根据权利要求1所述的核酸，其中，所述r0为未被氟原子取代的碳原子数10～30个的烷基或在未被氟原子取代的碳原子数10～30个的烷基的碳原子间具有1～5个醚键性的氧原子的基团。5.根据权利要求1～4中任一项所述的核酸，其中，n11或n12为5以上。6.根据权利要求1～5中任一项所述的核酸，其为细胞膜透过性。7.一种细胞膜透过剂，以权利要求1～6中任一项所述的核酸作为有效成分。8.一种核酸医药，以权利要求1～6中任一项所述的核酸作为有效成分。

技术总结
本发明提供细胞膜透过性优异的核酸。本发明涉及具有下述通式(A1)或(A2)[式中，R0为被1个以上的氟原子取代的碳原子数1～30个的烷基、在被1个以上的氟原子取代的碳原子数2～30个的烷基的碳原子间具有1～5个醚键性的氧原子的基团、未被氟原子取代的碳原子数10～30个的烷基或在未被氟原子取代的碳原子数10～30个的烷基的碳原子间具有1～5个醚键性的氧原子的基团，n11和n12各自独立地为1以上的整数，B为核酸碱基，黑点表示键合位点]表示的结构的核酸、以上述核酸作为有效成分的细胞膜透过剂、以及以上述核酸作为有效成分的核酸医药。以及以上述核酸作为有效成分的核酸医药。以及以上述核酸作为有效成分的核酸医药。


技术研发人员：冈添隆 相川光介 渡边微香 冈本晃充 森广邦彦 影山泰一
受保护的技术使用者：AGC株式会社
技术研发日：2022.03.03
技术公布日：2023/10/20